Bu çalışma, Uyuşturucu (NIDA) hibe R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Yenilikçi Tohum Grant (DCC) ve NİDA eğitim hibe T32 DA017637 (MVB) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

1.. Virüs Depolama ve Hazırlama <ol><li> Kemirgen beyin opsin genleri teslim için çoğaltma-beceriksiz AAV vektörlerin kullanımı Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL1) için onaylanmış ve mevcut ABD Hükümeti yayın, Mikrobiyoloji ve Biyomedikal Laboratuvarlarda Biyogüvenlik, belirtildiği gibi uygun koruma ve taşıma prosedürleri gerektirir (Hastalık Kontrolü sitesi için Merkezleri <a href="http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm" target="_blank">http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm</a> ). </li><li> -80 ° C derin dondurucuda bir Sınıf II Biyogüvenlik Kurulu ve mağaza küçük çalışma kısma üreticinin viyalden tekrarlanan donma-çözülme döngüleri, pipet virüs önlemek için. </li><li> Önce stereotaktik enjeksiyon için, bir kısım buz üzerinde çözülme ve ardından kısa bir süre tezgah üstü santrifüj ile aşağı dönmesine izin verin. </li><li> Yavaş yavaş bir Hamilton şırınga, cam ya da mineral ve silikon yağı bir iğne ile küçük bir miktar dolgu.Emin şırınga varil görünür hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Bir mikropüskürtücü pompa içine şırınga takın ve dikey stereotaksik kol (yani stereotaksik manipülatör) doğrudan pompa takın. </li><li> Iğne ucu virüs kısım tüpün dibine değene kadar steryotaksik kolunu indiriniz. Virüs istenen hacmi (1 ul enjeksiyon için 1.5 ul) çekmek için mikroenjektör pompa kontrolörü kullanın. </li><li> Virüs ile temas eden tüm malzeme ve yüzeyler klorin çamaşır suyu (% 10) gibi bir dezenfektan ile dekontamine edilmelidir. </li></ol> 2. Cerrahi ve Virüs Enjeksiyon <ol><li> Bir ketamin ile anestezi hayvan (fare, 125 mg / kg, ip) - ksilazin (rat, 10 mg / kg, ip) kokteyli. Anestezi etkinliğini ölçmek için, bir ayak tutam refleks tepki için kontrol edin ve gerekirse ketamin ek doz verir. Standart aseptik cerrahi yöntemler kullanılarak, bir stereotaksik aparat (David Kopf olarak içine hayvan yerleştirinALETLER). </li><li> Küçük cerrahi makas veya neşter ile hayvan kafatası üstüne deri yoluyla bir orta hat kesi olun. Yavaşça bağ dokusu ayrı ve küçük bir kemik kazıyıcı ile kafatasının üst temizleyin. </li><li> Hayvanın baş z Bregma ve lambda koordinatları için böyle eşit düzeyde olduğunu doğrulayın. Böyle Stereotaksik Koordinatlarla Rat Beyin (George Paxinos ve Charles Watson, Academic Press, 2007) veya Fare Beyin Stereotaksik Koordinatlar (Keith BJ Franklin ve George Paxinos, Academic Press gibi bir beyin atlas hedef beyin bölgesi için steryotaksik koordinatlarını belirlemek , 2007). Bir cerrahi kalem ile enjeksiyon amaçlanan sitesi işaretleyin. </li><li> Dikkatlice ince bir el matkap kullanarak hedef alan üzerinde kafatası ve matkap kafatasının alt ulaştığında durdurun. Ekstra ince forseps bir çift kullanarak, dura açığa çıkarmak için inceltilmiş kemiği kaldırmak. </li><li> Hedef üzerinde şırınga iğnesi vardır yerleştirinBir ve dura dokunana kadar iğne düşük ve z koordinat hesaplamak için bu nokta kullanın. Uygun z konumuna ulaşana kadar çok yavaş beyin içine enjeksiyon iğnesi indirin. Bu protokolde, medial prefrontal korteksin prelimbic bölge veya dorsal subikulum bregmaya (-6.0 mm anterior (bregmaya 2.7 mm ön, orta hatta, ve dura den -2.2 mm yanal ± 0.5 mm), yanal 3,0 mm ± orta hat ve dura) den -2.0 mm&#39;lik bir yetişkin Sprague Dawley erkek sıçan (yaklaşık 275 gr) hedeflenmektedir. </li><li> 0.1 ul / dk &#39;lık bir hızda virüs enjekte edilir. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra beyin yüzeyine virüsün geri akışını önlemek için bir iğne çekilmeden önce 10 dakika bekleyin. </li><li> Cilt mühür ve yaraya uygulamak antibiyotik bağlanmış bir iğne ile bir dikiş dikiş kullanın. </li><li> AAV vektörleri ChR2 ve NpHR fonksiyonel ifadenin zamanı ders deneysel tasarım ve viral titreye bağlı olarak değişecektir. Bu deney için, in vivo </em&gt; kayıtları 18-21 gün sonrası enjeksiyon yapılmıştır. </li></ol> 3. Işık Teslimat ve ChR2 veya NpHR-ifade nöronlar vivo Kayıt olarak <ol><li> Süper yapıştırıcı kullanarak bir cam kapiller tüp (Fisher Scientific) için bir tungsten elektrot (~ 1-1.5 MQ, mikropiliye) takın. </li><li> Etanol ile bir modlu optik fiber (200 mikron çaplı karot, Thorlabs) ve temiz lif ucu çıplak ucu açığa bir fiber sıyırma aleti (Thorlabs) kullanın. Çok hafif bir kama şeklindeki elmas bıçakla (Thorlabs) ile fiber ucu puan ve dikkatlice (ince forseps ile örneğin) fazla lif çıkarın. Elyaf