Name: in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin
Uploaded: 2016-01-08T15:00:01.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin at JoVE.com

We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil R&#233;gional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.

샘플 1. 준비 <ol><li> 솔루션의 준비 및 설정 <ol><li> 표준 음식 매체에 24 ° C에서 모든 초파리 라인을 유지한다. 후면과 유리 병에 낮은 밀도를 유지하는 표준화 된 크기와 파리의 무게를 생성합니다. <ol><li> 유리 병에 10 명의 남성과 10 명의 여성을 처녀 추가, 그들이 짝짓기를하게하고 신선한 유리 병에 2 일마다 전송할. 파리 eclose 시작하면을 10 일 후, 매일 파리를 수확. 파리의 나이에 대한 정확한 기록을 유지하고 좋은 상태로 보관하십시오. </li><li> 3 일에, 여성에서 남성을 분리하고 여성에게 유리 병 당 20 파리를 유지합니다. 4 오일 세에 파리를 기록합니다. </li></ol></li><li> 다음 농도의 링거액 조제 : 130 mM의 염화나트륨, 5 mM의 KCl을 2 밀리미터의 MgCl 2, 2 mM의 CaCl2를, 5 mM의 HEPES, 및 36 mM의 수크로오스를 정확하게 7.3으로 용액의 pH를 조정한다. 25 μ의 관류 솔루션을 준비; 링거액에 M 니코틴 100 밀리미터의 KCl. </li><li> 경사에 (팁의 끝에서 약 35 °)를 면도날 모양의 팁을 사용하여 끝에서 1 ½ 센티미터 이상 초과베이스를 제거 : 1,000 μL 피펫 팁을 준비합니다. </li><li> 배양하는 동안 시료의 저장 상자 (23cm X 17cm X 8.5 cm)를 준비합니다. 그 준비가 완료되는에 샘플을 배치하는 작은 랙 장치 아래의 [샘플 탈수를 방지하기] 바닥에 물과 포화 두 스폰지 (12cm X 8cm X 3cm)을 놓습니다. </li><li> 그들은 GFP - 애큐 오린의 발현을 드라이브에 GAL4 라인의 UAS-GFP - 애큐 오린의 적어도 1 부 및 사본을 포함하도록 파리 샘플을 준비합니다. OK107 GAL4 라인 (주로 버섯 몸의 라인 구동 식)이 준비 UAS-GFP - 쿼린 교차된다. 주 : 상자의 내부를 방수이어야하고 외부는 배양 중에 코 엘렌 테라의 열화를 방지하기 위해 박스 들어가는 빛을 차단한다. </li></ol></li><li> 예습샘플 aration <ol><li> 얼음은 유리 바이알에 전달함으로써 초파리 마취 및 피펫 팁에 위치시키는 냉장 페트리 접시로 이동되기 전에 2 분 동안 얼음에 보관. 해부 현미경으로 얼음에 100 ml의 페트리 접시에 약간 적신 여과지에 피펫 팁을 준비합니다. </li><li> 부드럽게 집게 장소에 피펫 팁의 내부에 비행. </li><li> 부드럽게 밀어 머리가 팁의 가장자리를지나 완전히와 지느러미 영역이 부분적으로 팁의 형성 (그림 2B) 중에 제거 섹션에 의해 노출되도록 비행을 정렬 브러시를 사용하여. </li><li> 치과 용 접착제의 두 성분의 작은 (약 3-4 μL) 부분을 결합한다. 피펫 팁의 가장자리 주위에 다시 아래로 머리와 목을 전면 주위에 조심스럽게 접착제를 적용하고 - 머리의 왕관을 피하는. 2 분 동안 접착제 건조하자. </li><li> 기록 챔버 (그림 2D) 및 세대의 구멍을 통해 접착 플라이 장소 피펫 팁TLY 장소에 고정 키를 누릅니다. </li><li> 실리콘 접착제 (약 3-4 μL)의 두 가지 구성 요소를 결합합니다. 챔버와 피펫 팁 만나는 링거액의 누출을 방지하기 위해 가장자리를 따라 챔버의 평평한면에 접착제를 적용합니다. 2 분 동안 접착제 건조하자. </li></ol></li><li> 해부 <ol><li> 관류 채널 짧은 가장자리 위에 테이프를 부착하고, 챔버의 후면으로 연장. </li><li> 형광 램프 현미경 회전에서 해부 블록에 비행과 챔버를 놓습니다. 챔버에 링거액 정확하게 취하여 1 ml의. </li><li> 표피를 제거하는 미세 수술 용 칼을 사용합니다. 더듬이 지역에 머리 뒤쪽에서 평행하게 절개를합니다. 그런 다음, 이전 절개 접속 안테나 상기 수직 절개를 눈의 가장자리를 따라 절단. 머리 뒤쪽에 해당하는 최종 절개 평행 만든다. 표피 (그림 2C)를 제거하는 미세 날카로운 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게를 파악하는 좋은 날카로운 집게를 사용하여뇌와 [형광] 버섯 몸이 명확하게 가시화 될 때까지 떨어져 호흡기 조직을 노출 지워 거라고. </li><li> 조심스럽게 잡고 코 엘렌 테라의 침투를 허용하도록 뇌를 덮고 neuroepithelial 조직 끼지 매우 날카로운 집게를 사용합니다. 참고 : 또는 파파인 neuroepithelia 9 Permeabilize 하시려면하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 피펫을 사용하여 어두운 상자에 해부 및 장소 샘플에서 이물질을 제거하는 링거액로 두 번 씻어. </li><li> 챔버 내로 5 μM 벤질 엘렌 테라 함유 링거액 정확하게 취하여 1 ml의. 2 시간의 최소 실온에서 코 엘렌 테라와 배양을 상자를 닫고 있습니다. </li></ol></li></ol> 2. 영상 <ol><li> 설정 <ol><li> 기록 시스템을 시작 : 25 ° C에 현미경, 컴퓨터, 카메라 및 배수 시스템과 설정 방에 환경 관리를 켭니다. </li><li> 열기 측정 및 컴퓨터의 자동화 탐색기 프로그램. 클릭 &amp;#8220, 디바이스와 인터페이스 NI 모션 장치 &quot;에 두 번 클릭&quot; &quot;와에 마지막으로 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭&quot;PCI-7334 &quot;하고&quot;장치를 초기화 &quot;. </li><li> 광자 이미 저를 엽니 다. 