We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil R&#233;gional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.

Numunelerin hazırlanması 1. <ol><li> Çözeltilerinin hazırlanması ve kurmak <ol><li> Standart Gıda ortamında 24 ° C&#39;de tüm Drosophila melanogaster hatlarını korumak. Arka ve şişede düşük yoğunluklu onları tutmak standart boyut ve sinekler ağırlığını oluşturmak için. <ol><li> Bir şişede 10 erkek ile 10 kadın bakire ekleyin, onları dostum izin ve taze bir şişeye 2 günde aktarabilirsiniz. Sinekler Eclose başladığında Sonra 10 gün sonra, her gün sinekleri hasat. Sineklerin yaşı kesin kaydını tutun ve iyi durumda tutmak. </li><li> 3. günde, kadınlarda gelen erkek ve dişiler ayrı flakon başına 20 sinekler tutmak. 4 ya da 5 gün eski at sinekleri kaydedin. </li></ol></li><li> Aşağıdaki konsantrasyonları ile Ringer çözeltisi hazırlayın: 130 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM MgCI2, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES ve 36 mM sukroz ve hassas 7.3 çözeltinin pH&#39;ının ayarlanması. 25 mikron perfüzyon çözümleri hazırlayın; Ringer çözeltisi içinde M nikotin ve 100 mM KCI. </li><li> Bir eğim ile (ucunun ucundan yaklaşık 35 °) bir jilet şekli ucunu kullanarak ve bahşiş 1 ½ santimetre ötesinde fazla baz kaldırın: 1000 ul pipet hazırlayın. </li><li> İnkübasyon süresince numune saklama için kutu (23 cm x 17 cm x 8,5 cm) hazırlayın. Bunların hazırlanması tamamlandıktan olarak örnekleri yerleştirmek için küçük bir raf aparatı altında [örnek kuruma önlemek için] alt suyla doymuş iki sünger (12 cm x 8 cm x 3 cm) yerleştirin. </li><li> GFP-aequorin sentezlenmesini tahrik etmek için bir GAL4 hattının UAS-GFP-aequorin en az 1 kopyasını ve bir kopyasını ihtiva eden ve böylece sinek örnekleri hazırlayın. OK107 Gal4 hattı (öncelikle mantar organları bir çizgi sürüş ifadesi) Bu hazırlık UAS-GFP-aequorin ile çarpı işareti vardır. Not: kutusunun içinde su geçirmez olmalıdır ve dış inkübasyon sırasında koelenterazin bozulmasını önlemek için kutuyu girmesini ışık engellemelidir. </li></ol></li><li> HazırlıkNumunelerin preparasyonu <ol><li> Buz bir cam şişeye aktararak Drosophila uyutmak ve pipet konumlandırma için soğutulmuş Petri kabı taşındı önce 2 dakika süreyle buz üzerinde tutmak. Diseksiyon mikroskobu altında buz üzerinde 100 mi Petri kabındaki hafif nemli filtre kağıdı üzerinde pipet uçları hazırlayın. </li><li> Yavaşça forseps yer pipet içine sinek. </li><li> Hafifçe bastırın ve baş ucu kenarı geçmiş tamamen ve dorsal bölge kısmen uç şekillendirme (Şekil 2B) sırasında çıkarılan bölüm maruz şekilde sinek hizalamak bir fırça kullanma. </li><li> Diş tutkal iki bileşenin, küçük (yaklaşık 3-4 | il) kısımları birleştirin. Pipetlemeyin ucu kenarına ve çevresinde geri aşağı baş ve boyun ön etrafında dikkatli tutkal sürün ve - baş tacı kaçınarak. 2 dakika süreyle tutkal kurumasını bekleyin. </li><li> Kayıt odasının (Şekil 2D) ve gen delikten yapıştırılmış sinek ile yerleştirin pipettly yerine sabitlemek için düğmesine basın. </li><li> Silikon yapıştırıcı (yaklaşık 3-4 ul) iki bileşeni birleştirin. Bölme ve pipet ucu buluştuğu Ringer solüsyonu sızıntısı önlemek için kenarı boyunca odasının düz tarafında tutkal sürün. 2 dakika süreyle tutkal kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Teşrih <ol><li> Perfüzyon kanalı, kısa kenarı boyunca bandı yapıştırın ve odasının arkasına kadar uzanan. </li><li> Floresan lamba mikroskop altında sırayla diseksiyonu blokta sinek odasına yerleştirin. Odasına Ringer çözeltisi pipetleyin 1 mi. </li><li> Manikür kaldırmak için ince bir cerrahi bıçak kullanın. Antennal bölgeye başın arka paralel kesiler olun. Sonra sonra önceki kesiler bağlayan anten üzerinde dik bir kesi yapmak gözün kenarında kesti. Başın arka kısmında olduğu için son bir kesi paralel yapın. Manikür (Şekil 2C) kaldırmak için ince sivri forseps kullanın. </li><li> Yavaşça bir kavramak ince keskin forseps kullanınBeyin ve [floresanlama] mantar vücut açıkça görülünceye kadar uzak solunum doku maruz temizleyebildiğini d. </li><li> Dikkatle kavramak ve koelenterazin nüfuz sağlamak için beyini çevreleyen nöroepitelyal doku çimdik ultra keskin forseps kullanın. Not: Alternatif olarak papain neuroepithelia 9 geçirgenliği için kullanılabilir. </li><li> Bir