skor kolayca klivaj gerekir. </li><li> 200 mW tek diyot lazer (çıkış noktası üzerinde PC bağlantısı için fiber FC ucunu <a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> istenen dalga boyu ile). Lazerler ile çalışırken uygun koruyucu gözlük her zaman yıpranmış olduğundan emin olun. </li><li> L ölçünbir optik güç ölçer (kullanarak optik fiberin ucunda aser yoğunluk <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). In vivo kayıtları için, 20-100 mW / 2 mm kadar küçük bir ışık şiddeti güvenilir bir nöronal etkinlik, sırasıyla, ChR2 veya NpHR aracılı aktivasyonu veya susturulması uyandırabilir. </li><li> Kılcal tüp içine optik fiber yerleştirin. Yaklaşık 500 mikron tungsten elektrot ucu yukarıda lif ucu yerleştirin ve elektrot ve lif düz böylece ucuna yakın birkaç noktada iki kez ince bir dikiş ipliği kravat. Elektrot ucu ve en yakın düğüm arasındaki mesafe hedef bölgeye yerleştirilmesi için yeterince uzun olduğundan emin olun. </li><li> Adımda yukarıda 2.1 ve 2.2 &#39;de olduğu gibi hayvan hazırlayın. Optrode (konumlandırma için kafatasında yeni bir temiz küçük bir pencere yapmak için bir kılavuz olarak ilk kraniotomi kullanın <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> ). D küçük bir kesi yapmakura ince bir iğne ile. </li><li> Dikkatli bir mikromanipülatör (Narishige) ile transduse bölgeye pencereden kafatası ve beyin içine optrode indirin. Daha sonra, açık-cevap veren bir hücrenin ortaya çıkıncaya kadar 10-50 um adımlarla yavaşça optrode önceden. </li><li> Özel bir yazılım kullanıcı arabirimi (NeuroLux Pro <a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.Lumiphy.com</a> LabVIEW (National Instruments) yazılı) tek diyot lazer kontrol etmek ve devam eden nöral aktiviteyi görselleştirmek ve kaydetmek için kullanılır. Kaydedilmiş sinyalleri süzülmüş bir Examp-20K (Kation Scientific) amplifikatör bant-pass (0,3-8 kHz), ve dijital tahta (NI USB-6009) için National Instruments analog yakalanır. NeuroLux Pro kullanıcı arabirimi analog girişlerin seçimi ve dijital çıkışa (nöronal ve TTL sinyal için iki kanal seçin) verir. Kullanıcı örnekleme hızını (20 kHz), bazal dönemi (pre-ışık), ve post-ışık dönemi tanımlayabilir. Kullanıcı TTL lazer uyanm tanımlayabilirdarbe genişliği, frekans ve stimülasyon döneminde (frekansı 20 Hz ve stimülasyon süresi 500 msn ise, tanımlanan darbe genişliği ile 10 lazer darbeleri teslim edilir) üzerine. Kullanıcı ayrıca sürekli ışık dağıtımı tercih (örneğin, Şekil 1). Olabilir Tekrarlanan kayıtları için, kullanıcı da darbe trenlerin sayısını ve trenler arasındaki aralığı tanımlamak olabilir. Veri ya da diske kayıt olmadan elde edilebilir. </li><li> Kayıt sonra, hayvanlar, ketamin / ksilazin kokteyli ile anestezi uygulanır ve transcardially optrode yerleştirme ve opsin ifadesini doğrulamak amacıyla, fizyolojik tuzlu su ve paraformaldehit (% 4) ile perfüze edildi. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale,+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2 (3), e299 (2007).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses.">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons.">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+in+the+nonhuman+primate.">Optogenetics in the nonhuman primate.</a> Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).</li><li>Zhao, S., Ting, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function.">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li><li>Madisen, L., Mao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-activation+and+silencing.">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).</li><li>Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+patterns+in+the+localization+of+glutamic+acid+decarboxylase+and+Ca2+/calmodulin+protein+kinase+gene+expression+in+the+rat+central+nervous+system.">Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system.</a> Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).</li><li>McCown, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+in+the+CNS.">Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS.</a> Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).</li><li>Cardin, J. A., Carlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+optogenetic+stimulation+and+recording+of+neurons+in+vivo+using+cell-type-specific+expression+of+Channelrhodopsin-2.">Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2.</a> Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).</li><li>Cardin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+local+circuits+in+vivo:+Integrated+optogenetic+and+electrophysiology+approaches+for+exploring+inhibitory+regulation+of+cortical+activity.">Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity.</a> J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).</li><li>Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+optogenetic+silencing+of+orexin/hypocretin+neurons+induces+slow-wave+sleep+in+mice.">Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice.</a> J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).</li><li>Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+optogenetic+control.">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li><li>Chow, B. Y., Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+genetically+targetable+optical+neural+silencing+by+light-driven+proton+pumps.">High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps.</a> Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Tekniklerinin geniş bir dizi kemirgenler farklı beyin bölgelerine mikrobiyal opsin genleri genetik hedefleme için kullanılabilir. Viral gen verici hücre tipi spesifikliği olan ChR2 ve NpHR ifade aracılık için nispeten ucuz ve hızlı bir yaklaşım sağlar. AAV vektör sistemleri depolama, patojenli eksikliğine ve uzun vadeli gen ifadesini 10 üretme kabiliyetini esnasında stabil, yüksek üretim titreleri nedeniyle optogenetic deneylerde kullanılmak için ortak bir seçimdir. Hücre tipi özel promotörler ile opsin yapıları çoğu, Pennsylvania Üniversitesi (bir vektör çekirdek tesislerinden AAV serotiplerinin çeşitli ticari olarak temin edilebilir <a href="http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore" target="_blank">http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore</a> ) ya da üniversite Chapel Hill Kuzey Carolina ( <a href="http://genetherapy.unc.edu" target="_blank">http://genetherapy.unc.edu</a> ). AAV teknolojiye bir dezavantajıhücre-spesifik hedefleme için kullanılabilir transgen kaset büyüklüğüne bir kısıtlama yerleştirir sınırlı paketleme kapasitesi (~ 4.7 kb). Bir alternatif olarak, daha büyük bir ambalajlama kapasitesi lentiviral vektörler, daha büyük bir promoter dizilerinin kontrolü altında hedef opsin karşılamak mümkün bulunmaktadır. Bir optrode kullanımı geçici olarak hassas ışık teslimat ile kombinasyon halinde elektrofizyolojik sinyallerin güvenilir bir tespiti sağlar. Yukarıda tarif edildiği gibi, ancak, yeterli bakım yapısında gereklidir. Bölünmüş optik fiber kırılgan olduğu için, çok sıkı dikiş ipliği bağlama elyaf kırılmasına neden olabilir. Verilen ışık elektrot ve kalite empedans düşer, çünkü optrode tekrar kayıt için kullanılabilir olsa da, elektrot ve optik fiber ekleme işleminden önce temizlenir (veya el optik fiber çıplak ucunun durumunda klivaj) olmalıdır tekrarlanan kullanımı ile. Ele sırasındactrophysiological kayıtları bu optrode yavaş yavaş gelişmiş olması önemlidir. Burada kullanılan optrode yaklaşık 350 um kalınlığa sahiptir (tungsten elektrod: 125 um, optik elyafın çekirdek: 200 um) ve hızlı düşürülmesi beyin dokusu hareketine neden olabilir. Işık kaynaklı eserler de özellikle kayıt ve ışık dağıtım set-up 11-12 ile düşünülebilir. Bizim deneysel durumda ışık kaynaklı objeyi bulundu, ancak, transduse beyin alanının dışında kayıtları potansiyel açık eserler için bir kontrol olarak kullanılabilir. Kayıt işlemi sırasında başka bir husus, özellikle uzun süreli kayıtlar için, ChR2 veya NpHR ifade nöronlar değişikliklerin gözlenmesi için gerekli ışık yoğunluğudur. Güçlü lazer yoğunluğu ve uzun lazer aydınlatma doku hasarı ve / veya sonraki teslim ışık 12-13 azalan bir cevap neden olabilir. Davranışsal deney için bir kontrol viral vektörün kullanımı atılmaya için gereklidirg elyaftan teslim ısı nedeniyle herhangi bir etki. Ticari olarak temin edilebilen optogenetic yapıları çoğu için opsin gen sekansı kaldırıldı birbirini tamamlayan kontrol yapıları vardır. Bu ChR2 bazı deneysel sorular 14-15 için daha uygun olabilir, diğer susturma opsins birlikte geliştirilmiştir geliştirilmiş özellikleri ve kinetik değişkenler ile tasarlanmış olduğu dikkate alınmalıdır. Örneğin, hedeflenen mutagenesissin yoluyla kurulan yeni bir ChR2 varyant, &quot;Cheta&quot;, orijinal ChR2 14 yukarıda (en az 200 Hz kadar) frekanslarda yüksek sadakat nöronal smaç sürebilirim adlandırılır. In vivo ışık teslimat ve nöronal tepkilerin eş zamanlı kayıt kombinasyonu genetik hedefli hücre popülasyonları ve ilgili zaman kilitli davranışsal olaylar desenli aktivite arasındaki nedensel ilişkileri kurulması önemli bir adımdır. Prosedürler ve haBurada özetlenen rdware, kemirgenlerde in vivo baş sabit kayıtları için optogenetics uygulanması için basit bir yaklaşım sağlar.