새 폴더와 이름, 제 1 기록 파일을 만듭니다. 시스템이 작동하기 전에 카메라는 -80 ° C에 도달해야합니다. </li><li> 설정 관류 시스템 - 저수지의 KCl, 니코틴, 그리고 링거액을 추가하고 2 ml / 분에서 그렇게 각 솔루션 방전을 조정합니다. 실험을 시작하기 전에 링거액과 함께 씻으십시오. </li></ol></li><li> 샘플을 준비 <ol><li> 장소의 영상은 5 배 배율 현미경 마운트에 블록 접시를 탑재하고 구멍을 통해 채널로 관류 관을 삽입합니다. </li><li> 형광등 모드로 설정 한 후 현미경 센터와 초점 버섯 몸 (MB들)을 가지고. 20X 재 중심과 초점을 조정합니다. </li><li> 팁이되도록 배수 풀 위에 위치 배수 장치는 단지 abov 배수 션트의 높이를 조정전자 수영장, 적절한 배수를 보장하기 위해 30 초 동안 링거액을 실행합니다. </li><li> 빛으로부터 장치를 봉쇄하기 위해 방패를 아래로 당깁니다. 광자 이미 저에서 자동화 된 시스템을 사용하여 초점을 미세 조정과 매크로 블럭의 기준 형광 화상을 받아. </li></ol></li><li> 녹음 <ol><li> 원하는 녹화 속도 (50 밀리 초에서 최대 1 초 또는 그 이상)에 광자의 속도를 조정합니다. 선택 광자 모드와 오픈 셔터. 로그 항목에 기록 유전자형, 성별, 연령, 시료 번호. 투자 수익 (ROI) 상자를 클릭하고 컨트롤을 누른 상태에서 드래그하여 위치 투자 수익 (ROI)의 꽃받침과 세포 기관 (CCB)를 통해 상자와 중간 엽을 조정합니다. </li><li> (필요에 따라) 약 5 ~ 10 분 녹음 기준. </li><li> 1 분 동안 니코틴을 적용합니다. 로그에 시작 / 중지합니다. 5 분 링거액과 함께 씻으십시오. </li><li> 복구를 위해 5 분을 기다린의 KCl에게 로그 항목 및 타이머를 준비합니다. </li><li> 1 분 동안의 KCl을 적용합니다. 로그에 시작 / 중지합니다. 1 분 링거액과 함께 씻으십시오. </li><li> 스위치형광등 모드로, 최종 형광 이미지를 촬영하고, 링거액을 끕니다. </li><li> 를 눌러 &quot;정지&quot;. 대화 상자가 시스템을 차단 요청합니다. &quot;아니오&quot;녹음을 계속 선택합니다. </li><li> 열기 방패, 이동 배수 시스템, 5 배에 스위치 렌즈 목적은, 관류 튜브를 제거합니다. 무대에서 샘플 / 기록 요리를 제거 세척과 물을 두 번 렌즈를 닦아 20X 렌즈를 청소합니다. </li><li> 다음 촬영을 시작 프로그램 창 상단에있는 흰색 재생 버튼을 누릅니다. </li></ol></li></ol> 3. 분석 및 비디오 제작 <ol><li> 광자 값을 추출 <ol><li> 광자 분석 프로그램을 엽니 다 (예를 들면, 광자 뷰어) 열린 첫 번째 샘플 스프레드 시트 파일. </li><li> 디스플레이 제어 탭을 선택합니다. 컨트롤을 누른 상태에서 지역을 클릭하여 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. GFP 조명 CCB와 중간 엽을 포함하는 관심 지역의 크기, 방향 및 모양을 조정합니다. </li><li> 또한 추가및 클릭 &quot;투자 수익 (ROI)을 정의&quot;를 클릭하고 새로운 투자 수익 (ROI)을 만들 화면에 끌어 등 투자 수익 (ROI). </li><li> 광자 비디오를 재생할 수있는 &quot;동영상&quot;탭을 선택합니다. 원하는대로 &quot;초 폭&quot;과 &quot;초 단계&quot;를 조정합니다. 투자 수익 (ROI)의 배치가 필요에 따라 조정합니다. </li><li> GFP의 형광, 니코틴 반응과의 KCl 응답의 대표 스크린 샷을 선택합니다. 나중에 분석 및 비교를위한 프리젠 테이션 슬라이드에 자르기 스크린 샷 및 붙여 넣기 이미지. </li><li> &quot;초 폭&quot;과 초 기록 속도를 &quot;초 단계&quot;모두를 조정합니다. 자극 개시 전에 그냥 반응 종료 후 브래킷 영역으로 상단 패널에 회색 마커를 이동하여 분석의 길이를 선택합니다. </li><li> &quot;&gt; PLAY&quot;를 눌러 &quot;&lt;&lt; REW&quot;를 누르십시오 &quot;를 재생하는 동안보기를 일시 중단&quot;을 선택합니다. &quot;속도 차트를 계산&quot;원하는 라인의 색상이 투자 수익 (ROI)의 색상을 일치하도록 장치를 조정 탭을 선택합니다. </li><li> 분석이 완료되면키를 눌러 &quot;수출 속도 데이터를 계산합니다.&quot; 결합 기록의 CCB와 각 측면에서 관심의 중간 엽 영역의 선택 스크린 샷. 응답 이미지 슬라이드로 자르기 스크린 샷 및 붙여 넣기 이미지. 이 슬라이드는 나중에 최종 분석에 사용됩니다. </li></ol></li><li> 예 분석 : 세부 광자 추출 데이터의 분석을위한 하나의 방법 <ol><li> &quot;속도 수출 카운트&quot;폴더에 스프레드 시트 파일을 엽니 다. </li><li> 세포에게 시간과 분으로 시간을 표시하는 첫 번째 열에 표시된 시간을 포맷. </li><li> 샘플에 대한 해당 슬라이드를 참조. 시간과 두 대표의 ROI에 대한 열을 제외한 모든 값을 제거합니다. </li><li> 니코틴 자극 시작 시간을 결정 - 주에서 로그 항목 파일에서 사용할 수있는 시작하거나 하이라이트 값 이전에 추가 데이터를 제거 폴더 -. </li><li> CCB와 중간 엽과 마크 / 강조 모두 최고 / 최대 값을 찾습니다. </li><li> 모두에 대한 응답의 시작 및 종료 시간을 결정에서 시점을 사용하여 견적을 작성하여 CCB와 중간 엽 슬라이드에 응답을 그래프와이 점에 근접한 값의 변화에​​ 의해 실제 값을 선택 대응. CCB와 중간 엽 모두 이러한 점 사이의 영역을 강조 표시합니다. 또한, 9 매크로를 사용합니다. </li><li> 새 스프레드 시트에 한 실험군의 모든 샘플을 결합합니다. </li><li> 로우 값을 결정하여 피크에 맞추고 각 CCB 피크 값이다. 