We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil R&#233;gional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.

샘플 1. 준비 <ol><li> 솔루션의 준비 및 설정 <ol><li> 표준 음식 매체에 24 ° C에서 모든 초파리 라인을 유지한다. 후면과 유리 병에 낮은 밀도를 유지하는 표준화 된 크기와 파리의 무게를 생성합니다. <ol><li> 유리 병에 10 명의 남성과 10 명의 여성을 처녀 추가, 그들이 짝짓기를하게하고 신선한 유리 병에 2 일마다 전송할. 파리 eclose 시작하면을 10 일 후, 매일 파리를 수확. 파리의 나이에 대한 정확한 기록을 유지하고 좋은 상태로 보관하십시오. </li><li> 3 일에, 여성에서 남성을 분리하고 여성에게 유리 병 당 20 파리를 유지합니다. 4 오일 세에 파리를 기록합니다. </li></ol></li><li> 다음 농도의 링거액 조제 : 130 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을 2 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 HEPES, 및 36 mM의 수크로오스를 정확하게 7.3으로 용액의 pH를 조정한다. 25 μ의 관류 솔루션을 준비; 링거액에 M 니코틴 100 밀리미터의 KCl. </li><li> 경사에 (팁의 끝에서 약 35 °)를 면도날 모양의 팁을 사용하여 끝에서 1 ½ 센티미터 이상 초과베이스를 제거 : 1,000 μL 피펫 팁을 준비합니다. </li><li> 배양하는 동안 시료의 저장 상자 (23cm X 17cm X 8.5 cm)를 준비합니다. 그 준비가 완료되는에 샘플을 배치하는 작은 랙 장치 아래의 [샘플 탈수를 방지하기] 바닥에 물과 포화 두 스폰지 (12cm X 8cm X 3cm)을 놓습니다. </li><li> 그들은 GFP - 애큐 오린의 발현을 드라이브에 GAL4 라인의 UAS-GFP - 애큐 오린의 적어도 1 부 및 사본을 포함하도록 파리 샘플을 준비합니다. OK107 GAL4 라인 (주로 버섯 몸의 라인 구동 식)이 준비 UAS-GFP - 쿼린 교차된다. 주 : 상자의 내부를 방수이어야하고 외부는 배양 중에 코 엘렌 테라의 열화를 방지하기 위해 박스 들어가는 빛을 차단한다. </li></ol></li><li> 예습샘플 aration <ol><li> 얼음은 유리 바이알에 전달함으로써 초파리 마취 및 피펫 팁에 위치시키는 냉장 페트리 접시로 이동되기 전에 2 분 동안 얼음에 보관. 해부 현미경으로 얼음에 100 ml의 페트리 접시에 약간 적신 여과지에 피펫 팁을 준비합니다. </li><li> 부드럽게 집게 장소에 피펫 팁의 내부에 비행. </li><li> 부드럽게 밀어 머리가 팁의 가장자리를지나 완전히와 지느러미 영역이 부분적으로 팁의 형성 (그림 2B) 중에 제거 섹션에 의해 노출되도록 비행을 정렬 브러시를 사용하여. </li><li> 치과 용 접착제의 두 성분의 작은 (약 3-4 μL) 부분을 결합한다. 피펫 팁의 가장자리 주위에 다시 아래로 머리와 목을 전면 주위에 조심스럽게 접착제를 적용하고 - 머리의 왕관을 피하는. 2 분 동안 접착제 건조하자. </li><li> 기록 챔버 (그림 2D) 및 세대의 구멍을 통해 접착 플라이 장소 피펫 팁TLY 장소에 고정 키를 누릅니다. </li><li> 실리콘 접착제 (약 3-4 μL)의 두 가지 구성 요소를 결합합니다. 챔버와 피펫 팁 만나는 링거액의 누출을 방지하기 위해 가장자리를 따라 챔버의 평평한면에 접착제를 적용합니다. 2 분 동안 접착제 건조하자. </li></ol></li><li> 해부 <ol><li> 관류 채널 짧은 가장자리 위에 테이프를 부착하고, 챔버의 후면으로 연장. </li><li> 형광 램프 현미경 회전에서 해부 블록에 비행과 챔버를 놓습니다. 챔버에 링거액 정확하게 취하여 1 ml의. </li><li> 표피를 제거하는 미세 수술 용 칼을 사용합니다. 