Name: stem cell-like xenopus embryonic explants to study early neural developmental features in vitro and in vivo
Uploaded: 2016-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
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The author thanks Hugo Juraver-Geslin, Marion Wassef and Anne H&#233;l&#232;ne Monsoro-Burq for their help and advice, and the Animal Facility of the Institut Curie. The author thanks Paul Johnson for his editing work on the manuscript. This work was supported by the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS UMR8197, INSERM U1024) and by grants from the "Association pour la Recherche sur le Cancer" (ARC 4972 and ARC 5115; FRC DOC20120605233 and LABEX Memolife) and the Fondation Pierre Gilles de Gennes (FPGG0039).

Experimente mit nationalen und europäischen Verordnung über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit international etablierten Prinzipien der Vermeidung, Verminderung und Verbesserung verwendet, entsprechen. 1. Flach Montage von Xenopus laevis Kaulquappen Anterior Neuralrohr Nach Whole-mount in situ Hybridisierung <ol><li> Erhalten X. laevis Embryonen nach Standardverfahren 4 und älter werden, bis sie Neurulastadium 26 und älter (nach Nieuwkoop und Faber Entwicklungstabelle 17 zu erreichen. </li><li> Fix X. laevis Kaulquappen durch Inkubation in einer Lösung von 4% Paraformaldehyd (PFA). Rock, drehen und die Embryonen in eine 2 ml-Glasampulle werden 1 bis 1,5 h bei RT Stufe 26 bis 38 Embryonen, 2 h bei RT für Embryos in einem späteren Stadium der Bühne. ACHTUNG: PFA ist durch Kontakt und möglicherweise krebs giftig. Es sollte unter einer Haube manipuliert werden. HINWEIS: One X. laevis Brutüblicherweise in einem 2 ml-Glasampulle fest, aber eine größere Glasfläschchen verwendet werden können. </li><li> Die Embryonen in der gleichen Ampulle mit 1x PBS mit 0,1% Tween (PBT), 3 min bei RT waschen, zweimal. HINWEIS: Sofern nicht anders angeben PBS verwendet wird, ist mit oder ohne Kalzium und Magnesium. </li><li> Dehydratisieren die Embryos in 100% Methanol (MeOH) für mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur in der gleichen Ampulle. Ändern Sie den MeOH 100% mindestens zweimal unter der Haube mit einem Kunststoff-Mikropipette. HINWEIS: Die MeOH leicht gelb gefärbt, wie Lipide darin gelöst. VORSICHT Das MeOH ist beim Einatmen giftig und sollte unter einer Haube manipuliert werden. </li><li> Rehydrieren die Embryonen mit der gleichen Ampulle durch eine abgestufte Reihe von MeOH Bäder: MeOH 75% in PBS, MeOH 50% in PBS, MeOH 25% in PBS, PBS zweimal, jedes Bad 5-10 min bei RT. Die MeOH-Lösungen werden unter der Haube mit einem Kunststoff-Mikropipette geändert. </li><li> Mit einem Kunststoff-Pipette der Embryo in einem 60 mm-Petrischale an die Spitze mit PBT gefüllten seziert werden. Mit Hilfe von zwei feinen Pinzette Pflegedie Augen, indem Sie einen feinen Pinzette zwischen den Augen und dem Neuralrohr, auf der Ebene der Optik Stiel vollständig entfernen. Lösen Sie die Augen aus dem Neuralrohr. Vorsichtig einführen die Zange unter dem Ektoderm über dem Neuralrohr. Mit Sorgfalt, ziehen Sie die Ektoderm ab hinter dem Kopf und entsorgen Sie sie. </li><li> Führen Sie ein Doppel- oder Einzel ISH unter Verwendung von Digoxigenin-markierten oder Fluorescein-markierten Sonden, wie oben beschrieben 18,19. </li><li> Nachdem der ISH Übertragung der Embryonen in einem neuen 60 mm Petrischale an die Spitze mit PBT mit einer Plastikpipette gefüllt. </li><li> Verwenden feinen Pinzette vorsichtig lösen das Neuralrohr vom Rest des Embryos. In diesem Stadium löst sich die vordere Neuralrohr