그 샘플 데이터를 다시 복사해야 대략 행 값을 결정하기 위해 가장 높은 로우 값에서 낮은 값을 뺀다. 모든 피크 값이 정렬되어 있는지 확인합니다. </li><li> 시트를 두 번 복사 한 중간 엽 열 또는 만 CCB 또는 중간 엽 값의 페이지를 만드는 CCB 열 중 하나를 삭제합니다. </li><li> 모든 CCB 응답이 끝난 후 데이터를 제거합니다. 4 행은 총 광자, 응답의 길이 (시간), 피크 진폭 및 응답 대기 시간을 표시 만듭니다. 복사하고 원본 아래에 다시 붙여 넣습니다. </li><li>응답 중 총 광자를 결정하기 위해 SUM 함수를 사용합니다. 응답의 길이를 결정하기 위해 COUNT 함수를 사용합니다. 복사 및 피크 진폭 값을 결정하는 가장 높은 값 셀을 연결합니다. COUNT 함수를 사용 - 응답의 시작 니코틴 관류의 선두로부터 선택 - 응답 대기 시간을 결정한다. </li><li> 초 단위로 속도를 기록하여 (모든 피크 진폭 제외) 다중 연결 기능을 사용하여 복사 값. </li><li> 그래서 (예 : 그림 5B, C, D)를 원하는 경우 바 / 박스 그래프 등 총 광자, 피크 진폭 및 응답의 길이로 계산 된 매개 변수에 대해 생성 될 수있다. </li><li> 원시 데이터 광자 응답 후 열에서 평균 함수를 이용하여 각 시점에 대한 원시 데이터 포인트의 평균. 평균 (SEM)의 표준 오차를 결정하는 단계와, 원하는 열 다음 시점에서 평균 광자 값의 각각에 대한 경우. </li><li> 평균 응답 PROFIL를 구성하는 평균 열을 사용CCB 샘플 그룹에 대한 전자 [그래프]. 이 x 축 값과 시간을 지정하는 열과 y 축으로서 평균 광자 값의 열을 선택하고 최종적 산점도 그래프 생성 도구를 선택 할까. </li><li> 중간 엽의 데이터로이 분석 절차를 반복합니다. </li></ol></li><li> 비디오 이미지 만들기 <ol><li> 열기 광자 뷰어. </li><li> 선택 디스플레이 제어 탭을 선택합니다. 선택 제거 및 / 또는 그것을 최소화하기 위해 컨트롤을 유지하면서 투자 수익 (ROI)을 클릭합니다. </li><li> &quot;초 폭&quot;각 프레임의 콘텐츠를 결정하기 위해 원하는대로 (축적 시간)를 수정한다. </li><li> 각 프레임의 오버랩을 정의하기 위해 &quot;초 공정&quot;수정한다. </li><li> 프레스 &quot;&lt;&lt; REW&quot;다음 &quot;재생하는 동안 수출 전망&quot;을 &quot;재생&gt;&quot;를 선택합니다. 비디오 이미지는 .PNG 파일의 일련의 &quot;보기 수출&quot;폴더에 수출됩니다. </li></ol></li><li> 비디오 C위한 하나의 방법 : 가상 신참을 사용하여 비디오를 만들려면자세한 reation <ol><li> 이미지를 포함하는 뷰 수출 폴더에 &quot;resultats&quot;라는 새 폴더를 만듭니다. </li><li> 이미지의 폴더에 스크립트 (renommer.VBS)를 준비한다. </li><li> renommer.VBS 두 번 클릭하여 실행합니다. </li><li> 이미지는 자동으로 숫자로 이름을 변경하고 &quot;resultats&quot;폴더에 복사됩니다. </li><li> 열기 VirtualDub.exe. </li><li> 열려있는 비디오 파일을 선택합니다 - (연속 된 이미지가 자동으로로드됩니다) 첫 번째 이미지를 선택합니다. </li><li> 선택 비디오 - 원하는대로 선택 프레임 속도 조정. </li><li> 선택 비디오 - 선택 압축 반경으로 Cinepak이 코덱을 선택합니다. </li><li> 파일에서 동영상이 자동으로 생성됩니다 AVI로 저장을 선택합니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+imaging:+fluorescence+or+bioluminescence,+which+to+choose.">In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose.</a> J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxidized+coelenterazine,+the+active+group+in+the+photoprotein+aequorin.">Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+data+on+the+bioluminescent+protein,+aequorin.">Further data on the bioluminescent protein, aequorin.</a> J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).</li><li>Baubet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein-aequorin+as+bioluminescent+Ca2++reporters+at+the+single-cell+level.">Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).</li><li>Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biogenic+amine+and+a+neuropeptide+act+identically:+tyramine+signals+through+calcium+in+Drosophila+tubule+stellate+cells.">A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells.</a> Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).</li><li>Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+patterns+of+calcium+transients+during+neural+induction+in+Xenopus+laevis+embryos.">Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos.</a> J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).</li><li>Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Br&#251;let, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+bioluminescence+imaging+of+Ca2++signalling+in+the+brain+of+Drosophila.">In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila.</a> PLoS One. 2 (3), e275 (2007).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Ca2++stores+contribute+to+odor-induced+responses+in+Drosophila+olfactory+receptor+neurons.">Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons.</a> J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).</li><li>Murmu, M. S., Stinnakre, J., R&#233;al, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-stores+mediate+adaptation+in+axon+terminals+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+Drosophila.">Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 12, 105 (2011).</li><li>Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA+and+cAMP/CNG+channels+independently+regulate+the+cholinergic+Ca2+-response+of+Drosophila+mushroom+body+neurons.">PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons.</a> eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).</li><li>Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+functional+calcium+imaging+of+induced+or+spontaneous+activity+in+the+fly+brain+using+a+GFP-apoaequorin-based+bioluminescent+approach.">In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach.</a> BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).</li><li>Lima, S. Q., Miesenb&#246;ck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-emitting+properties+of+recombinant+semisynthetic+aequorins+and+recombinant+fluorescein-conjugated+aequorin+for+measuring+cellular+calcium.">Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium.</a> Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).</li><li>Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling:+dynamics,+homeostasis+and+remodelling.">Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).</li><li>Fiala, A., Spall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcium+imaging+of+brain+activity+in+Drosophila+by+transgenic+cameleon+expression.">In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression.</a> Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).</li><li>Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain.">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li><li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Olfactory+Representations+in+the+Drosophila+Antennal+Lobe.">Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe.</a> Science. 303 (5656), 366-370 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Cabrero 등의 알에보고 여기에 제시된 최근에 개발 된 생물 발광 기반 GFP - 쿼린 접근 방식은 신장 별 모양의 세포와 같은 세포의 다른 종류뿐만 아니라 원하는 것처럼, 다른 신경 세포에 칼슘 -activity의 생체 내 기능을 녹음 할 수 있습니다. 2013 년 5. 수정, 문제점 해결, 추가 구성 요소, 그리고 중요한 단계 <p class...