더듬이 지역에 머리 뒤쪽에서 평행하게 절개를합니다. 그런 다음, 이전 절개 접속 안테나 상기 수직 절개를 눈의 가장자리를 따라 절단. 머리 뒤쪽에 해당하는 최종 절개 평행 만든다. 표피 (그림 2C)를 제거하는 미세 날카로운 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게를 파악하는 좋은 날카로운 집게를 사용하여뇌와 [형광] 버섯 몸이 명확하게 가시화 될 때까지 떨어져 호흡기 조직을 노출 지워 거라고. </li><li> 조심스럽게 잡고 코 엘렌 테라의 침투를 허용하도록 뇌를 덮고 neuroepithelial 조직 끼지 매우 날카로운 집게를 사용합니다. 참고 : 또는 파파인 neuroepithelia 9 Permeabilize 하시려면하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 피펫을 사용하여 어두운 상자에 해부 및 장소 샘플에서 이물질을 제거하는 링거액로 두 번 씻어. </li><li> 챔버 내로 5 μM 벤질 엘렌 테라 함유 링거액 정확하게 취하여 1 ml의. 2 시간의 최소 실온에서 코 엘렌 테라와 배양을 상자를 닫고 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 영상 <ol><li> 설정 <ol><li> 기록 시스템을 시작 : 25 ° C에 현미경, 컴퓨터, 카메라 및 배수 시스템과 설정 방에 환경 관리를 켭니다. </li><li> 열기 측정 및 컴퓨터의 자동화 탐색기 프로그램. 클릭 &amp;#8220, 디바이스와 인터페이스 NI 모션 장치 &quot;에 두 번 클릭&quot; &quot;와에 마지막으로 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭&quot;PCI-7334 &quot;하고&quot;장치를 초기화 &quot;. </li><li> 광자 이미 저를 엽니 다. 새 폴더와 이름, 제 1 기록 파일을 만듭니다. 시스템이 작동하기 전에 카메라는 -80 ° C에 도달해야합니다. </li><li> 설정 관류 시스템 - 저수지의 KCl, 니코틴, 그리고 링거액을 추가하고 2 ml / 분에서 그렇게 각 솔루션 방전을 조정합니다. 실험을 시작하기 전에 링거액과 함께 씻으십시오. </li></ol></li><li> 샘플을 준비 <ol><li> 장소의 영상은 5 배 배율 현미경 마운트에 블록 접시를 탑재하고 구멍을 통해 채널로 관류 관을 삽입합니다. </li><li> 형광등 모드로 설정 한 후 현미경 센터와 초점 버섯 몸 (MB들)을 가지고. 20X 재 중심과 초점을 조정합니다. </li><li> 팁이되도록 배수 풀 위에 위치 배수 장치는 단지 abov 배수 션트의 높이를 조정전자 수영장, 적절한 배수를 보장하기 위해 30 초 동안 링거액을 실행합니다. </li><li> 빛으로부터 장치를 봉쇄하기 위해 방패를 아래로 당깁니다. 광자 이미 저에서 자동화 된 시스템을 사용하여 초점을 미세 조정과 매크로 블럭의 기준 형광 화상을 받아. </li></ol></li><li> 녹음 <ol><li> 원하는 녹화 속도 (50 밀리 초에서 최대 1 초 또는 그 이상)에 광자의 속도를 조정합니다. 선택 광자 모드와 오픈 셔터. 로그 항목에 기록 유전자형, 성별, 연령, 시료 번호. 투자 수익 (ROI) 상자를 클릭하고 컨트롤을 누른 상태에서 드래그하여 위치 투자 수익 (ROI)의 꽃받침과 세포 기관 (CCB)를 통해 상자와 중간 엽을 조정합니다. </li><li> (필요에 따라) 약 5 ~ 10 분 녹음 기준. </li><li> 1 분 동안 니코틴을 적용합니다. 로그에 시작 / 중지합니다. 5 분 링거액과 함께 씻으십시오. </li><li> 복구를 위해 5 분을 기다린의 KCl에게 로그 항목 및 타이머를 준비합니다. </li><li> 1 분 동안의 KCl을 적용합니다. 로그에 시작 / 중지합니다. 1 분 링거액과 함께 씻으십시오. </li><li> 스위치형광등 모드로, 최종 형광 이미지를 촬영하고, 링거액을 끕니다. </li><li> 를 눌러 &quot;정지&quot;. 