The authors would like to acknowledge Natalie Doude and David Westerway (University of Alberta) for providing us Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) for plasmid construction, Michel Br&#233;mont (INRA) for providing us BL21Sol bacteria; Christine Longin (INRA) for TEM assistance and Edith Pajot-Augy (INRA) for comments and proofreading.

プラスミドとShadoo式の1世代注：遺伝子をコードするネズミShadooタンパク質（Shadoo 25から122）を 、発現ベクターpET-28 11にサブクローニングしました。このクローンは大腸菌に形質転換しました大腸菌 SoluBL21細菌株、11前述したように、N末端 ​​ヘキサヒスチジンタグ、（HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG）でShadooタンパク質を発現します。プラスミドは、作者から要求することができます。そのアミノ酸配列から算出Shadooの分子量は12,243.2ダあります。 注意：板状流フードの下や近くにブンゼン炎に細菌を持つすべての操作を実行します。 <ol><li>標準の熱ショックプロトコルを使用して、PET-28-Hisの6 -Shadooプラスミドで有能SoluBL21菌を変換します。プラスミドの1〜5μlのこのミックスのために（通常は10 PGに100チューブ中の細菌を50μlにNG）。 45秒間、42℃で熱ショックを実行します。 </li><li>培養物は、40 mg / mlのカナマイシン（ 図1B）を補充したルリア-ベルターニ培地中で0.5〜0.7の600まで37℃で細菌を形質転換しました。 </li><li>培養物に、240 / mlのイソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド、ITPGを加えることによってShadoo発現O / Nを誘導します。 37℃で150rpmで振とうしながら培養菌。注意：一般的に、細菌培養は3 O / Nの600に達しました 。 注：形質転換された細菌は、将来のタンパク質産生のために-80℃で保存することができます。このために、細菌培養物のアリコートに10％を50％（v / v）の滅菌グリセロールを添加し、-80℃で、それらを凍結します。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig1.jpg" /> Shadoo発現構築物の図1のスキーム、Shadoo発現の細菌形質転換および誘導（ステップ1で説明したように）。 </stroNG&gt;（A）Shadooための発現構築物は、タンパク質、NtとのN末端 ​​に融合したヘキサヒスチジンタグをコードします。スキームはShadooタンパク質がC末端（CT）、続いて基本的なアルギニン/グリシン反復（緑シリンダ）、疎水性ドメイン（HD）、および単一のN-グリコシル化部位（CHO）を含むことを示します。 （B）をpET-28-Hisの6 -Shadooプラスミドを42℃で45秒間熱ショックによってSoluBL21の細菌に形質転換されます。形質転換された細菌は、40 / mlのカナマイシンを含む選択寒天上にプレーティングされています。プレートからの単一コロニーを、1000〜3000 mlの振盪フラスコ培養を接種するために使用されます。組換えタンパク質の発現は、1 mMのIPTGで誘導される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 低圧液体クロマトグラフィーによるShadooタンパク質の2精製（LPLC） <ol><li>細胞溶解とはclusionの体の準備<ol><li>細菌懸濁液を収集し、遠心分離管（ 図2）にそれを転送します。 </li><li> 4℃で20分間、2,500×gでスピン。細胞培養500mlの由来各ペレットのために15ミリリットルバッファー（50 mMトリス、10mMのEDTA、抗プロテアーゼカクテルでpH8）にペレットを再懸濁し、デカンテーションにより上澄み液を除去します。 注：再懸濁したペレットを凍結し、数日間-20℃で保存することができます。凍結は、細菌細胞の溶解を容易にします。 </li><li> SDS-PAGE分析し、クーマシー染色によって、粗製細菌ペレットを用いた組換えタンパク質の過剰発現を確認してください。 <ol><li>このために、細胞をペレット化するために遠心分離機の細菌培養1ミリリットル。 100μlのLaemmliの変性溶液を加える（277.8 mMのトリス-HCl、pH6.8の、4.4％SDSを、44.4％W / Vのグリセロール、0.02％ブロモフェノールブルー）で5分間100℃でペレットを加熱します。 </li><li> 12％アクリルアミドゲルに負荷10μlのサンプルを、実行し、SDS-PAGEおよびVISUアリゼは、クマシー染色によりタンパク質を分離しました。 </li></ol></li><li> ）2.1.2から完全に再懸濁したペレットに0.5％の最終濃度になるように、トリトンX-100を追加します。 </li><li> 30分間37℃の水浴中で懸濁液をインキュベートします。 </li><li>細菌細胞を溶解する氷冷水で6-12ミクロンのピーク・ツー・ピーク振幅を5分間懸濁液を超音波処理します。 </li><li>転送は、クリーン50ミリリットル遠心チューブにサスペンションを超音波処理しました。 </li><li> 4℃で15分間、15,000×gで遠心分離管。 </li><li>デカンテーションにより上清を除去し、チューブ当たり結合バッファー（20 mMトリス - 塩酸緩衝液、pH 7.4、0.5 MのNaCl、8M尿素、5mMのイミダゾール）の5ミリリットルを追加します。 </li><li>回転ホイールのO / Nの上に置いてチューブが完全に封入体からタンパク質を再懸濁します。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig2.jpg" /> インクルージョンの精製図2のスキームShadoo体を発現する（ステップ2.1に記載のように）形質転換された細菌を遠心分離により回収し、溶解緩衝液中に再懸濁します。懸濁液を37℃で30分間インキュベートし、次いで機械的に、細菌細胞を破壊するために超音波処理されます。超音波処理は、サンプルの加熱を防止するために氷の上で行われます。壊れた細胞を遠心分離により回収し、封入体からタンパク質を可溶化する8 M尿素を含む緩衝液中に再懸濁されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </li><li>ニッケル2+ -アフィニティークロマトグラフィー 注：クロマトグラフィーは、5 mlのキレートセファロースカラム（ 図3A）はNi 2+ -charged用いてFPLCシステム上で実行されます。全ての溶液は、1ml /分の流速でカラム上にロードされます。 <ol><li>それを充電するためにセファロースカラムに0.2 MのNiSO 4水溶液を10mlを注入Ni 2+ -イオンを持ちます。 </li><li>イミダゾールの低濃度（20 mMトリス-塩酸緩衝液、pH 7.4、0.5 MのNaCl、8M尿素、5mMのイミダゾール）を含む結合緩衝液の30-50 mlのを注入したNi ​​2+ -イオンを充填したカラムを平衡化します。 </li><li> 50ミリリットル注入ループと尿素可溶化したタンパク質をロードします。 </li><li>完全に非結合タンパク質の最大値を除去するために10 mlの低イミダゾール結合緩衝液（20mMのTris-HCl緩衝液、pH 7.4、0.5 MのNaCl、8M尿素、5mMのイミダゾール）でカラムを洗浄することにより、フロースルー画分を回収カラムから。 </li><li>非特異的にカラムに結合したタンパク質を溶出するために、洗浄緩衝液（20mMのTris-HCl、pH7.4の、0.5MのNaCl、8M尿素、80 mMイミダゾール）50〜mlのカラムを洗浄。 </li><li> 20 mMトリス - 塩酸、pH7.4の、0.5MのNaCl、8M尿素を含有する緩衝液中で80から800 mMのイミダゾールの15分の直線勾配を適用します。勾配適用中に1mlの画分を収集します。注意：Hisタグ - タンパク質は、ウィットに溶出されます（競争相手として使用される）、イミダゾール含有緩衝液の勾配ヘクタール。 </li><li> （2.1.3.1を参照）各画分の8μlのアリコートを取り、4μlの4倍レムリ変性溶液を加えます。 5分間、100℃での熱溶液。 </li><li> 12％アクリルアミドゲルに負荷タンパク質サイズマーカー10μlの各サンプルを10μl、実行SDS-PAGEおよびクーマシー染色によって分離したタンパク質を可視化します。注意：計算されたShadooの分子量は、そのアミノ酸配列は12,243.2ダで形成します。 </li><li> Shadooを含む全ての画分をプール。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig3.jpg" /> 図3 の精製手順（工程2.2から2.4に記載のように）。 （A）のNi 2+ -イオンはポリヒスチジンタグ融合タンパク質の選択的な精製を可能にするヒスチジン残基によって調整することができます。イミダゾールを介して、タンパク質を溶出するために使用されますニッケル2+ -イオンとの調整と結合したタンパク質を置換する能力。（B）サイズ排除カラム上に分離されている-カラムのNi 2+に保持された様々な流体力学的半径のタンパク質。タンパク質は、最も小さいものに最大から溶出される。（C）使用前に、Shadooを含有する画分をプールし、尿素、イミダゾールおよび塩を除去するために脱塩されます。品質管理アッセイは、SDS-PAGE /クマシー染色、ウエスタンブロッティングを含みます。精製Shadooは、凍結乾燥することができます。 -20℃で保存した場合凍結乾燥Shadooはヶ月間安定である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> </li><li>サイズ排除クロマトグラフィー 注：第二の精製工程は、第1の精製工程の間に他のタンパク質を同時溶出Shadooからタンパク質を分離するサイズ排除クロマトグラフィーからなります（ 図3B）。 <ol><li> 1.5ml /分の流速で、20mMのトリス塩酸緩衝液、pH 7.4、0.5 MのNaCl、8M尿素を250mlを注入することによって、総床体積120 mlとスーパーデックスカラムを平衡化。 </li><li>ロード平衡化したカラムに2.2.9からShadooを含む画分をプールしました。上記緩衝液の一定流量に応じて40ミリリットルのカラム空隙容量後に1mlの画分を収集します。 </li><li>各画分の10μlアリコートを取り、上記のようにShadooを含有する画分を見つけるために、SDS-PAGE分析およびクマシー染色を行います。 </li><li> Shadooを含むプール画分。 </li></ol></li><li>脱塩 注意：脱塩手順は、さらに生物物理学的および生化学的研究（ 図3C）のために適切な緩衝液中の組換えShadooタンパク質を得るために、塩、イミダゾールおよび尿素を除去します。同様の結果は、緩衝液に対して試料を透析することによって得ることができます。 <ol><li> 150ミリリットルと53ミリリットルの脱塩カラムを平衡化/ minで5 mlの流速で10mMの酢酸アンモニウム緩衝液、pH 5の。 </li><li>ロードは、列にShadoo画分をプールしました。酢酸アンモニウム緩衝液の注入時に手動でUV検出器の出力で280nmでの信号の増加を示す画分を収集します。 </li><li>凍結乾燥脱塩Shadooを、-20℃で保管してください。 </li><li>そのような使用前に10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5、などの適切な緩衝液中で凍結乾燥Shadooを溶解します。 注：ポリヒスチジンタグ、エンテロキナーゼを用いて除去することができます。 </li></ol></li></ol>生理的pHでのアミロイド線維にShadoo のインビトロ組立3. 注意：自発的にShadooのタンパク質凝集体とは、pH≥7 11で原線維を形成しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig4.jpg" /> descriとしてアミロイド線維にリフォールディングShadooの 図4. スキーム（ステップ3のベッド）酸 ​​性溶液では、pH≥7の緩衝液に溶解したとき。精製Shadooが自発的にアミロイド線維に変換し、振盪しながら、Shadooは1 M GDN-HClでのインキュベーション時にアミロイド線維に変換します。品質管理アッセイは、電子顕微鏡とのThT蛍光染色が含まれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol><li> 20mMのTris-HCl緩衝液、pH7.4中2μMの最終濃度までShadooを希釈。 280 nmでの溶液の光学密度を測定すると20970のShadooアミノ酸組成から推定される吸光係数を用いて濃度を測定します。 </li><li>アミロイド構造（ 図4）への自発的なタンパク質の変換を可能にするために、数週間のカップルのために4℃で円錐形のプラスチックチューブ内の溶液500μlをインキュベートします。 </li><li>最終conceにT（ThTの）チオフラビン新たに調製追加Shadoo溶液100μlのアリコートに、10μMのntration。 RTで5分間溶液をインキュベートします。アミロイド構造体17の存在を確認するために、435 nmでの励起波長を使用して、460から520 nmの蛍光発光を測定します。 </li></ol>酸性pHでのアミロイド線維にShadoo のインビトロ組立4. <ol><li> 2μMの最終濃度になるように1 M GdnHCl、20mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5でShadooを希釈します。 </li><li> 3-7日のために、37℃で連続的に振盪しながら円錐管で、この溶液500μlをインキュベートします。 </li><li> 3.3のように溶液の一部にのThTを追加することにより、アミロイド線維の存在を確認してください。 </li><li> Shadooアミロイド原線維を精製し、10mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH 5.0に対して得られた懸濁液を透析します。 </li><li> 4℃で精製した原線維を保管してください。 </li></ol><img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53432/53432fig5.jpg"/&gt; SDS-PAGEおよびクーマシー染色を用いて分析した図5 の代表的な結果。のNi 2+から溶出したタンパク質画分は、キレートカラム（A）及びサイズ排除カラム（B）を -charged。精製Shadooの同定はSPRN抗Shadoo抗体（C）を用いて評価した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53432/53432fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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The authors have nothing to disclose.