기본적인 패턴과 뇌와 분리 된 구조 내에서 활동의 기능은 긴 신경 과학 분야 내에서 강렬한 연구의 영역이었다. 아마도 이러한 문제를 해결하는 데 이른 성공적인 방법 중 일부는 전기적 활성도의 변화를 직접 생리적 측정 하였다 -에 추가 기능을 가져왔다 (활동 프록시와 같은) 전압의 pH 또는 칼슘 농도의 변화의 라이브 영상을 허용하지만 다른 방법은 신경 활동 1의 연구. 이미징 기술은 감소 된 침습성 및 뇌 전체 구조물 내에 활동을 모니터하는 등의 장점을 가지고 다양한. 또한 과일을 포함하여 다루기 쉬운 유전학과 동물에 초파리, 같은 카멜레온, GCaMPs 등과 같은 유전자 인코딩 칼슘 지표의 개발을 비행 한 단일 신경 세포, 신경 세포의 인구 및 전체 뇌를 모니터링하는 연구를 허용 한구조. 전통적인 형광 칼슘 이미징 방법 (칼 모듈 린에 융합 CFP와 YFP) (칼 모듈 린에 융합 GFP) 또는 FRET을 GCaMPs를​​ 사용하는 동안 좋은 공간 및 시간 해상도를 제공하는 유용한 기술을 입증 한 빛 여기의 기본 프로세스는 실험에 몇 가지 제한을 낳는다 응용 프로그램. 이에 의한 묘화 될 수 구조물의 깊이를 제한 불가피하게 생성되는 여기 광, 형광도, 광 표백제 및 광독성의 특성에, 녹화 시간뿐만 아니라 기록 실시간 연속성. 즉, 이러한 기록은 종종 바람직하지 않은 부작용을 방지하기 위해 간헐적으로 수행되어야한다. 이러한 어려움 때문에, 칼슘의 이미징 추가적인 다른 방법이 개발되었다. 가장 유망한 방법 중 하나는 칼슘 결합 후 효소 반응을 통해 제조 된 광 생물 발광 이미징에 의존한다. BioluminescenT 영상은 기존의 칼슘 이미징과 같은 문제가 발생하지 않습니다 결과적으로 빛 자극을 필요로하지 않습니다. 발광 생물 기자 쿼린 - 빅토리아 (Aequorea victoria)로부터 격리 λ (GFP는 isolated-되었던 같은 해파리는 세 EF 손 구조를 통해 칼슘을 결합하여 그 보조 인자의 코 엘렌 테라의 산화와 푸른 빛의 방출로 이어지는 구조적인 변화를 겪게 = 469 ㎚) 2,3. 에 쿼린은 거의 배경 잡음을 생성 및 세포 내 칼슘 버퍼링 시스템 (4)과 간섭하지 않기 때문에 칼슘 과도 모니터링 이상적 칼슘 (K의 D = 10 μM)에 대한 매우 낮은 친화도를 갖는다. 쿼린 나란히 Xenopus의 달걀 5 제조 비추어 신경 유도의 과정을 모니터링하는 데 사용되었지만, 신경 세포 활성도의 실시간 영상에 사용하기에 너무 희미하다. 이 도전 필립 브롬 및 해결하기위한 노력# 251; 파스퇴르 연구소의하자 동료들은 해파리 4에서 기본 상태를 모방, GFP 융합 유전자를 쿼린 유전자 구조를 만들었습니다. 이 융합 유전자 생성물은 GFP에 비방 에너지 전송 엘렌 테라, 산화 선도 형태 적 변화를 겪게 쿼린의 세 EF 손 구조를 통해 다시 칼슘을 결합한다. 대신 쿼린에서 푸른 빛의 GFP에서 녹색 빛 (λ = 509 ㎚)의 릴리스에서이 에너지 전달의 결과. GFP 및 쿼린의 융합은 혼자 4 쿼린보다 19-65 배 더 밝은 융합 단백질 생산 등을 돕는 큰 단백질의 안정성을 부여한다. 뇌 내의 생물 발광 방식을 사용하는 것은 연속적인 기록 기간 및 기록 할 수있다 뇌 내의 구조의 수의 관점에서 모두 칼슘 이미징 실험의 전류 프로그램을 확장한다. 대체로 기존 연구의 맥락에서 그것은 그 두 세계와 더 큰 의미뇌의 지역화 &quot;활동&quot;의 다양한 (칼슘 과도의 프록시를 통해) 모니터링 할 수 있습니다. 더 중요한 활성 용이 뇌 기저 함수의 완전한 이해를 추구라는 것으로 실시간으로 지속적에서는 이상을 감시 할 수있다. 지난 몇 년간, 본 연구실 및 다른 바이너리 발현 시스템의 통제하에 GFP-쿼린 (GAL4 / UAS-GFP-쿼린) -5,6- 발현 형질 전환 초파리을 개발 하였다. 우리는 직접 니코틴 응용 프로그램 (9)에 의해 아세틸 콜린 수용체 자극 다음 버섯 몸에 칼슘 -activity 변조 등의 향기 7, 8 등의 천연 자극뿐만 아니라 공부 세포 성분에 의해 생성 된 기록 활동에 GFP - 쿼린 생물 발광을 사용했습니다. 또한, 우리는 또한 장기간 같은 이전 해결 될 수 없었다 실험 질문들을 해결하기 위해 GFP-쿼린을 사용한자연 칼슘 과도 깊은 뇌 구조 (10)의 시각화의 영상. 더 최근에, 우리는 포유류 ATP 수용체 P2X 2 11 프로젝션 뉴런 양이온 채널 (PN 수)를 표현하는 GAL4 / UAS 시스템을 사용하고 (MB247-LEXA를 버섯 체에서 GFP-쿼린을 표현 LEXA 시스템을 사용한, 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (B. 파이퍼, Janelia 농장, 미국)의 의례. 이것은 우리가 같은 냄새 자극에 대한 반응으로 자연 조건을 모방 차례로 버섯 기관 (PN이의 다운 스트림 대상)를 활성화 ATP의 응용 프로그램에 의해 PN을 활성화 할 수있다. 전반적으로이 P2X이 결합 기술과 GFP - 쿼린은 실험 가능성을 확장합니다. 넓게는 다른 자극과 섭동 활동의 기저 패턴을 변경할 수있는 새로운 방법에 대한 연구를 시작,보다 뇌 활동의 패턴을 이해할 수있는 기회를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>1023911000</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>prolabo</td><td>26 764.298</td><td>normapur</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>prolabo</td><td>25 108.295</td><td>normapur</td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Nicotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>Adenosine 5&amp;prime;-triphosphate disodium salt hydrate</td></tr><tr><td>benzyl-coelenterazine</td><td>Prolume, nanolight&amp;nbsp;</td><td>Cat #301 Coelenterazine h</td><td>http://www.prolume.com/</td></tr><tr><td>dental glue</td><td>3M ESPE&amp;trade;</td><td>46954</td><td>Protemp IV</td></tr><tr><td>silicon glue</td><td>3M ESPE&amp;trade;</td><td>36958</td><td>Express 2 Regular Body Quick</td></tr><tr><td>tape</td><td>3M Scotch</td><td>122s</td><td>3M Scotch Magic Tape</td></tr><tr><td>pipette tips</td><td>Corning Incorporated</td><td>4868</td><td>100-1,000 &amp;micro;l Univesal Pipette Tip</td></tr><tr><td>chamber and holder (stage)</td><td></td><td></td><td>hand made</td></tr><tr><td>incubation box</td><td></td><td></td><td>hand made</td></tr><tr><td>forceps (No. 5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Micro-dissecting forceps</td></tr><tr><td>curved forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td>Micro-dissecting forceps</td></tr><tr><td>glue applicator&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>hand made&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>knife</td><td>Fine Science Tools</td><td>10316-14</td><td>5 mm Depth 15&amp;deg; stab</td></tr><tr><td>EM-CCD camera&amp;nbsp;</td><td>Andor</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td>iXon (cooled to -80 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Eclipse-E800</td></tr><tr><td>immersion objective lens</td><td>Nikon</td><td></td><td>20X Fluor .5w</td></tr><tr><td>dissection microscope with fluorescence</td><td>Leica MZ Fl III</td><td></td><td>leica dissection scope and florescent lamp</td></tr><tr><td>tight dark box</td><td>Science Wares</td><td></td><td>Custom built by Science Wares</td></tr><tr><td>peristaltic pump&amp;nbsp;</td><td>Gilson</td><td></td><td>Minipuls 2</td></tr><tr><td>tubing</td><td>Fisher Scientific</td><td>depends on thickness</td><td>Tygon R3603, St-Gobain</td></tr><tr><td>perfusion system</td><td>Warner</td><td>64-0135 &amp;nbsp;(VC-66CS)</td><td>Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel</td></tr><tr><td>perfusion regulators</td><td>Leventon</td><td>201108</td><td>Dosi-flow 3</td></tr><tr><td>measurement and automation explorer</td><td>Sciences Wares &amp;amp; National Instruments</td><td>N/A</td><td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>photon imager&amp;nbsp;</td><td>Science Wares &amp;amp; National Instruments</td><td>N/A</td><td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>photon viewer</td><td>Science Wares &amp;amp; National Instuments</td><td>N/A</td><td>software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>software https://www.microsoft.com</td></tr><tr><td>virtual dub</td><td>open access&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>software http://virtualdub.sourceforge.net/</td></tr><tr><td>UAS-GA2</td><td>Martin &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, 2007, Ref. 1&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>No stocks {currently} publicly available&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA.&amp;nbsp;</td><td>(STOCK #1117340)</td><td>pfeifferb@janelia.hhmi.org</td></tr><tr><td>P2X&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Lima and Misenboeck, Ref. 11&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>No stocks {currently} publicly available&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>OK107</td><td>Bloomington stock center</td><td>854</td><td>http://flystocks.bio.indiana.edu/</td></tr></tbody></table>