Zamansal olarak kesin moda bir sinir devresi içindeki bir hücre tipinin etkinleştirmek veya susturmak için yeteneği nöral devreleri duygu ve biliş altta yatan farklı bilgi türlerini işlemek nasıl anlamak için önemlidir. Bozulmamış sinirsel aktivite üzerinde deney kontrol vermeyen loss-/gain-of-function araçlarını (örneğin, elektrik stimülasyonu, farmakolojik modülasyonu, lezyon) istihdam vardır ya bir zamansal veya mekansal ölçekte, nöronların belirli popülasyonlarının kontrolü için seçici gereklidir. Doğrudan bu teknolojik zorlukları ele, genetik kodlanabilen ışığa duyarlı araçları geliştirme ve uygulama iyi tanımlanmış davranışsal olaylar sırasında select hücre tiplerinin elektriksel aktivitesini kontrol etmek sinirbilimcileri sağladı. Bu ışığa duyarlı proteinlerin bir çok ışık-geçişli katyon kanal channelrhodopsin 2-(CHR2) 1 ve hafif odaklı klorür pompası, halorhodop ile, mikrobiyal kökenligünah yaygın kullanımı (NpHR) 2,3. Optogenetik önemli bir avantajı, heterojen beyin bölgelerinde genetik hedef spesifik hücre popülasyonlarına yeteneğidir ve tekniği başarılı bir model organizmaların bir dizi (insan olmayan primatlar için omurgasız) 4-6 uygulanmıştır. Birçok optogenetic transgenik hayvanlar olarak üretilir ve 7,8 ticari olarak temin edilebilir, ancak kurulması transjenik soy, yoğun emek gerektirir ve maliyeti engelleyici olabilir edilmiştir. Burada bir rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü kullanılarak sıçan prelimbic korteks ve dorsal subikulum olarak CaMKIIα promotörün kontrolü altında ChR2 ve NpHR genlerin viral aracılı teslim için bir protokol açıklar. Ön beyin içinde, CaMKIIα ifade glutamaterjik piramidal nöronlar 9 özeldir. AAV yaygın nedeniyle göreceli üretimi ve patojenisite eksikliği kolaylığı, hem de temel araştırma için kullanılan güçlü ve persiBu vektörlerin 10 ile elde edilmiştir stent transgen ifadesi. Ayrıca biz anestezi kafa sabit sıçanlarda eşzamanlı ışık teslim ve kayıt için adımlar ve donanım anahat.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Syringe </td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7653-01</td>
 <td>10 &mu;l</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Removable Needle</td>
 <td>Hamilton</td>
 <td>7803-03</td>
 <td>31 gauge, beveled tip</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microinjector Pump</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>UMP3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pump Controller</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>SYS-MICRO4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silicone Oil</td>
 <td>Alfa Aesar</td>
 <td>A12728</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Laser Protective Eyeware</td>
 <td>Kentek </td>
 <td>KMT-4501</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Multimode Optical Fiber</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>BFL37-200</td>
 <td>200 &mu;m diameter core, 0.37 NA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber Stripping Tool</td>
 <td>Thorlabs</td>
 <td>T12S21</td>
 <td>for 200 &mu;m diameter core multimode fiber</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Power Meter</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Photodetector</td>
 <td>Newport</td>
 <td>818-SL/DB</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Green Laser (532 nm, 100-200 mW)</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>coupled to a 200 &mu;m multimode fiber with FC/PC adapter </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tungsten/Fiber Optrode</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td>Lumitrode</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass Capillary Tube</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>22-362-566</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hydraulic Micromanipulator</td>
 <td>Narishige</td>
 <td>MO-22</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Amplifier</td>
 <td>Kation Scientific</td>
 <td>ExAmp-20K</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Data Acquistion Device</td>
 <td>National Instruments</td>
 <td>NI USB-6009</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rodent Head Restraint for Recording</td>
 <td>Lumiphy LLC</td>
 <td><a href="http://www.lumiphy.com/" target="_blank">www.lumiphy.com</a></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Small Animal Stereotaxic Unit</td>
 <td>David Kopf Instruments</td>
 <td>Model 963</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a method for high fidelity optogenetic control of individual pyramidal neurons in vivo