대화 상자가 시스템을 차단 요청합니다. &quot;아니오&quot;녹음을 계속 선택합니다. </li><li> 열기 방패, 이동 배수 시스템, 5 배에 스위치 렌즈 목적은, 관류 튜브를 제거합니다. 무대에서 샘플 / 기록 요리를 제거 세척과 물을 두 번 렌즈를 닦아 20X 렌즈를 청소합니다. </li><li> 다음 촬영을 시작 프로그램 창 상단에있는 흰색 재생 버튼을 누릅니다. </li></ol></li></ol> 3. 분석 및 비디오 제작 <ol><li> 광자 값을 추출 <ol><li> 광자 분석 프로그램을 엽니 다 (예를 들면, 광자 뷰어) 열린 첫 번째 샘플 스프레드 시트 파일. </li><li> 디스플레이 제어 탭을 선택합니다. 컨트롤을 누른 상태에서 지역을 클릭하여 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. GFP 조명 CCB와 중간 엽을 포함하는 관심 지역의 크기, 방향 및 모양을 조정합니다. </li><li> 또한 추가및 클릭 &quot;투자 수익 (ROI)을 정의&quot;를 클릭하고 새로운 투자 수익 (ROI)을 만들 화면에 끌어 등 투자 수익 (ROI). </li><li> 광자 비디오를 재생할 수있는 &quot;동영상&quot;탭을 선택합니다. 원하는대로 &quot;초 폭&quot;과 &quot;초 단계&quot;를 조정합니다. 투자 수익 (ROI)의 배치가 필요에 따라 조정합니다. </li><li> GFP의 형광, 니코틴 반응과의 KCl 응답의 대표 스크린 샷을 선택합니다. 나중에 분석 및 비교를위한 프리젠 테이션 슬라이드에 자르기 스크린 샷 및 붙여 넣기 이미지. </li><li> &quot;초 폭&quot;과 초 기록 속도를 &quot;초 단계&quot;모두를 조정합니다. 자극 개시 전에 그냥 반응 종료 후 브래킷 영역으로 상단 패널에 회색 마커를 이동하여 분석의 길이를 선택합니다. </li><li> &quot;&gt; PLAY&quot;를 눌러 &quot;&lt;&lt; REW&quot;를 누르십시오 &quot;를 재생하는 동안보기를 일시 중단&quot;을 선택합니다. &quot;속도 차트를 계산&quot;원하는 라인의 색상이 투자 수익 (ROI)의 색상을 일치하도록 장치를 조정 탭을 선택합니다. </li><li> 분석이 완료되면키를 눌러 &quot;수출 속도 데이터를 계산합니다.&quot; 결합 기록의 CCB와 각 측면에서 관심의 중간 엽 영역의 선택 스크린 샷. 응답 이미지 슬라이드로 자르기 스크린 샷 및 붙여 넣기 이미지. 이 슬라이드는 나중에 최종 분석에 사용됩니다. </li></ol></li><li> 예 분석 : 세부 광자 추출 데이터의 분석을위한 하나의 방법 <ol><li> &quot;속도 수출 카운트&quot;폴더에 스프레드 시트 파일을 엽니 다. </li><li> 세포에게 시간과 분으로 시간을 표시하는 첫 번째 열에 표시된 시간을 포맷. </li><li> 샘플에 대한 해당 슬라이드를 참조. 시간과 두 대표의 ROI에 대한 열을 제외한 모든 값을 제거합니다. </li><li> 니코틴 자극 시작 시간을 결정 - 주에서 로그 항목 파일에서 사용할 수있는 시작하거나 하이라이트 값 이전에 추가 데이터를 제거 폴더 -. </li><li> CCB와 중간 엽과 마크 / 강조 모두 최고 / 최대 값을 찾습니다. </li><li> 모두에 대한 응답의 시작 및 종료 시간을 결정에서 시점을 사용하여 견적을 작성하여 CCB와 중간 엽 슬라이드에 응답을 그래프와이 점에 근접한 값의 변화에​​ 의해 실제 값을 선택 대응. CCB와 중간 엽 모두 이러한 점 사이의 영역을 강조 표시합니다. 또한, 9 매크로를 사용합니다. </li><li> 새 스프레드 시트에 한 실험군의 모든 샘플을 결합합니다. </li><li> 로우 값을 결정하여 피크에 맞추고 각 CCB 피크 값이다. 그 샘플 데이터를 다시 복사해야 대략 행 값을 결정하기 위해 가장 높은 로우 값에서 낮은 값을 뺀다. 