in vivo functional brain imaging approach based on bioluminescent calcium indicator gfp-aequorin

생체 내 이미징 기능은 기능과 뇌 세포와 관심의 구조의 생리를 연구 할 수있는 강력한 방법이되고있다. 최근 발광 생물-GFP 리포터 쿼린 (GA)을 사용 -imaging 칼슘의 새로운 방법이 개발되었다. 그 팩터 코 엘렌 테라의 첨가 - - 광자 수집기를 통해 모니터링 할 수 밝은 발광을이 새로운 기술은 칼슘과 결합 할 수있는 분자의 제조, 및 GFP 쿼린 유전자 융합에 의존한다. GFP-쿼린 유전자를 운반하는 형질 전환 계통은 마우스 및 초파리 모두에 대해 생성되었다. 초파리, GFP-쿼린 유전자는 뇌 내에서 표적 발현 및 이미징을 허용 GAL4 / UAS 진 발현 시스템의 통제하에 놓여있다. 이 방법은 연속적으로 검출 할 수있는 것으로 나타났습니다 모두 칼슘 안쪽 2+ -transients과 칼슘은 내 상점에서 -released. 가장 중요한 점은 연속 촬영, 뇌 내에서 더 깊이에서 영상에 더 큰 기간 동안 허용하고, (8.3 밀리 초까지) 높은 시간 해상도로 기록. 여기에서 우리는 기록하고 칼슘에게 버섯 기관 내에서 2 + -activity, 플라이 뇌의 학습과 기억의 중심 구조를 분석하는 생물 발광 영상을 사용하기위한 기본적인 방법을 제시한다.