組換えマウスShadooタンパク質の大量の発現および精製の双方のための簡単​​で効率的なプロトコルが提供されます。記載されている方法は、成功した可溶化および（彼6）タグ付き組換えShadooタンパク質の精製を可能にします。 、タイトルに指摘したようにそれは、重要なことは、原核生物細菌大腸菌で発現された場合大腸菌 Shadooは、封入体に蓄積します。 Shadoo精製?...

牛で牛海綿状脳症を含むプリオン神経変性疾患、ヒトでの羊とクロイツフェルト・ヤコブ病におけるスクレイピーは、致命的と不治です。プリオン病は、クロスβシートに、主にαヘリックスから成る細胞性プリオンタンパク質の立体構造変化によって特徴付けられる1,2の配座異性アミロイドを豊かに。クロスβ-構造が密に充填し、非常に規則正しい結晶のようなβシートは、水素結合3,4で安定化されています。プリオンアミロイドが原因募集し、単量体タンパク質ユニットを変換するためのテンプレートを提供し、成長エッジにおけるβ鎖に自己複製することができます。 「タンパク質のみ」の仮説によると、プリオンタンパク質のアミロイドコンフォーマーは唯一の感染性​​病原体です。しかしながら、いくつかの他の生体分子は、プリオン疾患に必須であることが提案されています。例えば、細胞膜は場所conversiであると考えられています上で行われ、いくつかの負に荷電した脂質は、変換プロセス5,6を増強することが示されています。加えて、いくつかのタンパク質はまた、プリオン病態に関与し得ます。ドッペルとShadoo 7,8：具体的には、プリオンタンパク質ファミリーの他の二つのメンバーがあります。ドッペルはジスルフィド橋で安定化し、比較的剛直な構造を有しており、アミロイド線維9に自己重合し、集計に失敗します。対照的に、プリオンタンパク質と同様に、Shadooは、アミロイド原線維構造にβシートに富む構造と自己会合を採用することができます。それはShadooがネイティブの条件下または負に帯電した膜10,11を結合する際にフィブリル化できることが示されました。アミロイド様繊維へShadooの変換は、病理に関連してもよいです。実際、アミロイド様構造は、疾患を引き起こすメカニズムはよく理解されていません。 Shadooが疎水性ドメイン（HD）とタンデムのArg /グリシンのシリーズを負い同様のトンを繰り返し、プリオンタンパク質（ 図1A）のN末端 ​​部分、O。プリオンタンパク質のN末端 ​​部分として、Shadooは高度に正に荷電し、ネイティブ非構造タンパク質であると思われる11,12れます。 Shadooは、直接プリオンタンパク質に結合することができるので、プリオン疾患に関連した機能的であると思われます。また、その発現がダウンプリオン病理13,14の間に調節されます。しかし、プリオン病におけるShadooの役割は未だ確立されていません。 我々は、マウスShadoo遺伝子のコード配列を有するプラスミドを開発しました。プラスミドを大腸菌を形質転換しました N末端​​His 6融合Shadooタンパク質の産生のための大腸菌 。この発現系はよく我々の研究室で確立され、一般的に我々の進行中のプロジェクトで使用されている6,15,16。 Shadooの発現のための重要な問題は、Eの選択であります大腸菌菌株。コンピテントBL21細菌株は、一般的に、組換えプロの発現のために使用されますteins Shadooが正常にのみ変換さSoluBL21細菌株から発現および精製しました。 SoluBL21 コンピテントE. 大腸菌は、その発現が、 ​​親BL21中に検出可溶性生成物は得られなかったタンパク質の産生のために開発さBL21宿主株の改良された変異体です。 SoluBL21 大腸菌における Shadooの高レベルの発現大腸菌は、封入体中のタンパク質の蓄積をもたらします。非天然タンパク質を高大腸菌で発現される一般的な特徴として、 大腸菌は 、このタンパク質は、不溶性の封入体中に蓄積する傾向があります。 Shadooはおそらく様々な程度に折り畳まれたタンパク質によって形成された高濃縮動的構造体に非共有結合、疎水性またはイオン性相互作用（またはその両方の組み合わせ）を介して集約します。 （I）変性媒体の他の生体分子からのタンパク質の選択的分離、および（ii）精製されたタンパク質の再生は 、in vitroフォールディングに用いた：結果として、精製は、少なくとも二つの工程を含みます技術。 Shadooの選択的分離は、8M尿素（または6Mグアニジン-HCl）を含む緩衝液中で達成されました。 Shadoo重合を得るために、pHを≥7の溶液中で構造化されていない単量体Shadooタンパク質、または（ii）の再生を得るために酸性pHの溶液中で（I）再生：尿素の除去及びタンパク質の再生は、様々なプロトコルを適用することによって行うことができます特徴的なクロスβシートモチーフを有する安定したアミロイド繊維へ。