모든 피크 값이 정렬되어 있는지 확인합니다. </li><li> 시트를 두 번 복사 한 중간 엽 열 또는 만 CCB 또는 중간 엽 값의 페이지를 만드는 CCB 열 중 하나를 삭제합니다. </li><li> 모든 CCB 응답이 끝난 후 데이터를 제거합니다. 4 행은 총 광자, 응답의 길이 (시간), 피크 진폭 및 응답 대기 시간을 표시 만듭니다. 복사하고 원본 아래에 다시 붙여 넣습니다. </li><li>응답 중 총 광자를 결정하기 위해 SUM 함수를 사용합니다. 응답의 길이를 결정하기 위해 COUNT 함수를 사용합니다. 복사 및 피크 진폭 값을 결정하는 가장 높은 값 셀을 연결합니다. COUNT 함수를 사용 - 응답의 시작 니코틴 관류의 선두로부터 선택 - 응답 대기 시간을 결정한다. </li><li> 초 단위로 속도를 기록하여 (모든 피크 진폭 제외) 다중 연결 기능을 사용하여 복사 값. </li><li> 그래서 (예 : 그림 5B, C, D)를 원하는 경우 바 / 박스 그래프 등 총 광자, 피크 진폭 및 응답의 길이로 계산 된 매개 변수에 대해 생성 될 수있다. </li><li> 원시 데이터 광자 응답 후 열에서 평균 함수를 이용하여 각 시점에 대한 원시 데이터 포인트의 평균. 평균 (SEM)의 표준 오차를 결정하는 단계와, 원하는 열 다음 시점에서 평균 광자 값의 각각에 대한 경우. </li><li> 평균 응답 PROFIL를 구성하는 평균 열을 사용CCB 샘플 그룹에 대한 전자 [그래프]. 이 x 축 값과 시간을 지정하는 열과 y 축으로서 평균 광자 값의 열을 선택하고 최종적 산점도 그래프 생성 도구를 선택 할까. </li><li> 중간 엽의 데이터로이 분석 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 비디오 이미지 만들기 <ol><li> 열기 광자 뷰어. </li><li> 선택 디스플레이 제어 탭을 선택합니다. 선택 제거 및 / 또는 그것을 최소화하기 위해 컨트롤을 유지하면서 투자 수익 (ROI)을 클릭합니다. </li><li> &quot;초 폭&quot;각 프레임의 콘텐츠를 결정하기 위해 원하는대로 (축적 시간)를 수정한다. </li><li> 각 프레임의 오버랩을 정의하기 위해 &quot;초 공정&quot;수정한다. </li><li> 프레스 &quot;&lt;&lt; REW&quot;다음 &quot;재생하는 동안 수출 전망&quot;을 &quot;재생&gt;&quot;를 선택합니다. 비디오 이미지는 .PNG 파일의 일련의 &quot;보기 수출&quot;폴더에 수출됩니다. </li></ol></li><li> 비디오 C위한 하나의 방법 : 가상 신참을 사용하여 비디오를 만들려면자세한 reation <ol><li> 이미지를 포함하는 뷰 수출 폴더에 &quot;resultats&quot;라는 새 폴더를 만듭니다. </li><li> 이미지의 폴더에 스크립트 (renommer.VBS)를 준비한다. </li><li> renommer.VBS 두 번 클릭하여 실행합니다. </li><li> 이미지는 자동으로 숫자로 이름을 변경하고 &quot;resultats&quot;폴더에 복사됩니다. </li><li> 열기 VirtualDub.exe. </li><li> 열려있는 비디오 파일을 선택합니다 - (연속 된 이미지가 자동으로로드됩니다) 첫 번째 이미지를 선택합니다. </li><li> 선택 비디오 - 원하는대로 선택 프레임 속도 조정. </li><li> 선택 비디오 - 선택 압축 반경으로 Cinepak이 코덱을 선택합니다. </li><li> 파일에서 동영상이 자동으로 생성됩니다 AVI로 저장을 선택합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Cabrero 등의 알에보고 여기에 제시된 최근에 개발 된 생물 발광 기반 GFP - 쿼린 접근 방식은 신장 별 모양의 세포와 같은 세포의 다른 종류뿐만 아니라 원하는 것처럼, 다른 신경 세포에 칼슘 -activity의 생체 내 기능을 녹음 할 수 있습니다. 2013 년 5. 수정, 문제점 해결, 추가 구성 요소, 그리고 중요한 단계 <p class...

