Bu protokol, aynı farede geniş alan ve tek hücreli rezervasyon etkinliklerini ölçmek için büyük bir kafatası penceresinin oluşturulmasını gösterir. Yöntemimizi kullanarak, büyük ve stabil kafatası penceresi gıda ambalajı ile düşük maliyetle yapılabilir. Bu yöntem, makroskobik ve mikroskobik seviyelerde davranış sırasındaki nöral ve glial aktiviteleri incelemek için etkilidir.
Küçük bir kafatası penceresi ile başlamanız önerilir. Sonra başarılı olursa, pencerenin boyutunu artırın. Kafatasının üzerindeki ekstra çimentoyu bir diş matkabı ile çıkararak başlayın.
Kesilecek alanı kalemle işaretleyin. Ucun kafatasına nüfuz etmemesini sağlamak için künt uçlu bir neşter kullanarak kemiğe kesin. Kesilecek bölgedeki kemik hafifçe dokunulduğunda hareket edene kadar oluğu derinleştirmek için kemiği tekrar tekrar bir neşterle kazıyın.
Kesilmiş kemiği ince cımbızla çıkarın. Beyne zarar verebilecek kemik kapağını beyne itmemeye dikkat edin. Dura materini çıkarmak için, yaklaşık 10 mikrometre konik uçlu çekilmiş bir cam pipet kullanarak durayı kesin.
Bu kesimi tüm pencereye genişletmek için U şeklinde bir iğne kullanın. 60 ila 100x yakınlaştırmada ayarlanmış bir stereo mikroskop altında, kopmuş dura mater'i ultra ince cımbızla çıkarın. Kanama durumunda, aCSF ile durulayın veya kanamayı durdurmak için jelatin sünger kullanın.
Daha sonra, büyük bir PVDC sargı parçasını otoklavlama ve% 70 etanol ile sterilize edin. Bir stereo mikroskop altında, gerekli boyutta bir sargıyı kesmek için cımbız ve neşter kullanın. aCSF'yi yüzeyde bırakırken sargıyı beyin yüzeyine yerleştirin.
aCSF'yi sargının kenarından emerek sargının beyin yüzeyine sıkıca yapışmasını sağlayın. Sargıyı bir neşter ve cımbızla kesin, böylece kafatası penceresinin kenarı ile sargı arasında yaklaşık bir milimetre boşluk kalır. Sargı yerine oturduğunda, sargının kenarını biyolojik bir yapıştırıcı ile kafatasına yapıştırın.
Yapıştırıcının yaklaşık 30 dakika kurumasını bekleyin. Karıştırma uçlu bir dağıtıcı kullanarak, sargının üzerine şeffaf bir silikon elastomer uygulayın. 0,12 ila 0,17 milimetre kalınlığındaki kapak camını üstüne yerleştirin.
Kapak camının çevresini su geçirmez film, süper yapıştırıcı veya diş çimentosu ile kapatın. İlk olarak, fibroin ve AAV çözeltilerini küçük bir numune tüpünde bir ila dört oranında karıştırın. Çözeltinin bir aliquot'unu kafatası penceresi için plastik sargının üzerine bırakın ve en az üç saat kurulayın.
Ardından, sargıyı önceki bölümde gösterildiği gibi beyin yüzeyine takın. Farelerin ve pencerelerin durumunu iki ila dört hafta düzenli olarak kontrol edin. Bu zamana kadar, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, AAV ile tedavi edilen pencereyi oluşturduktan sonra yeterince ifade edilecektir.
Bu protokolü kullanarak, kafatası pencereleri 10 farenin sekizinde 10 haftaya kadar korunabilir. Astrositlerde membrana tutturulmuş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesini ifade eden transgenik bir farede plastik sargı, şeffaf silikon ve kapak camı ile geniş bir pencere oluşturulur. Bu pencereden geniş alan kalsiyum görüntülemesi yapıldı ve karşıt bıyıklara hava puf stimülasyonu uygulandığında floresan değişiklikleri gözlendi.
Somatosensoriyel korteksteki floresan değişiminin zaman seyri kortikal aktivite gösterdi. İki fotonlu görüntüleme, glial hücrelere özgü tek hücreli floresan görüntülerin gözlemlenmesine izin verdi. Duyusal stimülasyonun neden olduğu floresan değişiklikleri, farklı kortikal bölgelerden gelen bireysel hücrelerde gözlendi.
Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesini ifade eden AAV ile kodlanmış sargı; ve kraniyal pencereyi yapmak için fibroin kullanıldı. Geniş alan kalsiyum görüntüleme, ameliyattan iki ila dört hafta sonra duyusal stimülasyonun neden olduğu korteks boyunca yayılan kortikal aktiviteyi gösterdi. Pencere büyük olduğundan, aynı farenin farklı kortikal alanları görüntülendi ve bireysel hücrelerde duyusal stimülasyonun neden olduğu floresan değişiklikleri görüldü.
Kraniyal pencere yaparken beyne zarar gelmesini önlemek önemlidir. Büyük bir kafatası penceresine sahip fareler üzerinde davranış görevleri gerçekleştirilebilir. Bu, sinirsel aktivite ve fare davranışı arasındaki ilişkinin incelenmesine izin verecektir.
Bu yöntem çeşitli sinirbilim çalışmalarına uygulanabilir. Örneğin, karar verme görevleri, motor çalıştırma ve beyin hasarı ve hastalığının kitlesel modellerinde kortikal aktiviteyi gözlemlemek için kullanılabilir.