쿼린에 GFP의 융합은 우리가 현미경 (그림 3A, 4A, 6A, 6E)에 형광 모드에서 GFP의 여기를 통해 이전에 생물 발광 영상에 관심이 우리 지역을 시각화 할 수 있습니다. 버섯 체를 자극하는 가장 간단한 방법 중 하나는 이온 성 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 활성화를 통해서이다. 아세틸 콜린이 수용체의 내인성 리간드이지만 우리는 니코틴이 버섯 몸에 더 재현 반응을 생산하는 것으로 나?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin at JoVE.com

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

발광 생물 칼슘 표시 GFP - 쿼린을 기반으로 생체 기능성 뇌 영상의 접근 방식

여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다.

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

in-vivo-functional-brain-imaging-approach-based-on-bioluminescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

12.2K 조회수.  UMR-9197, CNRS/Université Paris Sud.  여기서 우리는 발광 생물 기자를 사용하는 방법을 -imaging 소설 칼슘 2+ 제시한다. 이 방법은 칼슘 결합과 광 자극에 대한 필요성을 제거, 발광 구조물의 융합 GFP-쿼린을 이용한다. 중요한 것은이 방법은 깊은 뇌 구조와 높은 시간 해상도로 긴 연속 촬영, 접근을 허용한다. 

비디오: In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

연구

생물학

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

신경과학

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible are badly known. Excitotoxicity, a process believed to contribute to neuron damage induced by both insults, is mediated by activation of glutamate receptors that promotes Ca2+ influx and mitochondrial Ca2+ overload. A substantial change in intracellular Ca2+ homeostasis or remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis may favor neuron damage in old neurons. For investigating Ca2+ remodeling in aging we have used live cell imaging in long-term cultures of rat hippocampal neurons that resemble in some aspects aged neurons in vivo. For this end, hippocampal cells are, in first place, freshly dispersed from new born rat hippocampi and plated on poli-D-lysine coated, glass coverslips. Then cultures are kept in controlled media for several days or several weeks for investigating young and old neurons, respectively. Second, cultured neurons are loaded with fura2 and subjected to measurements of cytosolic Ca2+ concentration using digital fluorescence ratio imaging. Third, cultured neurons are transfected with plasmids expressing a tandem of low-affinity aequorin and GFP targeted to mitochondria. After 24 hr, aequorin inside cells is reconstituted with coelenterazine and neurons are subjected to bioluminescence imaging for monitoring of mitochondrial Ca2+ concentration. This three-step procedure allows the monitoring of cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to relevant stimuli as for example the glutamate receptor agonist NMDA and compare whether these and other responses are influenced by aging. This procedure may yield new insights as to how aging influence cytosolic and mitochondrial Ca2+ responses to selected stimuli as well as the testing of selected drugs aimed at preventing neuron cell death in age-related diseases.