<table><tbody><tr><td>AKTA FPLC&amp;nbsp;</td><td>GE, Amersham</td><td># 1363</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 Superdex</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1069-01</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap IMAC</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0920-05</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep26/10 Desalting column</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>SoluBL21 Competent E. coli</td><td>Genlantis</td><td>C700200</td><td></td></tr><tr><td>pET-28b+</td><td>Novogen</td><td>69865-3</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Broth medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Biophotometar</td><td>Eppendorf</td><td>550507804</td><td></td></tr><tr><td>Trito X-100</td><td>Life Technologies</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>NiSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Gdn-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>protein size marker&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26620</td><td></td></tr></tbody></table>

purification and refolding to amyloid fibrils of (his)6-tagged recombinant shadoo protein expressed as inclusion bodies in e. coli

大腸菌発現系は、組換え真核生物のタンパク質の産生のための強力なツールです。我々はそれがShadoo、プリオンファミリーに属するタンパク質を産生するために使用します。 （His）6の精製の ​​ためのクロマトグラフィー法は、封入体が記載されているように、組換えShadooが発現-タグ。封入体は、8M尿素で可溶化し、イオンアフィニティークロマトグラフィーを実行するようにNi 2+ -chargedカラムに結合されています。結合したタンパク質を、イミダゾールの勾配により溶出されます。 Shadooタンパク質を含有する画分を高度に精製されたタンパク質を得るために、サイズ排除クロマトグラフィーに供されます。最後のステップで精製Shadooで塩、尿素およびイミダゾールを除去するために、脱塩します。組換えShadooタンパク質はプリオン病に存在するタンパク質の立体構造の障害の生物物理学的および生化学的研究のための重要な試薬です。多くのレポートは、プリオンの神経変性疾患を刺すの沈着に由来することを実証しましたル、アミロイド線維を命じました。酸性および中性/基本的なpHでアミロイド線維にShadooをフィブリル化する方法を説明するサンプル・プロトコルが提示されています。それは、迅速かつ低コストな方法でタンパク質の大量生産を可能にするためShadooを生成し、フィブリル化する方法についての方法は、プリオン病の作業を実験室での研究を容易にすることができます。

精製Shadooタンパク質の約5〜10 mgの細菌培養1リットル当たり得られます。二段階の精製は、高純度の組換えShadooを得るために必要とされます。最初のステップは、Hisタグタンパク質を保持したNi ​​2+ -chargedカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって行われます。溶出した画分をSDS-PAGEに付し、クーマシーブリリアントブルー（ 図5A）で染色します。 Shadoo...