von posterior Neuralrohr. Vorsichtig lösen übrigen Teile des Ektoderms über dem Neuralrohr, Chorda, die lose unter dem Neuralrohr oticum Vesikeln und übrigen Teile des Mesoderms befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass das Neuralrohr ist frei von irgendwelchen Anlagenauf dieser Stufe. HINWEIS: Um eine Beschädigung des Neuralrohrs zu vermeiden führen alle Neuralrohr / Embryotransfer mit einem Kunststofftransferpipette oder einer Mikropipette bei Bedarf mit einer Spitze Schnitt an seinem Ende. Der Durchmesser des Spitzenendes an die Größe des Neuralrohrs eingestellt. </li><li> Übertragen Sie die seziert Neuralrohr (siehe Hinweis Schritt 1.9) in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 50% Glycerin in PBS gefüllt. Warten, bis die Neuralrohren haben zur Unterseite der Glycerinlösung gefallen ist, in der Regel O / N bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Lösung von 50% Glycerin / PBS mit einer Mikropipette P1000 und fügen Sie in der gleichen 1,5-ml-Röhrchen mit einer Lösung von 90% Glycerin / PBS mit einer Mikropipette P1000. Warten Sie, bis die neuronalen Rohre an der Unterseite der 90% Glycerin / PBS-Lösung fallen, in der Regel O / N bei 4 ° C. Hinweis: für die langfristige Lagerung, verwenden 90% Glycerin / PBS plus Antibiotika, um bakterielle Entwicklung zu verhindern. </li><li> Übertragen Sie die neuronale Rohre auf einer Glasplatte oder einem Objektträger mit einer Kunststofftransferpipette. </li><li> DisSekte die neuronalen Rohre entlang der dorsalen und ventralen Mittellinien mit Wolfram-Nadeln. Während dieser Stufe werden die neuronalen Röhrchen werden in 90% Glycerin / PBS aufbewahrt. </li><li> Montieren Sie die beiden Seiten des Neuralrohrs in 90% Glycerin / PBS mit Verstärkungsringen mit einem Deckglas bedeckt. </li><li> Befestigen Sie die Deckgläser mit Lack und halten bei 4 ° C. </li></ol> 2. Tier Kappe Explantate Induction Mit Anionenaustauschharzkügelchen <ol><li> Übertragen Sie 100 ul Anionenaustauschharzkügelchen in ein 2-ml-Röhrchen mit einer Mikropipette P1000. Mindestens fünf Mal mit sterilem destilliertem Wasser Waschen der Kügelchen. Lassen Sie die Perlen am Boden des Röhrchens sedimentieren und ersetzen Sie die sterilem destilliertem Wasser mit einer Mikropipette P1000. Berühren Sie nicht die Perlen. </li><li> Ließ die Perlen tränken O / N in einem 2 ml-Röhrchen mit sterilem destilliertem Wasser mit Rinderserumalbumin (BSA) (10 mg / ml) bei 4 ° C gefüllt. </li><li> Zwei Stunden vor dem Sammeln des ACs, statt die Hälfte der Perlen in ein neues 1,5 mlRohr mit einer Mikropipette P1000. Ersetzen den sterilem destilliertem Wasser mit 500 &amp; mgr; l des Mediums, enthaltend das Molekül in seiner induktive Potential getestet werden oder bekanntermaßen eine spezifische Schicksal induzieren. Zu halten, die andere Hälfte der Perlen, wie sie als negative Kontrolle verwendet werden. </li><li> Die Perlen Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 2 Std. </li><li> Führen Sie alle nachfolgenden Schritte unter dem Stereomikroskop und führen alle AC Transfer mit einer Mikropipette. </li><li> Bringen Blastula oder sehr frühen Gastrula Embryonen in PBS mit Calcium und Magnesium mit 0,2% BSA mit einem Kunststofftransferpipette ergänzt. HINWEIS: Die Embryonen entwickeln bei 12 ° C Reichweite Blastula und Gastrula Stufen in 20 bis 24 Stunden. </li><li> Entfernen des Embryos Dotterhaut mit einer Pinzette, wie zuvor beschrieben 20. Befestigen Sie den Embryo mit einer Pinzette. Klemmen die Dotterhaut mit der Seite der anderen Zange. Hält die Membran langsam abziehen den Embryo. Führen Sie