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Intracellular Ca2+ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca2+ overload. We aimed at investigating Ca2+ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca2+ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model animal for endocrine research, Drosophila melanogaster, which has sophisticated genetic tools and genome information, is being increasingly used. This article describes a method for the calcium imaging of Drosophila brain explants. This method enables the detection of the direct signaling of a hormone to the brain. It is well known that many peptide hormones act through G-protein-coupled receptors (GPCRs), whose activation causes an increase in the intracellular Ca2+concentration. Neural activation also elevates intracellular Ca2+ levels, from both Ca2+ influx and the release of Ca2+ stored in the endoplasmic reticulum (ER). A calcium sensor, GCaMP, can monitor these Ca2+ changes. In this method, GCaMP is expressed in the neurons of interest, and the GCaMP-expressing larval brain is dissected and cultured ex vivo. The test peptide is then applied to the brain explant, and the fluorescent changes in GCaMP are detected using a spinning disc confocal microscope equipped with a CCD camera. Using this method, any water-soluble molecule can be tested, and various cellular events associated with neural activation can be imaged using the appropriate fluorescent indicators. Moreover, by modifying the imaging chamber, this method can be used to image other Drosophila organs or the organs of other animals.

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

This paper describes a protocol for ex vivo calcium imaging of the Drosophila brain. In this method, natural or synthetic compounds can be applied to the buffer to test their ability to activate particular neurons in the brain.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of individual cells. Since an increase of intracellular calcium (Ca2+) in the cytosol often occurs because of the electrical activity, or in response to a myriad of other stimuli, this process can be monitored by the imaging of cells loaded with fluorescent calcium-sensitive dyes.&#160; However, it is difficult to image this response in an individual cell type within whole tissue because these dyes are taken up by all cell types within the tissue. In contrast, genetically encoded calcium indicators (GECIs) can be expressed by an individual cell type and fluoresce in response to an increase of intracellular Ca2+, thus permitting the imaging of Ca2+ signaling in entire populations of individual cell types. Here, we apply the use of the GECIs GCaMP3/6 to the mouse neuromuscular junction, a tripartite synapse between motor neurons, skeletal muscle, and terminal/perisynaptic Schwann cells. We demonstrate the utility of this technique in classic ex vivo tissue preparations. Using an optical splitter, we perform dual-wavelength imaging of dynamic Ca2+ signals and a static label of the neuromuscular junction (NMJ) in an approach that could be easily adapted to monitor two cell-specific GECI or genetically encoded voltage indicators (GEVI) simultaneously. Finally, we discuss the routines used to capture spatial maps of fluorescence intensity. Together, these optical, transgenic, and analytic techniques can be employed to study the biological activity of distinct cell subpopulations at the NMJ in a wide variety of contexts.

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Here we present a protocol to image calcium signaling in populations of individual cell types at the murine neuromuscular junction.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

In Vivo Confocal Fluorescence Imaging of Neural Activity Induced by Sensory Stimulation in Partially Restrained Larval Zebrafish

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural circuitry facilitate the use of optogenetic techniques in cellular analyses of behavior. Fluorescent indicators of in vivo neural activity, such as GCaMP6s, have been widely used to study the neural activity associated with simple behaviors in larval zebrafish. Here, we present a protocol for detecting sensory-induced activity in semi-restrained zebrafish larvae using the transgenic line Tg(elav3:GCaMP6s). In particular, we use the chemical agent allyl isothiocyanate to induce a robust, reproducible fluorescent response in a brain region at the border of the hindbrain and spinal cord. We discuss the potential uses of GCaMP6s for optical monitoring of neural activity during a range of behavioral paradigms and the limitations of this technique. Our protocol outlines an accessible approach for monitoring dynamic, behavior-related in vivo neural activity in the larval zebrafish brain.

Here, we present a detailed protocol to examine neural activity in brain regions of transgenic zebrafish that express GCaMP calcium indicators using confocal microscopy.

생체 내 부분적으로 구속된 유충 제브라피시에서 감각 자극에 의해 유도된 신경 활동의 공초점 형광 이미징

Zebrafish larvae are a promising vertebrate model system for studying the neural mechanisms of behavior. Their translucence and relatively simple neural ...

Drosophila In Vivo Calcium Imaging: A Method for Functional Imaging of Neuronal Activity

Source: Hancock, C. E., et al. <a href="https://www.jove.com/video/60288/" target="_blank">In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster</a>. J. Vis. Exp. (2019).
This video describes in vivo calcium imaging in Drosophila neurons using GCaMP. The featured protocol clip shows how to record changes in GCaMP fluorescence from mushroom body neurons during an olfactory conditioning experiment.

초파리 In Vivo 칼슘 이미징: 뉴런 활동의 기능적 이미징 방법

Source: Hancock, C. E., et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).
...