Optogenetic yöntemler türlerin geniş bir yelpazesinde davranışların çeşitli bir dizi yatan nöral devre aktivitesini ortaya çıkması için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Mikrobiyal orijinli optogenetic araçları (örneğin, channelrhodopsin-2, ChR2) veya sessizlik (örneğin, halorhodopsin, NpHR) davranışsal ilgili zaman dilimi zarfında sinirsel aktivite ingenetically tanımlı hücre tiplerini aktive edebiliyoruz ışığa duyarlı zar proteinlerden oluşur. İlk dorsal subikulum ve sıçan prefrontal korteks prelimbic bölgeye ChR2 ve NpHR transgenlerin adeno-ilişkili virüs aracılı verilmesi için basit bir yaklaşımı göstermektedir. ChR2 ve NpHR genetik olarak hedeflenebilir olduğu için, yüksek zamansal hassasiyetle heterojen doku içinde gömülü nöronlar (yani, piramidal nöronlar) spesifik popülasyonlarının elektriksel aktivitesini kontrol etmek için, bu teknolojinin kullanılmasını tarif eder. Biz burada, donanım, özel yazılım açıklamakvivo hazırlanmasında bir anestezi içinde Transdüksiyona piramidal nöronların eş zamanlı ışık teslimat ve elektrikli kayıt için izin kullanıcı arayüzü ve prosedürler. Bu ışık duyarlı araçları bilgi işlem ve davranışlara farklı hücre tiplerinin nedensel katkılarını tanımlamak için fırsat sağlar.