dieses Verfahren auf dem ventrale (pflanzlichen) Seite des Embryos. Den Tier Seite des Embryos nicht beschädigen. </li><li> Isolieren kleiner ACs, wie zuvor beschrieben 21. Das Tier Pol pigmentierte Teil des Embryos. Verwenden feinen Pinzette schneiden Sie ein kleines Quadrat von Gewebe aus der Tiermast. Die AC-Gewebe enthält nur die Ektodermzellen. Sicherzustellen, dass das Gewebe von gleichförmiger Dicke. Wenn nicht, entfernen Sie den AC aus der Analyse. </li><li> Platzieren Sie jede AC in einer Terasaki Multiwell-Platten in 0,5x Geändert Barths Saline (MBS) 4. Setzen Sie den AC in den Brunnen mit pigmentierten Tierseite nach unten in Kontakt mit der runden Boden des Bohrlochs. HINWEIS: Beschichtungs Pipetten mit einer 0,1% BSA-Lösung verhindert das Anhaften von kleinen Stücken von Klebstoff mit dem Kunststoffgewebe. </li><li> Setzen Sie einen Wulst an jeder Kappe mit einer Mikropipette P20. Verwenden Sie bei Bedarf Pinzette vorsichtig die Perle in der Mitte der Kappe. HINWEIS: Wenn in einem konditionierten Medium getränkt werden die Perlen in rosa gefärbt. Wählen Sie die meisten Colored Perlen. </li><li> Inkubieren bei RT (18-22 ° C) für 6 Stunden ohne Bewegung der Terasaki Multiwellplatte. Der Wulst hält sich an die AC in weniger als 2 Stunden. </li><li> Legen Sie das Terasaki Multiwellplatte auf der Oberseite der Papiere in Wasser eingeweicht. Die Platte mit einem Kunststoffbehälter. HINWEIS: Diese &quot;feuchte Kammer&quot; verhindert ein vorzeitiges Verdampfen der Brunnen. </li><li> Kultur der ACS in 0,5x MBS oder 3/4 NAM (siehe Schritt 4.1) in der feuchten Kammer bei 15-20 ° C, bis die Geschwister-Embryonen die richtige Bühne, um die Wirkung Ihrer Faktor testen erreicht. </li><li> Befestigen Sie den ACs für 1 Stunde in frisch zubereiteten 4% PFA. Entwässern des ACS in 100% Methanol, wie zuvor beschrieben (Schritt 1.4). </li></ol> 3. Tier Cap Zelldissoziation und Reaggregation vor dem Pfropfen in einer Xenopus laevis Neurula <ol><li> Mantel-Petrischalen (60 mm) oder 12 Loch-Platten mit 3% Agarose in sterilem Wasser oder in PBS ohne Calcium und Magnesium. Fügen Sie genug, um die Agarose b abdeckenottom der Petrischale oder den Brunnen. Pre-erwärmen Sie die Platten bei Raumtemperatur (18-22 ° C). Optional gespeichert die Platten für zwei Tage bei 4 ° C, um Austrocknung zu verhindern. </li><li> Vorbereitung calciumfreien HOLTFRETER der Kochsalzlösung (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) und HOLTFRETER der Kochsalzlösung (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,6) 5. HINWEIS: die Lösung von CaCl 2 kann nicht autoklaviert werden. </li><li> Füllen Sie die Agarose-beschichteten auch an die Spitze mit Calcium-freien Holtfreter die Kochsalzlösung. </li><li> Vorbereitung Blastula oder sehr frühen Gastrula Embryonen ihre ACs isolieren, wie zuvor beschrieben (Schritte 2,5 bis 2,7). </li><li> Isolieren mindestens 15 oder bis zu 30, kleine ACs 21. Verwenden feinen Pinzette schneiden Sie ein kleines Quadrat von Gewebe aus der Tiermast. Die AC-Gewebe enthält nur ektodermale Zellen und ist daher gleichmäßiger Dicke. Wenn nicht, entfernen Sie den AC aus der Analyse. HINWEIS: Das Tier Pol ist der Embryo Die pigmentierte Teil. </li><li> Übertragen Sie die ACs in einem Agarose-beschichteten auch an die Spitze mit Calcium-freien Holtfreter die Kochsalzlösung gefüllt. Legen Sie die ACs mit pigmentierten Seite nach oben. HINWEIS: Die Dissoziation Prozess startet schnell in calciumfreien Holtfreter die Kochsalzlösung. </li><li> Warten Sie ein paar Minuten für die Zellen zu starten distanziert. Beachten Sie dies durch Disaggregation