기본적인 패턴과 뇌와 분리 된 구조 내에서 활동의 기능은 긴 신경 과학 분야 내에서 강렬한 연구의 영역이었다. 아마도 이러한 문제를 해결하는 데 이른 성공적인 방법 중 일부는 전기적 활성도의 변화를 직접 생리적 측정 하였다 -에 추가 기능을 가져왔다 (활동 프록시와 같은) 전압의 pH 또는 칼슘 농도의 변화의 라이브 영상을 허용하지만 다른 방법은 신경 활동 1의 연구. 이미징 기술은 감소 된 침습성 및 뇌 전체 구조물 내에 활동을 모니터하는 등의 장점을 가지고 다양한. 또한 과일을 포함하여 다루기 쉬운 유전학과 동물에 초파리, 같은 카멜레온, GCaMPs 등과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표의 개발을 비행 한 단일 신경 세포, 신경 세포의 인구 및 전체 뇌를 모니터링하는 연구를 허용 한구조. 전통적인 형광 칼슘 이미징 방법 (칼 모듈 린에 융합 CFP와 YFP) (칼 모듈 린에 융합 GFP) 또는 FRET을 GCaMPs를​​ 사용하는 동안 좋은 공간 및 시간 해상도를 제공하는 유용한 기술을 입증 한 빛 여기의 기본 프로세스는 실험에 몇 가지 제한을 낳는다 응용 프로그램. 이에 의한 묘화 될 수 구조물의 깊이를 제한 불가피하게 생성되는 여기 광, 형광도, 광 표백제 및 광독성의 특성에, 녹화 시간뿐만 아니라 기록 실시간 연속성. 즉, 이러한 기록은 종종 바람직하지 않은 부작용을 방지하기 위해 간헐적으로 수행되어야한다. 이러한 어려움 때문에, 칼슘의 이미징 추가적인 다른 방법이 개발되었다. 가장 유망한 방법 중 하나는 칼슘 결합 후 효소 반응을 통해 제조 된 광 생물 발광 이미징에 의존한다. BioluminescenT 영상은 기존의 칼슘 이미징과 같은 문제가 발생하지 않습니다 결과적으로 빛 자극을 필요로하지 않습니다. 발광 생물 기자 쿼린 - 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터 격리 λ (GFP는 isolated-되었던 같은 해파리는 세 EF 손 구조를 통해 칼슘을 결합하여 그 보조 인자의 코 엘렌 테라의 산화와 푸른 빛의 방출로 이어지는 구조적인 변화를 겪게 = 469 ㎚) 2,3. 에 쿼린은 거의 배경 잡음을 생성 및 세포 내 칼슘 버퍼링 시스템 (4)과 간섭하지 않기 때문에 칼슘 과도 모니터링 이상적 칼슘 (K의 D = 10 μM)에 대한 매우 낮은 친화도를 갖는다. 쿼린 나란히 Xenopus의 달걀 5 제조 비추어 신경 유도의 과정을 모니터링하는 데 사용되었지만, 신경 세포 활성도의 실시간 영상에 사용하기에 너무 희미하다. 이 도전 필립 브롬 및 해결하기위한 노력# 251; 파스퇴르 연구소의하자 동료들은 해파리 4에서 기본 상태를 모방, GFP 융합 유전자를 쿼린 유전자 구조를 만들었습니다. 이 융합 유전자 생성물은 GFP에 비방 에너지 전송 엘렌 테라, 산화 선도 형태 적 변화를 겪게 쿼린의 세 EF 손 구조를 통해 다시 칼슘을 결합한다. 대신 쿼린에서 푸른 빛의 GFP에서 녹색 빛 (λ = 509 ㎚)의 릴리스에서이 에너지 전달의 결과. GFP 및 쿼린의 융합은 혼자 4 쿼린보다 19-65 배 더 밝은 융합 단백질 생산 등을 돕는 큰 단백질의 안정성을 부여한다. 뇌 내의 생물 발광 방식을 사용하는 것은 연속적인 기록 기간 및 기록 할 수있다 뇌 내의 구조의 수의 관점에서 모두 칼슘 이미징 실험의 전류 프로그램을 확장한다. 대체로 기존 연구의 맥락에서 그것은 그 두 세계와 더 큰 의미뇌의 지역화 &quot;활동&quot;의 다양한 (칼슘 과도의 프록시를 통해) 모니터링 할 수 있습니다. 더 중요한 활성 용이 뇌 기저 함수의 완전한 이해를 추구라는 것으로 실시간으로 지속적에서는 이상을 감시 할 수있다. 지난 몇 년간, 본 연구실 및 다른 바이너리 발현 시스템의 통제하에 GFP-쿼린 (GAL4 / UAS-GFP-쿼린) -5,6- 발현 형질 전환 초파리을 개발 하였다. 우리는 직접 니코틴 응용 프로그램 (9)에 의해 아세틸 콜린 수용체 자극 다음 버섯 몸에 칼슘 -activity 변조 등의 향기 7, 8 등의 천연 자극뿐만 아니라 공부 세포 성분에 의해 생성 된 기록 활동에 GFP - 쿼린 생물 발광을 사용했습니다. 또한, 우리는 또한 장기간 같은 이전 해결 될 수 없었다 실험 질문들을 해결하기 위해 GFP-쿼린을 사용한자연 칼슘 과도 깊은 뇌 구조 (10)의 시각화의 영상. 더 최근에, 우리는 포유류 ATP 수용체 P2X 2 11 프로젝션 뉴런 양이온 채널 (PN 수)를 표현하는 GAL4 / UAS 시스템을 사용하고 (MB247-LEXA를 버섯 체에서 GFP-쿼린을 표현 LEXA 시스템을 사용한, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. 파이퍼, Janelia 농장, 미국)의 의례. 이것은 우리가 같은 냄새 자극에 대한 반응으로 자연 조건을 모방 차례로 버섯 기관 (PN이의 다운 스트림 대상)를 활성화 ATP의 응용 프로그램에 의해 PN을 활성화 할 수있다. 전반적으로이 P2X이 결합 기술과 GFP - 쿼린은 실험 가능성을 확장합니다. 넓게는 다른 자극과 섭동 활동의 기저 패턴을 변경할 수있는 새로운 방법에 대한 연구를 시작,보다 뇌 활동의 패턴을 이해할 수있는 기회를 제공한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1023911000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7365-45-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCL&#160;</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>26 764.298</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>prolabo</td>
			<td>25 108.295</td>
			<td>normapur</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N3876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td>Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzyl-coelenterazine</td>
			<td>Prolume, nanolight&#160;</td>
			<td>Cat #301 Coelenterazine h</td>
			<td>http://www.prolume.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dental glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>46954</td>