pipet kullanarak, karanlık kutu içinde diseksiyon ve yer örneğinden herhangi enkaz kaldırmak için Ringer solüsyonu ile iki kez yıkayın. </li><li> Odasına 5 uM benzil-koelenterazin içeren Ringer çözeltisi pipetleyin 1 mi. 2 saatlik bir en az oda sıcaklığında koelenterazin inkübasyon kutusunu kapatmak ve izin verir. </li></ol></li></ol> 2. Görüntüleme <ol><li> Kurmak <ol><li> Kayıt sistemini başlatın: 25 ° C mikroskop, bilgisayar, kamera ve drenaj sistemi ve set odaya çevre denetimleri açın. </li><li> Açık Ölçme ve bilgisayardaki Otomasyon Explorer programı. Tıkla &amp;#8220; Aygıtlar ve Arayüzler NI Hareket Cihazlar &quot;, ardından çift tıklayın&quot; &quot;ve nihayet sağ tıklayıp&quot; PCI-7334 &quot;ve&quot; aygıt başlatılamadı &quot;. </li><li> Foton Imager açın. Yeni bir klasör ve adını ilk kayıt dosyası oluşturun. Sistem çalışabilmesi Kamera -80 ° C ulaşmalıdır. </li><li> Set up perfüzyon sistemi - rezervuar için KCl, nikotin ve Ringer çözeltisi ekleyip 2 ml / dak yani her çözüm deşarjları ayarlayın. Deney başlamadan önce Ringer solüsyonu ile yıkayın. </li></ol></li><li> Örnek hazırlayın <ol><li> Yer görüntüleme 5X büyütmede mikroskop altında montaj blok çanak montajı ve delinme yoluyla kanala perfüzyon tüpü yerleştirin. </li><li> Floresan moduna ayarlı mikroskop sonra merkezi ve odak noktası haline mantar organları (MB) getir. 20X ve yeniden merkezi ve odak ayarlayın. </li><li> Ucu böylece drenaj havuz üzerinde Pozisyon drenaj cihazı, sadece Abov drenaj şant yüksekliğini ayarlamake havuzu ve yeterli drenajı sağlamak için 30 sn Ringer çözeltisi çalıştırın. </li><li> Işıktan aparatı kapatmak için kalkan aşağı çekin. Foton kamera otomatik odaklama sistemi kullanılarak ince ayarlamalar yapmak ve MBs bir referans floresan görüntü almak. </li></ol></li><li> Kayıt <ol><li> İstenen kayıt hızı (50 milisaniye kadar 1 sn veya daha fazla) için foton hızını ayarlayın. Seçin foton modu ve açık deklanşör. Günlük girişlerini rekor genotip, cinsiyet, yaş ve örneklem sayısı. YG kutuları tıklayarak ve kontrol tutarken sürükleyerek pozisyon ROI çanak ve hücre gövdeleri (CCB) üzerinden kutuları ve medial loblar ayarlayın. </li><li> (Arzu edildiği kadar) yaklaşık 5 ila 10 dakika boyunca kayıt taban. </li><li> 1 dakika süre ile nikotin uygulanır. Günlüğünde start / stop edin. 5 dakika boyunca Ringer solüsyonu ile yıkanır. </li><li> Kurtarma için 5 dakika bekleyin ve KCl günlük girişini ve zamanlayıcı hazırlar. </li><li> 1 dakika için KCl uygulayın. Günlüğünde start / stop edin. 1 dakika boyunca Ringer solüsyonu ile yıkanır. </li><li> Şalterfloresan moda, son floresan görüntü almak ve Ringer çözeltisi kapatın. </li><li> Basın &quot;Dur&quot;. İletişim kutusu sistemi kapatmak isteyecektir. &quot;Hayır&quot; kayda devam etmek seçin. </li><li> Açık kalkan, hareket drenaj sistemi, 5X geçiş lens objektif, perfüzyon tüpü çıkarın. , Sahneden örnek / kayıt çanak çıkarın durulama ve su ile iki kez merceği silerek 20X lensi temizlemek. </li><li> Bir sonraki kayıt başlatmak için program penceresinin üst kısmında beyaz play butonuna basın. </li></ol></li></ol> 3. Analiz ve Video Oluşturma <ol><li> Foton değerleri ayıklamak <ol><li> Foton analizi programını açın (örneğin, Foton Görüntüleyici) ve açık ilk örnek tablo dosya. </li><li> Ekran kontrol sekmesini seçin. Kontrol tutarken bölgeye tıklayarak ROI seçin. GFP ışıklı CCB ve medial lobları kapsayacak şekilde ilgi bölgelerin büyüklüğü, yönünü ve şeklini ayarlayın. </li><li> Bir ek eklemeve tıklayarak &quot;yatırım getirisi Define&quot; linkine tıklayarak ve yeni yatırım getirisi oluşturmak için ekrandaki sürükleyerek al ROI. </li><li> Foton videoyu oynatmak için &quot;Film&quot; sekmesini seçin. Istediğiniz gibi &quot;sn genişliği&quot; ve &quot;sn adımları&quot; ayarlayın. YG yerleştirme gerektikçe yeniden ayarlayın. </li><li> GFP floresan, nikotin tepki ve KCl tepki temsili ekran görüntüleri seçin. Daha sonra analiz ve karşılaştırma için bir sunum slayt içine Mahsul ekran ve yapıştırma görüntü. </li><li> &quot;Sn genişliği&quot; ve saniyeler içinde kayıt hızı &quot;sn adım&quot; hem de ayarlayın. Uyarıcı başlamadan önce ve hemen tepki bittikten sonra dirsek bölgeye üst paneldeki gri işaretçileri hareket ettirerek analiz uzunluğunu seçin. </li><li> &quot;&gt; OYUN&quot; basın &quot;&lt;&lt; REW&quot; basın &quot;oynarken görüşlerini Askıya&quot; i seçin. &quot;Puan tablosu Count&quot; ve istenen ve çizgi renkleri ROI rengine uyacak şekilde ayarlayın birimleri sekmesini seçin. </li><li> Analiz bittiğindeBasın &quot;İhracat Oranı Verileri Kont&quot;. Kombine kayıtlar CCB ve her taraftan ilgi medial lob bölgenin seçin ekran görüntüleri. Cevap görüntüleri ile slayt halinde Mahsul ekran ve yapıştırma görüntü. Bu kaydırma, daha sonra son tahlilde kullanılır. </li></ol></li><li> Örnek Analizi: detaylı ekstre foton verilerin analizinde bir yöntemdir <ol><li> &quot;Puan Exports Count&quot; klasöründeki elektronik tablo dosyalarını açın. </li><li> Hücreleri saat ve dakika zaman görüntülemek için ilk sütun etiketli zaman biçimlendirin. </li><li> Numune için ilgili slayt Referans. Zaman ve iki temsilci ROI için sütunları hariç tüm değerleri kaldırın. </li><li> Nikotin stimülasyon başlangıç ​​zamanını belirleme - ana günlük girdisi dosyasında mevcuttur başlatmak veya vurgulamak değeri öncesinde ek verileri kaldırmak klasör-. </li><li> CCB ve medial lob ve işareti / vurgulamak hem de yüksek / tepe değerini bulun. </li><li> Hem tepki başlangıç ​​ve bitiş zamanını belirlemekGeçen süre noktasını kullanarak bir tahmin oluşturarak CCB ve medial lob slayt yanıtı grafikle ve bu noktalara yakınlık değerleri değişiklikten gerçek değer seçmek değinilecektir. CCB ve medial lob hem de bu noktalar arasındaki bölgeyi vurgulayın. Alternatif olarak, 9 makro kullanın. </li><li> Yeni tablo üzerinde bir deney grubundan tüm örnekleri birleştirin. </li><li> Sıra değerini belirleyerek tepe üzerinde hizalayın her CCB tepe değerine içindir. Bu örnek verileri recopied gereken yaklaşık satır değerini belirlemek için en yüksek satır değeri düşük değerler çıkarma. Tüm tepe değerleri hizalanmış olduğundan emin olun. </li><li> Bilanço kez kopyalayın ve medial lob sütunları veya tek CCB veya medial lob değerleri sayfaları oluşturma CCB sütunları ya silin. </li><li> Tüm CCB yanıtları bittikten sonra verileri kaldırın. Dört satır Toplam fotonlar, Tepki Süresi (süre), Tepe Genlik ve Tepki Gecikme etiketli oluşturun. Kopyala ve orijinal altında yine bu yapıştırın. </li><li>Yanıt sırasında toplam fotonları belirlemek için TOPLA işlevini kullanın. Yanıtın uzunluğunu belirlemek için COUNT işlevini kullanın. Kopyala ve tepe genlik değerini belirlemek için en yüksek değer hücresini bağlamak. COUNT işlevini kullanın - cevap başlangıcına nikotin perfüzyon başından itibaren seçin - Tepki Gecikme belirlemek için. </li><li> Saniye hızını kaydederek (bütün tepe genliği hariç) çarpın bağlantı işlevini kullanarak ve kopyalama değerleri. </li><li> Yani (örn .: Şekil 5B, C, D) istenirse Bar / kutu grafikleri gibi toplam Fotonlar, Tepe Genlik ve Tepki Süresi olarak hesaplanan parametreler için oluşturulabilir. </li><li> Ham veri foton cevaptan sonra sütununda, ortalama fonksiyonunu kullanarak her zaman noktası için ham veri noktaları ortalama. Ortalama (SEM) standart hatasını belirlemek kolon istenen takip bir zaman noktasında ortalama foton değerleri için ise. </li><li> Ortalama bir tepki profile oluşturmak için ortalama sütunu kullanınCCB örneklem grubu için e [Grafik]. Bu x-ekseni değerleri olarak saatini belirterek sütun ve y-ekseni olarak ortalama foton değerleri sütunu seçin ve son olarak saçılım grafiği oluşturma aracını seçin yapmak için. </li><li> Medial lob verilerle bu analiz işlemi tekrarlayın. </li></ol></li><li> Video için Görüntüleri oluşturma <ol><li> Açık foton görüntüleyici. </li><li> Seç ekran kontrol sekmesi. Seçmek kaldırmak ve / veya en aza indirmek için kontrol tutarken ROI tıklayın. </li><li> &quot;Sn genişliği&quot; her çerçevenin içeriğini belirlemek için arzu edildiği gibi (birikim süresi) değiştirin. </li><li> Her çerçevenin üst üste tanımlamak için &quot;sn adım&quot; değiştirin. </li><li> Basın &quot;&lt;&lt; REW&quot; ardından &quot;oynarken ihracat görüşlerini&quot; &quot;OYUN&gt;&quot; seçeneğini seçin. Video için görüntüleri .png dosyaları bir dizi olarak &quot;görünümü ihracatı&quot; klasörüne ihraç edilecek. </li></ol></li><li> Video c için bir yöntem: Sanal Dub kullanarak video yapmakDetaylı reaksiyonundan <ol><li> Görüntüleri içeren görünüm ihracat klasöründeki &quot;Resultats&quot; adlı