der Gewebe. Verwenden feinen Pinzette, trennen Sie die pigmentierte Schicht von dem Rest des AC und entsorgen Sie sie mit einer Mikropipette P20. Vollständige Zelle Dissoziation angibt Trennung von Zellen voneinander. HINWEIS: Ein oder zwei pigmentierte Schichten können innerhalb der Rück aggregiert Explantat gelassen werden, um die Visualisierung während der Pfropfung zu helfen. </li><li> Zentrieren Sie die Zellen mit kreisenden Bewegungen der Platte. Mit einer Mikropipette P1000 vorsichtig so viel Medium wie möglich. Achten Sie darauf, um die Zellen zu berühren. </li><li> 1 ml HOLTFRETER die Salzlösung mit Calcium zu der Bohrung. Übertragen Sie die distanzierte ACsin ein 1,5-ml-Röhrchen. HINWEIS: 2-ml-Röhrchen kann nicht aufgrund ihrer Rund verwendet werden. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation 5 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 2.000 rpm für eine Tischzentrifuge (500 xg). Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Mikropipette P1000. </li><li> Zu den dissoziierten Zellen 20 ul HOLTFRETER die Salzlösung mit Calcium (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (Sigma A-7888, pH 7,6) 5. </li><li> Halten des dissoziierten ACs, 3-6 Stunden bei Raumtemperatur (18-22 ° C). Anmerkung: Dies ist notwendig, Zeit für die Zellen neu zu aggregieren. Die erneute Aggregation sichtbar ist, wenn die Zellen zu bilden, eine kleine Kugel an der Unterseite des Rohres. </li><li> Nehmen Sie das Explantat vorsichtig aus dem Boden des Röhrchens durch Zugabe von 1 ml 0,5x MBS oder von 1 ml 3/4 NAM (siehe Schritt 4.1). Übertragen Sie die Explantation in einer un-beschichtete Platte mit einem Kunststofftransferpipette. </li><li> Stufe werden die Explantate mit ihren Steuer Geschwister. Für Langzeitkultur Einsatz von Antibiotika: kanamycin (50 ug / ml), Ampicillin (50 ug / ml) und Gentamycin (50 ug / ml). </li></ol> 4. Pfropfen von Tier Caps Explantate in der Neuralplatte von X. laevis Embryo <ol><li> Vorbereitung 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0,2 × PBS, 50 ug / ml Gentamycin). Nicht länger als 1 Woche zu halten für die Präparation und bei 4 ° C. Älteren NAM können zur Herstellung von Agarose-beschichteten Präparation Schalen (unten) verwendet werden. </li><li> Coat Petrischalen (60 mm) mit 3% Agarose in 3/4 NAM, in die kleinen Löcher wurden entweder mit einer Silikonform, oder die Abdeckung eines Tischtennisschläger gemacht. HINWEIS: Die Agarose den Boden der Petrischale bedeckt. Lassen Sie etwas Platz, so dass die Petrischale mit 3/4 NAM zu füllen. Alternativ machen Dissektion Gerichte mit nicht-trocknende Knetmasse. Innerhalb der Ton, drücken Sie die Embryonen leicht während der Präparation Verfahren. Graben kleine Löcher in derAgarose mit abgerundeten Pinzette dieser &quot;Dissektion Gericht &#39;hilft, um die Embryonen während der Präparation Verfahren zu halten. </li><li> Sammeln Dissektion Werkzeuge: Kunststofftransferpipetten, ein &quot;Augenbraue-Messer &#39;22, zwei feinen Sezierung einer Pinzette, P1000 Mikropipette und Tipps, einem stereosmicroscope mit Vergrößerungs 8-40X (mit Augenbrauen Haare in Paraffin an der Spitze einer Glaspasteurpipette eingebettet ist), eine helle Lichtquelle mit Lichtwellenleiterführungen. Halten Sie alle Sezieren Werkzeuge sauber; Nach jedem Versuch, spülen Sie sie zweimal mit destilliertem Wasser, einmal mit 100% Ethanol und trocknen lassen. Lager weg von Staub und ggf. Autoklaven Metall Sezieren Werkzeuge. </li><li> Lassen Sie das dissoziiert und erneut aggregiert ACs (Protokoll 3) und ihre Geschwister X. laevis Embryonen entwickeln, bis sie