Şekil 1 nöronal aktivitenin aynı anda kayıt için kullanılan ve ışık nabız parametreleri (yani darbe frekansı, darbe genişliği, uyarılması dönemi) kontrol özelleştirilmiş yazılım LabVIEW ortamında geliştirilen (Pro NeuroLux) (National Instruments) bir ekran gösteriyor. Yazılım programı tek diyot lazer üzerinde kontrolü için TTL darbeleri üreten bir dijital veri toplama cihazına bir komut sinyali gönderir. Ayrıca yazılım programı görüntüler ve saklar kaydedildi nöronal aktivite ve teslim TTL sinyaller. Bu sinyaller, tanımlanmış bir örnekleme oranı (örneğin, 20 kHz) de satın alma cihaz üzerinden sayısallaştırılmış. Kaydedilmiş sinyalleri bir ikili dosyada iki boyutlu çift duyarlıklı dizi olarak kaydedilir. Şekil 2, bir fiber optik bağlanmış bir tungsten elektrot oluşan özel optrode gösterir. Bir fiber optik üçünde ince dikiş ipliği kullanarak elektrot sabitlenmiştirpuan. Gerekirse, süper yapıştırıcı bunları yapıştırmak için kullanılabilir. Ancak elektrot lifin birkaç kez, ışık iletimi tekrar edilebilir, ancak tekrarlanan kullanımı ile parçalanır ve bölünür ve temizlenmiş ya da beyin içine her ekleme ile değiştirilmesi gerekir, çünkü kalıcı elektroda fiber optik sabitleme kaçının. Gerçek ChR2 ve NpHR ifade ettiğini belirten geliştirilmiş sarı floresan protein Şekil 3 gösteri floresan görüntüleri Sol paneller,. Bu fotoğraflar temsili sıçan dorsal subikulum içinde NpHR ifade (Şekil 3A) ve prelimbic kortekste ChR2 ifade (Şekil 3B) gösterebilir. Viral ifade (örneğin bazı floresan), sol, kıvrımlarının (Şekil 3A gözlendi) dorsal subikulum ve prelimbic korteks çoğunlukla sınırlıydı. Elektrodun (ince parça, ok ucu) ve fiber optik (kalın parça, ok) izleri de gözlenmiştir. Şekil 4&#39;ün s = &quot;jove_content&quot;&gt; Sol panel ChR2. Şekil 4A, prelimbic sıçan için 10 msn mavi ışık darbeleri ile 20 Hz teslimat tepki olarak ChR2 tetiklenen aksiyon potansiyellerinin bir örnek izidir prelimbic sıçan korteksinde belirli zamansal çapalama uyardığını göstermektedir cortex. Raster arsa (Şekil 4B), altı temsil nöronlarda ChR2 kaynaklı aktivasyonunu gösterir. Kaydedilen tüm nöronlar ile mükemmel doğruluk ışık uyarılmış smaç gösterdi. CHR2 aksine, NpHR hızlı ve geri dönüşlü prelimbic sıçan korteksinin (Şekil 4&#39;ün sağ panel), in vivo aktivitesi kendiliğinden susturulur. Şekil 4C gösteren bir örnek iz olduğunu altında NpHR ifade prelimbic korteks sürekli 532 nm aydınlatma (10 s) CaMKllα organizatörü in vivo spontan tek ünite aktivitesini ortadan kaldırır. Prelimbic piramidal hücre aktivitesinin tam susturulması zaman kilitli 10 sn sürekli ışık teslimat için olduğunu unutmayın. Düşüker raster arsa (Şekil 4D) altı temsilci nöronlarda NpHR kaynaklı sessizleştirilmesini gösterir. Hem in vivo kayıtlar mikrobiyal opsin genlerin AAV aracılı teslim 18-21 gün önce meydana geldiği, yetişkin Sprague-Dawley sıçanlarından elde edilen tipik örnekleridir. Şekil 5, bir sıçan prelimbic piramidal nöron tekrarlanan ChR2 uyarılması sonucunu göstermektedir. Mavi ışık nabız (10 msn) 5 sn (100 bakliyat toplam) için 20 Hz teslim edildi. Işık uyarılmış çivilenmesi gerilim izleri art arda 2 saat kayıt oturumu (61 tekrarlar toplam) sırasında her 2 dakikada elde edildi. Bu tekrarlayan uyarma protokolünü kullanırken bile, ChR2 ışık teslim yanıt istikrarlı ve sağlam smaç bağlı. Şekiller 6 ve 7 NpHR kaynaklı fotoindirgeyici ve sıçan subicular nöron aktivitesinin ChR2 odaklı fotoaktivasyon sonuçlarını göstermektedir. Durumda prelimbic kortekste olduğu gibi, NpHR ve ChR2 başardıkışık kaynaklı zamanlı kilitli engellenmesini ve yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile opsin transdüksiyona subicular nöronların aktivasyonu aracılık eder. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig1.jpg" /> Şekil 1. Eşzamanlı ışık teslimat ve elektrofizyolojik kayıt için NeuroLux Pro yazılım arayüzü ekran görüntüsü. Resimde iz sürekli 532 nm ışık teslimat 10 saniye yanıt sıçan prelimbic piramidal hücre spontan aktivite NpHR kaynaklı susturulması gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig1large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/50291/50291fig2.jpg" /> Şekil 2. Özel optrode Yüksek güç görüntüsü. Bir fiber optik cam kılcal borunun bir tungsten elektrot bağlı ve dikiş ipliği kullanılarak elektrotuna sabitlenir sokulur. Betw merkez-merkez mesafesieen elektrot ucu ve lif ucu yaklaşık 500 mikron. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/50291/50291fig3.jpg" /> Şekil 3,. Viral ifade ve optrode yerleştirme. (Sol) Fotoğraflar temsilcisi dorsal subikulum içinde NpHR ifade (A) ve prelimbic korteks (B) ChR2 ifade göstermektedir. Her fotoğraf çekildikten konumunu temsil eder (Sağ) şematik. Her fotoğrafta ok ve ok tungsten elektrot konumu ve fiber optik işaret, sırasıyla. ALT: subikulum, DG: dentat girus, PL:. Prelimbic korteks <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/50291/50291fig4.jpg" /> Şekil 4. ChR2 veya NpHR transdüksiyonlu sıçan prelimb In vivo elektrofizyolojik kayıtlaric cortex. (A) mavi (473 nm) ışık darbeleri (10 msn, mavi bar) 20 Hz teslim yanıt ChR2 tetiklenen aksiyon potansiyelleri Örnek izleme. (B) altı temsilci nöronlarda ChR2 kaynaklı smaç gösteren Raster arsa. Her birim aktivitesi, bir nokta olarak çizilmiştir. (C) sürekli yeşil (532 nm) ışık aydınlatma (10 sn, yeşil bar) sırasında spontan aktivite NpHR kaynaklı baskı örneği iz. (D) altı temsilci nöronlarda NpHR kaynaklı susturulması gösteren Raster arsa. Her birim faaliyet bir nokta olarak çizilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig4large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/50291/50291fig5.jpg" /> Şekil 5,. In vivo sıçan prelimbic piramidal nöron tekrarlayan 20 Hz ChR2 odaklı yükseliyor. (A) ışık uyarılmış çivilenmesi izleri Voltajazaman noktalarında, 0, 30, 60, 90 de elde edilen, kayıtların başlangıcından sonra 120 min. (B) ışık kaynaklı aktivasyonunun 61 tekrar (2 dakika arası test aralığı, 120 dakika toplam) gösteren Raster arsa. Her birim faaliyet bir nokta olarak çizilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig5large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/50291/50291fig6.jpg" /> Şekil 6. NpHR transdüksiyonlu sıçan dorsal subikulum In vivo elektrofizyolojik kayıtlar. (A) NpHR ifade dorsal subikulum 10 sn sürekli 532 nm aydınlatması (yeşil çubuk) spontan aktivitesini ortadan kaldırır gösteren örnek iz. Yukarıdaki iz, iki kaydedilen birimlerinin (B) ortalama dalga şekilleri. Amplitüd eşik iki ayrı nöronlar belirlenmesi için kullanılmıştır. (C) beş tekrarını gösteren Raster arsaBu birimlerin NpHR kaynaklı susturulması s. Her birim aktivitesi, bir nokta olarak çizilmiştir. <img alt="Şekil 7" src="/files/ftp_upload/50291/50291fig7.jpg" /> Şekil 7. In vivo sıçan dorsal subicular nöronun tekrarlayan 20 Hz CR2-odaklı yükseliyor. (A) zaman noktaları 0, 30, edinilen spike ışık uyarılmış izleri Voltaja 60, 90, 120 dakikalık kayıtların sonra gerçekleşebilir. Ankastre: Bu hücrenin tipik patlama aktivitesi. (B) ışık kaynaklı aktivasyonunun 61 tekrar (2 dakika arası test aralığı, 120 dakika toplam) gösteren Raster arsa. Her birim faaliyet bir nokta olarak çizilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50291/50291fig7large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo at JoVE.com