yeni bir klasör oluşturun. </li><li> Görüntülerin klasörünün içine komut (renommer.VBS) getirin. </li><li> Renommer.VBS çift tıklayın çalıştırmak için. </li><li> Görüntüler otomatik olarak sayısal olarak yeniden adlandırıldı ve &quot;Resultats&quot; klasörüne kopyalanacaktır. </li><li> Açık VirtualDub.exe. </li><li> Açık bir video dosyasını seçin - (sonraki görüntüler otomatik olarak yükleyecektir) ilk resmi seçin. </li><li> Seç videosu - istediğiniz gibi belirleyin kare hızı ayarlayın. </li><li> Video seçin - Seçilen sıkıştırma yarıçapı Cinepak Codec seçin. </li><li> Dosyasında video otomatik olarak oluşturulur AVI olarak kaydet seçeneğini seçin. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+imaging:+fluorescence+or+bioluminescence,+which+to+choose.">In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose.</a> J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidized+coelenterazine,+the+active+group+in+the+photoprotein+aequorin.">Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+data+on+the+bioluminescent+protein,+aequorin.">Further data on the bioluminescent protein, aequorin.</a> J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).</li><li>Baubet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein-aequorin+as+bioluminescent+Ca2++reporters+at+the+single-cell+level.">Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).</li><li>Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biogenic+amine+and+a+neuropeptide+act+identically:+tyramine+signals+through+calcium+in+Drosophila+tubule+stellate+cells.">A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells.</a> Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).</li><li>Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+patterns+of+calcium+transients+during+neural+induction+in+Xenopus+laevis+embryos.">Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos.</a> J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).</li><li>Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Br&#251;let, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca2++signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2 (3), e275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., R&#233;al, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-stores+mediate+adaptation+in+axon+terminals+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+Drosophila.">Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 12, 105 (2011).</li><li>Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+cAMP/CNG+channels+independently+regulate+the+cholinergic+Ca2+-response+of+Drosophila+mushroom+body+neurons.">PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons.</a> eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).</li><li>Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functional+calcium+imaging+of+induced+or+spontaneous+activity+in+the+fly+brain+using+a+GFP-apoaequorin-based+bioluminescent+approach.">In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach.</a> BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).</li><li>Lima, S. Q., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+properties+of+recombinant+semisynthetic+aequorins+and+recombinant+fluorescein-conjugated+aequorin+for+measuring+cellular+calcium.">Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium.</a> Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).</li><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Fiala, A., Spall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+brain+activity+in+Drosophila+by+transgenic+cameleon+expression.">In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression.</a> Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Olfactory+Representations+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe.">Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe.</a> Science. 303 (5656), 366-370 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Cabrero ve ark belirtildiği gibi burada sunulan yeni geliştirilmiş biyolojik olarak ışık veren bazlı GFP aequorin bir yaklaşım, böbrek stellat hücreleri gibi diğer hücre tür, hem de istenirse gibi farklı nöronlarında Ca 2 + -Aktiflik in vivo fonksiyonel bir kayıt sağlar. 2013 5. Değişiklikler, sorun çekim, ek bileşenler ve kritik adımlar Drosoph...