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Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

精製とのアミロイド線維にリフォールディング（彼）<sub&gt; 6</sub&gt;内封入体として発現された組換えShadooタンパク質をタグ付き<em&gt;大腸菌</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

purification-refolding-to-amyloid-fibrils-his-6-tagged-recombinant

Research

JoVE Journal

Biology

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

14.2K ビュー.  INRA. A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures. 

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Selection of Aptamers for Amyloid &beta;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer&#39;s Disease

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis difficult1. Definite AD diagnosis is achieved only postmortem, thus establishing presymptomatic, early diagnosis of AD is crucial for developing and administering effective therapies2,3.
Amyloid &beta;-protein (A&beta;) is central to AD pathogenesis. Soluble, oligomeric A&beta; assemblies are believed to affect neurotoxicity underlying synaptic dysfunction and neuron loss in AD4,5. Various forms of soluble A&beta; assemblies have been described, however, their interrelationships and relevance to AD etiology and pathogenesis are complex and not well understood6. Specific molecular recognition tools may unravel the relationships amongst A&beta; assemblies and facilitate detection and characterization of these assemblies early in the disease course before symptoms emerge. Molecular recognition commonly relies on antibodies. However, an alternative class of molecular recognition tools, aptamers, offers important advantages relative to antibodies7,8. Aptamers are oligonucleotides generated by in-vitro selection: systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)9,10. SELEX is an iterative process that, similar to Darwinian evolution, allows selection, amplification, enrichment, and perpetuation of a property, e.g., avid, specific, ligand binding (aptamers) or catalytic activity (ribozymes and DNAzymes).
Despite emergence of aptamers as tools in modern biotechnology and medicine11, they have been underutilized in the amyloid field. Few RNA or ssDNA aptamers have been selected against various forms of prion proteins (PrP)12-16. An RNA aptamer generated against recombinant bovine PrP was shown to recognize bovine PrP-&beta;17, a soluble, oligomeric, &beta;-sheet-rich conformational variant of full-length PrP that forms amyloid fibrils18. Aptamers generated using monomeric and several forms of fibrillar &beta;2-microglobulin (&beta;2m) were found to bind fibrils of certain other amyloidogenic proteins besides &beta;2m fibrils19. Ylera et al. described RNA aptamers selected against immobilized monomeric A&beta;4020. Unexpectedly, these aptamers bound fibrillar A&beta;40. Altogether, these data raise several important questions. Why did aptamers selected against monomeric proteins recognize their polymeric forms? Could aptamers against monomeric and/or oligomeric forms of amyloidogenic proteins be obtained? To address these questions, we attempted to select aptamers for covalently-stabilized oligomeric A&beta;4021 generated using photo-induced cross-linking of unmodified proteins (PICUP)22,23. Similar to previous findings17,19,20, these aptamers reacted with fibrils of A&beta; and several other amyloidogenic proteins likely recognizing a potentially common amyloid structural aptatope21. Here, we present the SELEX methodology used in production of these aptamers21.

Selection of Aptamers for Amyloid &#946;-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease

Aptamers are short ribo-/deoxyribo-oligonucleotides selected by in-vitro evolution methods based on affinity for a specific target. Aptamers are molecular recognition tools with versatile therapeutic, diagnostic, and research applications. We demonstrate methods for selection of aptamers for amyloid &beta;-protein, the causative agent of Alzheimer's disease.

アミロイドβ-蛋白質、アルツハイマー病の原因物質のためのアプタマーの選択

Alzheimer's disease (AD) is a progressive, age-dependent, neurodegenerative disorder with an insidious course that renders its presymptomatic diagnosis ...

神経科学

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (&gt;95%) A&#946;42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the A&#946;40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Herein we report a tailored HPLC purification protocol that yields high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides, capable of oligomer formation. Amyloid beta is a highly aggregation prone, hydrophobic peptide implicated in Alzheimer&#39;s disease. The amyloidogenic nature of the peptide makes its purification a challenge.