			<td>Protemp&#8482; IV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicon glue</td>
			<td>3M ESPE&#8482;</td>
			<td>36958</td>
			<td>Express&#8482; 2 Regular Body Quick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape</td>
			<td>3M Scotch</td>
			<td>122s</td>
			<td>3M Scotch Magic Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette tips</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>4868</td>
			<td>100-1000&#181;L Univesal Pipette Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chamber and holder (stage)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation box</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps (No 5)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F4142</td>
			<td>Micro-dissecting forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glue applicator&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>hand made&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>knife</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10316-14</td>
			<td>5mm Depth 15&#176; stab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EM-CCD camera&#160;</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td>iXon (cooled to -80&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse-E800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>20x Fluor .5w</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection microscope with fluorescence</td>
			<td>Leica MZ Fl III</td>
			<td>N/A</td>
			<td>leica dissection scope and florescent lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tight dark box</td>
			<td>Science Wares</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom built by Science Wares</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Minipuls 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>depends on thickness</td>
			<td>Tygon R3603, St-Gobain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion system</td>
			<td>Warner</td>
			<td>64-0135 &#160;(VC-66CS)</td>
			<td>Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusion regulators</td>
			<td>Leventon</td>
			<td>201108</td>
			<td>Dosi-flow 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>measurement and automation explorer</td>
			<td>Sciences Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon imager&#160;</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>photon viewer</td>
			<td>Science Wares &#38; National Instuments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software https://www.microsoft.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>virtual dub</td>
			<td>open access&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>software http://virtualdub.sourceforge.net/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UAS-GA2</td>
			<td>Martin et al., 2007, Ref. 1&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&#160;&#160;</td>
			<td>B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.&#160;</td>
			<td>(STOCK #1117340)</td>
			<td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P2X2</td>
			<td>Lima and Misenboeck, Ref. 11&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td>&#160;No stocks {currently} publicly available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OK107</td>
			<td>Bloomington stock center</td>
			<td>854</td>
			<td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin

생체 내 이미징 기능은 기능과 뇌 세포와 관심의 구조의 생리를 연구 할 수있는 강력한 방법이되고있다. 최근 발광 생물-GFP 리포터 쿼린 (GA)을 사용 -imaging 칼슘의 새로운 방법이 개발되었다. 그 팩터 코 엘렌 테라의 첨가 - - 광자 수집기를 통해 모니터링 할 수 밝은 발광을이 새로운 기술은 칼슘과 결합 할 수있는 분자의 제조, 및 GFP 쿼린 유전자 융합에 의존한다. GFP-쿼린 유전자를 운반하는 형질 전환 계통은 마우스 및 초파리 모두에 대해 생성되었다. 초파리, GFP-쿼린 유전자는 뇌 내에서 표적 발현 및 이미징을 허용 GAL4 / UAS 진 발현 시스템의 통제하에 놓여있다. 이 방법은 연속적으로 검출 할 수있는 것으로 나타났습니다 모두 칼슘 안쪽 2+ -transients과 칼슘은 내 상점에서 -released. 가장 중요한 점은 연속 촬영, 뇌 내에서 더 깊이에서 영상에 더 큰 기간 동안 허용하고, (8.3 밀리 초까지) 높은 시간 해상도로 기록. 여기에서 우리는 기록하고 칼슘에게 버섯 기관 내에서 2 + -activity, 플라이 뇌의 학습과 기억의 중심 구조를 분석하는 생물 발광 영상을 사용하기위한 기본적인 방법을 제시한다.