Temel desenlendirme ve beyin ve ayrık yapı içinde faaliyet işlevi uzun nörobilim alanındaki yoğun bir çalışma alanı olmuştur. Belki de bu sorunu gidermek için kullanılan en eski başarılı yaklaşımların bazı elektrik aktivitesindeki değişikliğin doğrudan fizyolojik ölçümü vardı - ek yetenekleri getirdi (aktivite için proxy olarak) gerilim, pH veya kalsiyum konsantrasyonları değişikliklerin canlı görüntüleme izin ancak alternatif yöntemler nöronal aktivitenin 1 çalışma. Görüntüleme teknikleri, azaltılmış invaziv ve bütün beyin yapıları içinde etkinliğini izlemek için yeteneği gibi avantajları geniş bir yelpazeye taşırlar. Ayrıca meyve gibi uysal genetik hayvanlarda Drosophila gibi cameleon, GCaMPs ve diğerleri gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, gelişimini sinek 1 tek nöronlar, nöronal nüfus ve tüm beyni izlemek için araştırmacılar izinyapıları. Daha geleneksel floresan kalsiyum görüntüleme yöntemleri (kalmodulin kaynaştırılmış CFP ve YFP) (kalmodulin erimiş GFP) ya da FRET GCaMPs kullanırken iyi mekansal ve zamansal çözünürlük sağlayan kullanışlı teknikler olduklarını kanıtladılar, ışık uyarma altında yatan sürecinin deneysel bazı sınırlamalar doğurur uygulamaları. Nedeniyle sonuç görüntülü olabilir yapıların derinliğini sınırlar kaçınılmaz üretilen hafif uyarma, otofloresansı, fotoğraf ağartma ve fototoksisite doğası için, kayıtların süresi yanı sıra kayıt gerçek zamanlı süreklilik. Diğer bir deyişle, kayıtlar genellikle bu istenmeyen yan etkileri önlemek için aralıklı olarak gerçekleştirilmelidir. Çünkü bu zorlukların, kalsiyum görüntüleme ek alternatif yöntemler geliştirilmiştir. En umut verici yöntemlerden biri kalsiyum bağlama sonra enzimatik reaksiyon ile üretilen ışık dayanır biyoluminesen görüntüleme vardır. Bioluminescent görüntüleme geleneksel kalsiyum görüntüleme aynı zorluklar yaşamaya değil dolayısıyla hafif uyarma gerektirmez ve etmez. Bio-ışıldar haberci Aequorin - Aequorea victoria izole λ (GFP da isolated- edildiği aynı Jellyfish üç EF ayak yapılarının ile kalsiyum bağlanır ve kofaktörü koelenterazin oksidasyonu ve mavi ışık serbest bırakılmasına yol açacak bir konformasyonal değişiklik geçirmektedir = 469 nm) 2,3. Aequorin çok az arka plan gürültü üreten ve hücre içi kalsiyum tamponlama sistemi 4 ile karışmaz çünkü geçici kalsiyum kontrolü için ideal hale getirir, kalsiyum (Kd = 10 uM) için çok düşük bir çekicilikleri vardır. Aequorin önce Xenopus yumurta 5 üretilen ışık nöral indüksiyon sürecini izlemek için kullanılır olmasına rağmen nöronal aktivitenin gerçek zamanlı görüntüleme için kullanmak için çok loş. Bu meydan okuma, Philippe Br &amp; gidermek için bir çaba içinde251., Pasteur Enstitüsü&#39;nde izin ve arkadaşları denizanası 4 içinde yerli devlet taklit, GFP füzyon ve genleri Aequorin bir genetik yapının yarattı. Bu füzyon gen ürünü GFP olmayan radyatif enerjiyi aktaran koelenterazin, oksidasyonu için önde gelen bir yapısal değişikliğe uğrar aequorin üç EF eli yapıları, üzerinden tekrar kalsiyumu bağlar. Yerine aequorin mavi ışık GFP yeşil ışık (λ = 509 nm) sürümünde bu enerji transfer sonuçları. GFP ve aequorin füzyon aynı zamanda tek başına 4 Aequorin daha 19 65 kat daha parlak füzyon proteini üretmek ışık yardımcı büyük protein stabilitesini bahşeder. Beynin içinde bir biyolüminesens yaklaşımı kullanarak sürekli kayıt süresi ve kaydedilebilir beyin içindeki yapıların sayısı bakımından hem de kalsiyum görüntüleme mevcut deneysel uygulama genişletir. Geniş önceki çalışmaları bağlamında bu hem küresel hem de daha büyük bir anlamıBeynin bölgeselleştirilmiş &quot;etkinliği&quot; çeşitliliği (kalsiyum transientler proxy üzerinden) izlenebilir. Daha da önemlisi aktivite kolaylıkla beyinde bazal fonksiyon tam bir anlayış peşinde kendisini ödünç bir gerçek zamanlı ve sürekli olarak, içinde, daha uzun süre izlenebilir. Son birkaç yıl içinde, laboratuar ve diğerleri, ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında GFP-Aequorini (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5,6 ifade eden transgenik sinekler geliştirdik. Biz doğrudan nikotinik uygulama 9 ile asetilkolin reseptör stimülasyonu aşağıdaki mantar organları Ca 2+ -Aktiflik modüle gibi kokusu 7,8 gibi doğal uyaranlara yanı sıra çalışılan hücresel bileşenleri tarafından üretilen kayıt faaliyetine