Stufe 13 (Neurula) erreichen nach Nieuwkoop und Faber Entwicklungstabelle 17. Für die Transplantation in der Neuralplatte Stufe 13 bis 15 Embryonen der Bühne verwendet. </li><li> Führen Sie allenachfolgenden Schritte unter dem Stereomikroskop. </li><li> Mit einem Kunststofftransferpipette, übertragen Sie die Embryonen in PBS mit Calcium und Magnesium mit 0,2% BSA ergänzt. Entfernen des Embryos Dotterhaut, wie zuvor beschrieben 20. Befestigen Sie den Embryo mit einer Pinzette. Klemmen die Dotterhaut mit der Seite der anderen Zange. Halten der Membran fest, langsam abziehen den Embryo. HINWEIS: Führen Sie diese Prozedur auf der ventralen (pflanzlichen) Seite des Embryos. Die Embryonen nicht beschädigen Neuralplatte. Wenn Embryonen während der Dotterhaut Entfernungsschritt beschädigt wurde, übertragen Sie die Embryonen in eine 60 mm Petrischale mit 3/4 NAM mit einem Kunststofftransferpipette und warten Sie 15 Minuten, eine ausreichende Zeit für die Heilung eintritt. </li><li> Füllen Sie das Sezieren Gericht an die Spitze mit frischen 3/4 NAM. </li><li> Mit einem Kunststofftransferpipette, übertragen Sie die Embryonen ohne ihre Dotterhaut in das Sezieren Gericht. Legen Sie die Embryonen Rückenseite nach oben indie Brunnen. Während der Übertragung nicht zulassen, dass der Embryo, in Kontakt mit der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, da X. geben laevis durch Oberflächenspannung lysiert. </li><li> Übertragen Sie die AC Explantat in das Sezierung Platte mit einem Kunststofftransferpipette oder einer Mikropipette P1000 gepfropft werden. Nachdem die Pipette innerhalb der Flüssigkeit, damit die Explantate langsam sinken durch Schwerkraft, oder drücken Sie ganz sanft. </li><li> Pflegen Sie die Embryonen mit abgerundeten Pinzette. Mit der Augenbraue Messer einen Einschnitt in das neuronale Platte, wo Sie beabsichtigen, Ihre Explantat piece pfropfen. HINWEIS: In der Stufe 14 die vordere Biegung der Neuralplatte kann Gebrauch als ein Wahrzeichen sein, das Zwischenhirn Gebiet (Abbildung 4) markiert. </li><li> Schneiden Sie ein kleines Stück Neuroepithel, mit abgerundeten Pinzette und eine Augenbraue Messer. Schneiden Sie ein kleines Stück von dem Explantat mit der Augenbraue Messer. HINWEIS: Das Stück Explantation sollte etwa die gleiche Größe und Form wie die Neuroepithel abgetragenen Bereich sein. </li&gt; <li> Legen Sie das Stück Explantat in die Neuroepithel Einschnitt mit der Augenbraue Messer und feinen Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Explantation schnell wird an der Embryo. </li><li> Alternativ legen Sie ein Stück Deckglas auf die aufgepfropften Embryo, um das Transplantat an Ort und Stelle zu halten. Um dies zu tun, machen eine gute Deckglas in sehr kleine Stücke mit grobem Pinzette. Sicherzustellen, dass die Größe etwa 1,5 mm 2. Tauchen Sie die Stücke in eine Petrischale mit 3/4 NAM oder PBS mit einer Pinzette. Wählen Sie ein Stück Glas größer als der Embryo um Beschädigungen zu vermeiden. Der Embryo wird ein wenig abgeflacht. </li><li> Warten Sie mindestens 30 Minuten ohne Bewegung oder nur die Sektionsplatte bewegen sanft. Lassen Sie den Embryo zu erholen für 30 Minuten bis 2 Stunden und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, wenn nötig. Die gepfropft Embryonen vorsichtig Pipette in ein sauberes Geschirr mit 3/4 NAM gefüllt ist, mit Hilfe der Kunststofftransferpipette. HINWEIS: Gepfropfte Embryonen neigen dazu, Bakterien oder Pilze Kontamination zu entwickeln. Für langfristige culture verwenden Antibiotika: Kanamycin (50 ug / ml), Ampicillin (50 ug / ml) und Gentamycin (50 ug / ml). </li></ol>