オリゴマー形成可能な高純度のアミロイドベータ42とアミロイドベータ40ペプチドを、利回りテーラードHPLC精製プロトコル

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

生化学

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

高効率巻き戻しと受容体リガンド結合領域の浄化法

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

セミ変性洗剤-アガロースゲル電気泳動によりアミロイド凝集のためにスクリーニング

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

生物学

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a large extracellular domain and a short cytosolic domain termed the APP intracellular domain (AICD). During maturation through the secretory pathway, APP can be cleaved by proteases termed &alpha;, &beta;, and &gamma;-secretases1. Sequential proteolytic cleavage of APP with &beta; and &gamma;-secretases leads to the production of a small proteolytic peptide, termed A&beta;, which is amyloidogenic and the core constituent of senile plaques. The AICD is also liberated from the membrane after secretase processing, and through interactions with Fe65 and Tip60, can translocate to the nucleus to participate in transcription regulation of multiple target genes2,3. Protein-protein interactions involving the AICD may affect trafficking, processing, and cellular functions of holo-APP and its C-terminal fragments. We have recently shown that AICD can aggregate in vitro, and this process is inhibited by the AD-implicated molecular chaperone ubiquilin-14. Consistent with these findings, the AICD has exposed hydrophobic domains and is intrinsically disordered in vitro5,6, however it obtains stable secondary structure when bound to Fe657. We have proposed that ubiquilin-1 prevents inappropriate inter- and intramolecular interactions of AICD, preventing aggregation in vitro and in intact cells4. While most studies focus on the role of APP in the pathogenesis of AD, the role of AICD in this process is not clear. Expression of AICD has been shown to induce apoptosis8, to modulate signaling pathways9, and to regulate calcium signaling10. Over-expression of AICD and Fe65 in a transgenic mouse model induces Alzheimer's like pathology11, and recently AICD has been detected in brain lysates by western blotting when using appropriate antigen retrieval techniques12. To facilitate structural, biochemical, and biophysical studies of the AICD, we have developed a procedure to produce recombinantly large amounts of highly pure AICD protein. We further describe a method for inducing the in vitro thermal aggregation of AICD and analysis by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical, biophysical, and structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on AICD aggregation.

A method for large-scale purification of the APP intracellular domain (AICD) is described. We also describe methodology to induce in vitro AICD aggregation and visualization by atomic force microscopy. The methods described are useful for biochemical/structural characterization of the AICD and the effects of molecular chaperones on its aggregation.

アミロイド前駆体タンパク質細胞内ドメインの精製と集約

Amyloid precursor protein (APP) is a type I transmembrane protein associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD). APP is characterized by a ...

医学

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures of polypeptides fulfill many purposes, it is now recognized that most proteins can adopt an alternative assembly of beta-sheet rich amyloid. Insoluble amyloid fibrils are initially associated with multiple human ailments, but they are increasingly shown as functional players participating in various important cellular processes. In addition, amyloid deposited in patient tissues contains nonproteinaceous components, such as nucleic acids and glycosaminoglycans (GAGs). These cofactors can facilitate the formation of amyloid, resulting in the generation of different types of insoluble precipitates. By taking advantage of our understanding how proteins misfold via an intermediate stage of soluble amyloid precursor, we have devised a method to convert native proteins to amyloid fibrils in vitro. This approach allows one to prepare amyloid in large quantities, examine the properties of amyloid generated from specific proteins, and evaluate the structural changes accompanying the conversion.

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Proteins can either adopt a native structure or misfold into insoluble amyloid. Conditions that favor the misfolding pathway lead to the formation of different types of amyloid fibrils. The methods described here allow rapid conversion of native proteins into amyloid in vitro.

天然のタンパク質からアミロイドの迅速な生成<em&gt;インビトロ</em

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

脳からのアミロイド線維コアの生化学的浄化とプロテオミクス特性評価

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Source: Upadhyay, A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/63816">Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video demonstrates the protocol for isolating&#160; amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

脳組織抽出物からのアミロイド線維の単離

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Tissue harvesting and ...

精製とのアミロイド線維にリフォールディング（彼）

要約

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