GFP-aequorin biyoparlaklık kullandık. Buna ek olarak, biz de uzun vadeli gibi önceden ele alınması mümkün olmamıştır deneysel sorular, bir dizi adrese GFP-Aequorini kullanmışSpontan kalsiyum geçici ve derin beyin yapıları 10 görselleştirme görüntüleme. Daha yakın zamanlarda, biz memeli ATP reseptör P2X 2 11 projeksiyon nöronlarının bir katyon kanalı, (PNS) ifade GAL4 / UAS sistemi kullanılmaktadır ve (MB247-LeXA mantar organları GFP-Aequorini ifade etmek LeXA sistemini kullandık, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. Pfeiffer, Janelia Çiftliği, ABD) bir nezaket. Bu bize böyle bir koku uyarana karşı tepki olarak daha doğal koşullar, taklit, sırayla mantar organları (PNS bir aşağı hedef) aktive ATP, uygulanmasıyla Fiziksel Durum etkinleştirmek için izin verdi. Genel olarak bu P2X 2 birleştirerek tekniği ve GFP-aequorin deneysel olanakları genişletir. Geniş farklı uyaranlar ve tedirginlikler faaliyet bazal desenlendirme değiştirebilir nasıl yeni çalışmaları başlatarak, daha beyindeki aktivite kalıplarını anlamak için bir fırsat sunuyor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1023911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL&#160;</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>26 764.298</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>25 108.295</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzyl-coelenterazine</td>
			<td>Prolume, nanolight&#160;</td>
			<td>Cat #301 Coelenterazine h</td>
			<td>http://www.prolume.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>46954</td>
			<td>Protemp&#8482; IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>36958</td>
			<td>Express&#8482; 2 Regular Body Quick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>122s</td>
			<td>3M Scotch Magic Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>4868</td>
			<td>100-1000&#181;L Univesal Pipette Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chamber and holder (stage)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation box</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (No 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue applicator&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>5mm Depth 15&#176; stab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td>iXon (cooled to -80&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse-E800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20x Fluor .5w</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection microscope with fluorescence</td>
			<td>Leica MZ Fl III</td>
			<td>N/A</td>
			<td>leica dissection scope and florescent lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tight dark box</td>
			<td>Science Wares</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom built by Science Wares</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Minipuls 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>depends on thickness</td>
			<td>Tygon R3603, St-Gobain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0135 &#160;(VC-66CS)</td>
			<td>Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion regulators</td>
			<td>Leventon</td>
			<td>201108</td>
			<td>Dosi-flow 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>measurement and automation explorer</td>
			<td>Sciences Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon imager&#160;</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon viewer</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instuments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software https://www.microsoft.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>virtual dub</td>
			<td>open access&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://virtualdub.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-GA2</td>
			<td>Martin et al., 2007, Ref. 1&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&#160;&#160;</td>
			<td>B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.&#160;</td>
			<td>(STOCK #1117340)</td>
			<td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2X2</td>
			<td>Lima and Misenboeck, Ref. 11&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OK107</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>854</td>
			<td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin