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L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+vertebrate+forebrain:+the+prosomeric+model.">The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model.</a> Science. 266, 578-580 (1994).</li><li>Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+gene+expression+domains+and+the+evolving+prosomeric+model.">Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model.</a> Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).</li><li>Martinez-Ferre, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regionalization+of+the+diencephalon.">Molecular regionalization of the diencephalon.</a> Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).</li><li>Scholpp, S., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Building+a+bridal+chamber:+development+of+the+thalamus.">Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus.</a> Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).</li><li>Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xotch,+the+Xenopus+homolog+of+Drosophila+notch.">Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch.</a> Science. 249, 1438-1441 (1990).</li><li>Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+signals,+gradient+formation+and+regional+specificity+in+neural+induction.">Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction.</a> Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).</li><li>Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+induction:+old+problem,+new+findings,+yet+more+questions.">Neural induction: old problem, new findings, yet more questions.</a> Development. 132, 2007-2021 (2005).</li><li>Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barhl2+limits+growth+of+the+diencephalic+primordium+through+Caspase3+inhibition+of+beta-catenin+activation.">Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+and+Reaggregation+of+Xenopus+laevis+Animal+Caps.">Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps.</a> CSH protocols. , (2007).</li><li>Harland, R. M., Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+research:+metamorphosed+by+genetics+and+genomics.">Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics.</a> Trends Genet. 27, 507-515 (2011).</li><li>Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+logic+of+gene+regulatory+networks+in+early+vertebrate+forebrain+patterning.">The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning.</a> Mech Dev. 130, 95-111 (2013).</li><li>Pani, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+deuterostome+origins+of+vertebrate+brain+signalling+centres.">Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres.</a> Nature. 483, 289-294 (2012).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+bilaterian+central+nervous+systems:+a+single+origin?.">Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin?.</a> Evodevo. 4, 27 (2013).</li><li>Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodevelopmental+disorders+in+the+Xenopus+tadpole:+from+mechanisms+to+therapeutic+targets.">Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets.</a> Disease models &amp; mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).</li><li>Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bridging+the+gap+from+frog+research+to+human+therapy:+a+tale+of+neural+differentiation+in+Xenopus+animal+caps+and+human+pluripotent+cells.">Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells.</a> Development, growth &amp; differentiation. 50, s47-s55 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Neuralen Entwicklung wird durch ein komplexes Wechselspiel zwischen zellulären Entwicklungsprogrammen und Signale von dem umgebenden Gewebe (Bewertet in 3,31,32) instrumentiert. Eine Reihe von Protokollen, die in X verwendet werden kann Hier beschreiben wir laevis Embryonen extrinsischen und intrinsischen Faktoren in neuronalen Schicksal Entschlossenheit und neuronalen Morphogenese in vitro und in vivo beteiligt zu erkunden. Diese Protokolle können als solche auf...