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Genetik ve optik birleştirmek nörobilim araçlarının son gelişmeler, mekansal ve zamansal çözünürlük görülmemiş bir düzeye ile nöral devre faaliyet üzerinde kontrol sağlayan, &quot;optogenetics&quot; olarak adlandırılır. Burada prefrontal korteks ve subicular piramidal nöronların genetik tanımlanmış alt kümelerinin optogenetic manipülasyon ile vivo kayıtta entegre etmek için bir protokol sağlar.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

a-method-for-high-fidelity-optogenetic-control-individual-pyramidal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

18.9K Görüntüleme.  University of Colorado Boulder.  Genetik ve optik birleştirmek nörobilim araçlarının son gelişmeler, mekansal ve zamansal çözünürlük görülmemiş bir düzeye ile nöral devre faaliyet üzerinde kontrol sağlayan, "optogenetics" olarak adlandırılır. Burada prefrontal korteks ve subicular piramidal nöronların genetik tanımlanmış alt kümelerinin optogenetic manipülasyon ile vivo kayıtta entegre etmek için bir protokol sağlar. 

Video: A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Nörobilim

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Kronik Yetişkin doğmuş Koku Nöronlar Seçici Viral İletimi In vivo Optogenetic Uyarım

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological techniques, in the understanding of the underlying pathophysiology1. Here we describe a method to perform electrophysiological studies on mouse sciatic nerves in vivo.
The animals are anesthetized with isoflurane in order to ensure analgesia for the tested mice and undisturbed working environment during the measurements that take about 30 min/animal. A constant body temperature of 37 &#176;C is maintained by a heating plate and continuously measured by a rectal thermo probe2. Additionally, an electrocardiogram (ECG) is routinely recorded during the measurements in order to continuously monitor the physiological state of the investigated animals.
Electrophysiological recordings are performed on the sciatic nerve, the largest nerve of the peripheral nervous system (PNS), supplying the mouse hind limb with both motoric and sensory fiber tracts. In our protocol, sciatic nerves remain in situ and therefore do not have to be extracted or exposed, allowing measurements without any adverse nerve irritations along with actual recordings. Using appropriate needle electrodes3 we perform both proximal and distal nerve stimulations, registering the transmitted potentials with sensing electrodes at gastrocnemius muscles. After data processing, reliable and highly consistent values for the nerve conduction velocity (NCV) and the compound motor action potential (CMAP), the key parameters for quantification of gross peripheral nerve functioning, can be achieved.

In Vivo Electrophysiological Measurements on Mouse Sciatic Nerves

Measurements of nerve conduction properties in vivo exemplify a powerful tool to characterize various animal models of neuromuscular diseases. Here, we present an easy and reliable protocol by which electrophysiological analysis on sciatic nerves of anesthetized mice can be performed.

Fare Siyatik Sinir Vivo elektrofizyolojik ölçümlerde

Electrophysiological studies allow a rational classification of various neuromuscular diseases and are of help, together with neuropathological ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic hippocampal neurons can often grow successfully on glass coverslips at high density under serum-free conditions, but low density cultures typically require a supply of trophic factors by co-culturing them with a glia feeder layer, preparation of which can be time-consuming and laborious. In addition, the presence of glia may confound interpretation of results and preclude studies on neuron-specific mechanisms. Here, a simplified method is presented for ultra-low density (~2,000 neurons/cm2), long-term (&#62;3 months) primary hippocampal neuron culture that is under serum free conditions and without glia cell support. Low density neurons are grown on poly-D-lysine coated coverslips, and flipped on high density neurons grown in a 24-well plate. Instead of using paraffin dots to create a space between the two neuronal layers, the experimenters can simply etch the plastic bottom of the well, on which the high density neurons reside, to create a microspace conducive to low density neuron growth. The co-culture can be easily maintained for &#62;3 months without significant loss of low density neurons, thus facilitating the morphological and physiological study of these neurons. To illustrate this successful culture condition, data are provided to show profuse synapse formation in low density cells after prolonged culture. This co-culture system also facilitates the survival of sparse individual neurons grown in islands of poly-D-lysine substrates and thus the formation of autaptic connections.

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Ultra Düşük Yoğunluk için Basitleştirilmiş Bir Yöntem, Uzun Vadeli İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Culturing primary hippocampal neurons in vitro facilitates mechanistic interrogation of many aspects of neuronal development. Dissociated embryonic ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Ratiometric kalsiyum görüntüleme Caenorhabditis Elegans davranışlar içinde bireysel nöronların

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Method for High Speed Stretch Injury of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Neurons in a 96-well Format

Traumatic brain injury (TBI) is a major clinical challenge with high morbidity and mortality. Despite decades of pre-clinical research, no proven therapies for TBI have been developed. This paper presents a novel method for pre-clinical neurotrauma research intended to complement existing pre-clinical models. It introduces human pathophysiology through the use of human induced pluripotent stem cell-derived neurons (hiPSCNs). It achieves loading pulse duration similar to the loading durations of clinical closed head impact injury. It employs a 96-well format that facilitates high throughput experiments and makes efficient use of expensive cells and culture reagents. Silicone membranes are first treated to remove neurotoxic uncured polymer and then bonded to commercial 96-well plate bodies to create stretchable 96-well plates. A custom-built device is used to indent some or all of the well bottoms from beneath, inducing equibiaxial mechanical strain that mechanically injures cells in culture in the wells. The relationship between indentation depth and mechanical strain is determined empirically using high speed videography of well bottoms during indentation. Cells, including hiPSCNs, can be cultured on these silicone membranes using modified versions of conventional cell culture protocols. Fluorescent microscopic images of cell cultures are acquired and analyzed after injury in a semi-automated fashion to quantify the level of injury in each well. The model presented is optimized for hiPSCNs but could in theory be applied to other cell types.

Here we present a method for a human in vitro model of stretch injury in a 96-well format on a timescale relevant to impact trauma. This includes methods for fabricating stretchable plates, quantifying the mechanical insult, culturing and injuring cells, imaging, and high content analysis to quantify injury.