In vivo görüntüleme Fonksiyonel fonksiyonu ve beyin hücreleri ve ilgi yapıların fizyolojisi incelemek için güçlü bir yaklaşım haline gelmiştir. En son ışıldar haberci GFP Aequorini (GA) kullanılarak -imaging Ca 2 yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Kofaktörü koelenterazin ilavesi ile - - foton toplayıcı ile izlenebilir parlak ışık yayan Bu yeni teknik kalsiyum bağlanması ve bir moleküldür üreten GFP ve aequorin genlerin füzyonu kullanır. GFP-aequorin geni taşıyan transjenik çizgiler fareler ve Drosophila hem de üretilmiştir. Drosophila olarak, GFP-aequorin geni beyin içinde hedeflenen ifade ve görüntüleme için izin GAL4 / UAS ikili sentezleme sisteminin kontrolü altında yerleştirilmiştir. Bu yöntem, daha sonra tespit etme kabiliyetine sahip olduğu gösterilmiştir hem Ca içeri 2 + -transients ve Ca +2, iç depolardan -released. En önemlisi de sürekli kayıt, beynin içinde büyük derinliklerde görüntüleme daha büyük bir süre için izin verir, ve (8.3 milisaniye kadar) yüksek temporal çözünürlükte kayıt. Burada kayıt ve Ca mantar organları içinde 2+ -Aktiflik, sinek beyinde öğrenme ve hafıza merkezi bir yapı analiz etmek bioluminescent görüntüleme kullanılarak temel yöntem mevcut.