Wirbelnervensystem geht aus dem neuronalen Platte als homogene Schicht von Neuroepithelzellen. Zu verstehen, wie Entwicklungsprogramme werden induziert, codiert, und gründete während Regionalisierung der Neuralplatte ist gegenwärtig eines der Hauptziele in der Entwicklungsbiologie. Im Vergleich zu anderen Systemen ist die experimentell zugänglich Xenopus Embryo ein Modell der Wahl für die Analyse von frühen Schritte der neuralen Entwicklung 1,2. Es ist leicht, eine große Zahl von Embryonen zu erhalten, und externe Entwicklung ermöglicht den Zugang zu den ersten Schritten der Neurulation 3. Viele Werkzeuge zur Verfügung, um experimentell zu manipulieren Xenopus laevis (X. laevis) Embryonalentwicklung. Mikroinjektion von mRNAs oder Morpholinos (MO), einschließlich der induzierbaren MOs zusammen mit biochemischen und pharmakologischen Werkzeugen ermöglicht kontrollierte gain of function (GOF) und Funktionsverlust (LOF) und spezifische Änderung der Signalwege 4,5. Der blastocoel Dach Ektoderm, um das Tier Pol einer Blastula oder einem sehr frühen Gastrula Embryo entfernt und bezeichnet als &quot;animal cap&quot; (AC), eine Quelle von pluripotenten Zellen, die durch Manipulation der Genexpression vor programmiert werden kann, Explantaten Vorbereitung. In diesem Manuskript sind ausführliche Protokolle zu verwenden X. laevis AC Explantaten in vitro und in vivo molekularen und zellulären Prozesse zugrunde liegenden neuralen Entwicklung zu testen. Es wird eine Technik vorgestellt, wobei eine feine Beobachtung von Genexpressionsmustern in einer Xenopus Kaulquappe Neuralrohr, einen vorläufigen Schritt bei der Identifizierung von Schicksal Bestimmung Cues. Während die Beobachtung der Flachgewebe angebracht wird allgemein bei der Untersuchung von Hühnerembryonen 6 verwendet wird, ist nicht korrekt in Xenopus beschrieben. Manipulation der Genexpression durch Einspritzen von Kunst mRNA oder MO in die Blastomeren von 2 oder 4 Zellen Embryonen ermöglicht die Programmierung ACExplantaten 4. B. Inhibierung des Bone Morphogenetic Protein (BMP) Weg durch die Expression des anti-BMP Faktor Noggin, gibt ein neuronales Identität AC Zellen 3. Das Protokoll wird zum Ausführen von lokalen und zeitgesteuerte Belichtung AC Explantate auf extrinsische Cues durch direkten Kontakt mit einem Anionenaustauscherharz Wulst beschrieben. Schließlich wird eine Technik zur Prüfung von Entwicklungs Merkmale der neuralen Vorläuferzellen in vivo durch Transplantation von gemischten Explantaten aus verschiedenen programmierten Zellen dissoziiert und Wieder assoziiert beschrieben hergestellt. Der Frosch Embryo ist ein leistungsfähiges Modell zu frühen Wirbeltiere neuralen Entwicklung zu studieren. Die Kombination Manipulation der Genexpression in vitro-Kulturen Explantation liefert wichtige Informationen in der Studie von Neuroepithel Regionalisierung, Proliferation und Morphogenese 7-12. Die Programmierung der AC Explantate gestattet Entwicklung eines funktionellen Herz ex vivo 13,14. Die VerwendungExplantatmedium Pfropfen 15 führte zur Identifizierung des minimalen Transkriptionsschalter Induzieren der Neuralleiste Differenzierungsprogramms 16. Die Zona limitans intrathalamica (ZLI) ist ein Signalisierungszentrum, das Sonic Hedgehog (Shh), um das Wachstum und die Regionalisierung der Schwanzvorderhirn steuern absondert. Wenn kontinuierlich auf Shh ausgesetzt Neuroepithelzellen Koexpression der drei Genen für Transkriptionsfaktoren - Barh artigen homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (OTX2) und Iroquois-3 (irx3) - zu erwerben zwei Eigenschaften der ZLI Fach: die Kompetenz, shh auszudrücken, und die Fähigkeit, von anterior Neuralplatte Zellen zu trennen. Als Modellsystem wird die Induktion einer ZLI Schicksal in Neuroepithelzellen präsentiert 8 werden. Diese Protokolle zielen darauf ab, einfach, billig und effiziente Werkzeuge für die Entwicklungsbiologen und andere Forscher, die fundamentale mec erkundenhanisms von Schlüssel neuronalen Zell Verhaltensweisen. Diese Protokolle sind sehr vielseitig und ermöglichen die Untersuchung einer großen Palette von extrinsischen und intrinsischen neuronalen Bestimmung Cues. Es ermöglicht langfristig in vivo Analyse neuronaler Abstammung Engagement, induktive Wechselwirkungen und Zell Verhaltensweisen.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;20909.290</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>anion exchange resin beads</td><td>Biorad</td><td>140- 1231</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin&amp;nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>A-7888</td><td>For culture of animal cappH 7.6</td></tr><tr><td>Gentamycine&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>15751-045&amp;nbsp;</td><td>antibiotic</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>SIGMA</td><td>A7906</td><td>&amp;nbsp;for bead preparation</td></tr></tbody></table>