쿼린에 GFP의 융합은 우리가 현미경 (그림 3A, 4A, 6A, 6E)에 형광 모드에서 GFP의 여기를 통해 이전에 생물 발광 영상에 관심이 우리 지역을 시각화 할 수 있습니다. 버섯 체를 자극하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이온 성 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 활성화를 통해서이다. 아세틸 콜린이 수용체의 내인성 리간드이지만 우리는 니코틴이 버섯 몸에 더 재현 반응을 생산하는 것으로 나?...

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In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

in-vivo-functional-brain-imaging-approach-based-on-bioluminescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

12.2K 조회수.  UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud.  여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다. 

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Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

두피 네트워크 개발에 기능성 칼슘 이미징

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

연구

신경과학

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

초음파 혈액 - 뇌 장벽 파괴 및 망간 향상된 MRI를 사용하여 기능성 Neuroimaging

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

두피 뉴런에서 생체 내 두 - 광자의 영상은 경험에 의존 분자 변경

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in regulating the intracellular calcium concentration. Changing environmental conditions, such as the light-dark cycle, can modify neuronal and neural network activity and the expression of a family of circadian clock genes within the suprachiasmatic nucleus (SCN), the location of the master circadian clock in the mammalian brain. Excitatory synaptic transmission leads to an increase in the postsynaptic Ca2+ concentration that is believed to activate the signaling pathways that shifts the rhythmic expression of circadian clock genes. Hypothalamic slices containing the SCN were patch clamped using microelectrodes filled with an internal solution containing the calcium indicator bis-fura-2. After a seal was formed between the microelectrode and the SCN neuronal membrane, the membrane was ruptured using gentle suction and the calcium probe diffused into the neuron filling both the soma and dendrites. Quantitative ratiometric measurements of the intracellular calcium concentration were recorded simultaneously with membrane potential or current. Using these methods it is possible to study the role of changes of the intracellular calcium concentration produced by synaptic activity and action potential firing of individual neurons. In this presentation we demonstrate the methods to simultaneously record electrophysiological activity along with intracellular calcium from individual SCN neurons maintained in brain slices.

Procedures are described to perform simultaneous recordings of membrane potential or current and changes of intracellular calcium concentration. Suprachiasmatic nucleus neurons are filled with the calcium indicator bis-fura-2 using a patch clamp electrode in the whole cell patch clamp configuration.

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory stimuli that mechanically deflect apical protrusions called hair bundles. Deflection opens mechanotransduction (MET) channels in hair bundles, leading to an influx of cations, including calcium. This cation influx depolarizes the cell and opens voltage-gated calcium channels located basally at the hair-cell presynapse. In mammals, hair cells are encased in bone, and it is challenging to functionally assess these activities in vivo. In contrast, larval zebrafish are transparent and possess an externally located lateral-line organ that contains hair cells. These hair cells are functionally and structurally similar to mammalian hair cells and can be functionally assessed in vivo. This article outlines a technique that utilizes a genetically encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6s, to measure stimulus-evoked calcium signals in zebrafish lateral-line hair cells. GCaMP6s can be used, along with confocal imaging, to measure in vivo calcium signals at the apex and base of lateral-line hair cells. These signals provide a real-time, quantifiable readout of both mechanosensation- and presynapse-dependent calcium activities within these hair cells. These calcium signals also provide important functional information regarding how hair cells detect and transmit sensory stimuli. Overall, this technique generates useful data about relative changes in calcium activity in vivo. It is less well-suited for quantification of the absolute magnitude of calcium changes. This in vivo technique is sensitive to motion artifacts. A reasonable amount of practice and skill are required for proper positioning, immobilization, and stimulation of larvae. Ultimately, when properly executed, the protocol outlined in this article provides a powerful way to collect valuable information about the activity of hair-cells in their natural, fully integrated states within a live animal.

The zebrafish is a model system that has many valuable features including optical clarity, rapid external development, and, of particular importance to the field of hearing and balance, externally located sensory hair cells. This article outlines how transgenic zebrafish can be used to assay both hair-cell mechanosensation and presynaptic function in toto.

애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징

Sensory hair cells are mechanoreceptors found in the inner ear that are required for hearing and balance. Hair cells are activated in response to sensory ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in the taste sensory organ. By integrating microfluidics into the intravital tongue imaging window, the &#181;Tongue provides reliable functional images of taste cells in vivo under controlled exposure to multiple tastants. In this paper, a detailed step-by-step procedure to utilize the &#181;Tongue system is presented. There are five subsections: preparing of tastant solutions, setting up of a microfluidic module, sample mounting, acquiring functional image data, and data analysis. Some tips and techniques to solve the practical issues that may arise when using the &#181;Tongue are also presented.