Aequorin için GFP füzyon bize mikroskobu (Şekil 3A, 4A, 6A, 6E) üzerinde floresan modunda GFP uyarma yoluyla önce biyolüminesans görüntüleme ilgi bölgemize görüntülemenizi sağlar. Mantar organları uyarmak için en basit yollarından birisi, iyonotropik nikotinik asetilkolin reseptörlerinin aktivasyonu yoluyla. Asetilkolin Bu, alıcının endogen liganddır, ancak biz, nikotin mantar organlarında daha çoğaltılabilir bir yanıt ürettiği bulunmuştur. Onlar özellikle nikotinik asetil...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin at JoVE.com

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir.

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

in-vivo-functional-brain-imaging-approach-based-on-bioluminescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

12.2K Görüntüleme.  UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud.  Burada bir biyolüminesens muhabir kullanarak yaklaşım -imaging bir roman Ca 2 + sunuyoruz. Bu yaklaşım, Ca2 + bağlanan ve hafif uyarılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, ışık yayan bir kaynaşık konstrukt GFP Aequorini kullanır. Anlamlı bu yöntem derin beyin yapıları ve yüksek temporal çözünürlük uzun sürekli görüntüleme, erişime izin verir. 

Video: In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

Kortikal Ağları Geliştirme Fonksiyonel Kalsiyum Görüntüleme

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

Nörobilim

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Eşzamanlı Elektrofizyolojik Kayıt ve Suprakiazmatik Nucleus Nöronlar Kalsiyum Görüntüleme

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Nöronal Dendrites beyin dilimleri içinde iki fotonlu kalsiyum görüntüleme

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in the taste sensory organ. By integrating microfluidics into the intravital tongue imaging window, the &#181;Tongue provides reliable functional images of taste cells in vivo under controlled exposure to multiple tastants. In this paper, a detailed step-by-step procedure to utilize the &#181;Tongue system is presented. There are five subsections: preparing of tastant solutions, setting up of a microfluidic module, sample mounting, acquiring functional image data, and data analysis. Some tips and techniques to solve the practical issues that may arise when using the &#181;Tongue are also presented.

 &#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

The article introduces the &#181;Tongue (microfluidics-on-a-tongue) device for functional taste cell imaging in vivo by integrating microfluidics into an intravital imaging window on the tongue.

μTongue: Dil In Vivo için Mikroakışkan tabanlı fonksiyonel görüntüleme platformu

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...