stem cell-like xenopus embryonic explants to study early neural developmental features in vitro and in vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Basis morphologischer Überlegungen in verschiedenen Arten, embryo Manipulationen und des Expressionsmusters von regulatorischen Genen, hält einem konzeptionellen Modell, daß das neuronale Platte in Längs- und Quersegmente, die einen Entwicklungsgittererzeugungs deutliche histogenic Felder definieren unterteilt. In der Neuralplatte, die Anlagen der Vorderhirn, Mittelhirn, Hinterhirn und Rückenmark sind alle bereits entlang der anteroposterioren (AP) Achse während der Gastrulation (i...

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Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stammzell-ähnlichen<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale Explantate bis Früh Neurale Entwicklungs- Eigenschaften Studieren<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In-vivo-</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

7.9K Aufrufe.  Institut Curie. In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. 

Serie: Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development. The Xenopuslaevis embryo is very useful for studying organogenesis because their large size makes them very suitable for identifying organs at the earliest steps in organogenesis. At this time, the primary method used for identifying a specific organ or primordium is whole mount in situ hybridization with labeled antisense RNA probes specific to a gene that is expressed in the organ of interest. In addition, it is relatively easy to manipulate genes or signaling pathways in Xenopus and in situ hybridization allows one to then assay for changes in the presence or morphology of a target organ. Whole mount in situ hybridization is a multi-day protocol with many steps involved. Here we provide a simplified protocol with reduced numbers of steps and reagents used that works well for routine assays. In situ hybridization robots have greatly facilitated the process and we detail how and when we utilize that technology in the process. Once an in situ hybridization is complete, capturing the best image of the result can be frustrating. We provide advice on how to optimize imaging of in situ hybridization results. Although the protocol describes assessing organogenesis in Xenopus laevis, the same basic protocol can almost certainly be adapted to Xenopus tropicalis and other model systems.

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

The Xenopus laevis embryo continues to be exceptionally useful in the study of early development due to its large size and ease of manipulation. A simplified protocol for whole mount in situ hybridization protocol is provided that can be used in the identification of specific organs in this model system.

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in abundance, may not be secreted but tethered to the signaling cell(s), or may require the presence of binding partners or upstream regulatory molecules. Thus in a search for gene products capable of eliciting an early lens-inductive response in competent ectoderm, we utilized an expression cloning system that would allow identification of paracrine or juxtacrine factors as well as transcriptional or other regulatory proteins. Pools of mRNA were injected into Xenopus oocytes, and responding tissue placed directly on the oocytes and co-cultured. Following functional cloning of ldb1 from a neural plate stage cDNA library based on its ability to elicit the expression of the early lens placode marker foxe3 in lens-competent animal cap ectoderm, we characterized the mRNA expression pattern, and assayed developmental progression following overexpression or knockdown of ldb1. This system is suitable in a very wide variety of contexts where identification of an inducer or its upstream regulatory molecules is sought using a functional response in competent tissue.

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

We describe a Xenopus oocyte and animal cap system for the expression cloning of genes capable of inducing a response in competent ectoderm, and discuss techniques for the subsequent analysis of such genes. This system is useful in the functional identification of a wide range of gene products.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

Neural Explantatkulturen aus<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Neurowissenschaften

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and associated extracellular matrix. Because they provide a suitable organotypic environment, cortical slice explants are often used to investigate those interactions that control neuronal differentiation and development. Although beneficial, the slice explant model can suffer from drawbacks including aberrant cellular lamination and migration. Here we report a whole cerebral hemisphere explant system for studies of early cortical development that is easier to prepare than cortical slices and shows consistent organotypic migration and lamination. In this model system, early lamination and migration patterns proceed normally for a period of two days in vitro, including the period of preplate splitting, during which prospective cortical layer six forms. We then developed an ex utero electroporation (EUEP) approach that achieves ~80% success in targeting GFP expression to neurons developing in the dorsal medial cortex.
The whole hemisphere explant model makes early cortical development accessible for electroporation, pharmacological intervention and live imaging approaches. This method avoids the survival surgery required of in utero electroporation (IUEP) approaches while improving both transfection and areal targeting consistency. This method will facilitate experimental studies of neuronal proliferation, migration and differentiation.

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

This protocol describes an improved explant procedure that involves ex utero electroporation, dissection and culture of entire cerebral hemispheres from the embryonic mouse. The preparation facilitates pharmacological studies and assays of gene function during early cortical development.

Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Biologie

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

Erzeugung naiver Blastoderm-Expflanzen aus Zebrafisch-Embryonen

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomere Explantate für das Schicksal der Zelle Engagement während der embryonalen Entwicklung Testen

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

The neural crest (NC) is a transient dorsal neural tube cell population that undergoes an epithelium-to-mesenchyme transition (EMT) at the end of neurulation, migrates extensively towards various organs, and differentiates into many types of derivatives (neurons, glia, cartilage and bone, pigmented and endocrine cells). In this protocol, we describe how to dissect the premigratory cranial NC from Xenopus laevis embryos, in order to study NC development in vivo and in vitro. The frog model offers many advantages to study early development; abundant batches are available, embryos develop rapidly, in vivo gain and loss of function strategies allow manipulation of gene expression prior to NC dissection in donor and/or host embryos. The NC explants can be plated on fibronectin and used for in vitro studies. They can be cultured for several days in a serum-free defined medium. We also describe how to graft NC explants back into host embryos for studying NC migration and differentiation in vivo.

Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation

This protocol describes how to dissect premigratory cranial neural crest (NC) from Xenopus laevis neurulas. These explants can be plated on fibronectin and cultured in vitro, or grafted back into host embryos. This technique allows studying the mechanisms of NC epithelium-to-mesenchyme transition, migration, and differentiation.

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