Name: microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks at JoVE.com

Bu çalışma NIH R01 # DE021475 (CTM), NIH predoctoral Eğitim Hibe 5T32GM007127 (PAE), ve bir NSF Yüksek Lisans Araştırma Bursu (NAE) tarafından kısmen finanse edildi. Biz enjeksiyon protokolüne yararlı geribildirim için CRISPR Sanger sıralama verilerinin üretilmesi için BAC Recombineering ve enjeksiyonlar, Nick Donde gerçekleştirmek için Kevin Schwalbach teşekkür ve Katherine Lipari.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

transgenesis ya da genom düzenleme için enjekte tek hücreli dikenli embriyolar üç ana zorluklar getirmektedir. İlk olarak, Zebra balığı embriyolarının göre, dikenli embriyonik koryon sert ve sık sık iğne kıracak. Bu sorun kısmen kalın ve güçlü cam mikropipetler kullanarak ve koryon dik enjekte edilerek aşılabilir (Protokolü, bakınız Şekil 2). Mümkün olduğunca az su sağlanması embriyoların eklenir (yeterli koryon şişer ve uzak hücreden kaldırmak için neden) koryon sertliği azaltmaya yardımcı olur. koryon zamanla sertleşir, bu nedenle embriyo nemlendirme sonra hızla çalışan önemlidir. kurumasını böylece enjeksiyondan önce bir nem odası embriyolar tutulması da önemlidir. Bazı kavramalar ve hatta bireysel embriyolar sadece çok kalın ve sert chorions var; bazen bir sonraki embriyo geçmeden veya yeni bir kavrama ile çalışıyor en kolay çözümdür. Bir d atlamak için çok daha kolaydır<html> Hasarlı bir iğne yerine daha ifficult embriyo. hazır yedekleme iğnelere sahip enjeksiyonlar iğne kırılması halinde devam sağlayacaktır. BAC&#39;ler enjekte iğne tıkayabilir için, bu yaygındır. İğne veya yapışmasına neden temizlemek için sabit hava basıncı anahtarını kullanarak hafifçe kazıma veya forseps ile ucu yeniden kırarak unclogged edilebilir. İkincisi, embriyo ilk hücre belirlenmesi zordur; genellikle oldukça basık ve zor başlayanlar görmek için, ve ona doğrudan bakıldığında özellikle görünmez. Genellikle blastomere sadece profilinde biraz yükseltilmiş yumru olarak görülebilir. Bu nedenle, (Şekil 3B) profilinde hücreyi tespit etmek en iyisidir ve daha sonra yavaşça ileri embriyo döndürmek ve hücre genellikle bu açıdan görünmez olacak ama yan böylece hücre (açılı iğnenin ucunu karşı karşıya gelecek; Şekil 3&#39;te blastomer karanlık renk) netliği için abartılı. e_content &quot;&gt; Üçüncü olarak, sitoplazma hedefleyen ilk hücre, özellikle düz, özellikle de zordur. sitoplazma yakın sarısı içine enjekte ederken blastomer (genellikle merkezi) şişman bölümü için hedefleyen. sitoplazmaya enjekte şansını artırır başarıyla transgenik balık üretebilir, verimlilik artışı gibi görünüyor ve öldürücü sitoplazma tek iğne ile hedeflenen zaman azalmıştır. Bazen bireysel debriyaj sarısı kaçınarak neredeyse imkansız olacak şekilde, özellikle ince blastomerlerdir sahip olacaktır. Bekleyen uzun 25 dakika daha enjeksiyonlar (bazı kavramalar tam boy blastomer ~ 45 dakika sonrası döllenme kadar oluşturmayan), ancak blastomer boyutu artırmak asla eğer yardımcı olabilir başlamak için, o basık hücreleri enjekte etmek için denemek için daha yumurta yeni bir debriyaj elde etmek çoğu zaman kolay . Aşırı öldürücü aşağıdaki enjeksiyonları çeşitli nedenlerle oluşabilir. Künt iğne ve / veya çok büyük bir iğne deliği boyutu neden olabilir too hücre ve / veya neden sitoplazmaya kadar zarar sızmasına. Bazı DNA yapıları, özellikle ölümcül görünmektedir; DNA konsantrasyonu düşürücü hayatta ama daha düşük transgenesis oranlarını artırabilir. ikinci bir PCR temizleme kiti tarafından izlenen bir endotoksin durulama içeren bir midiprep kiti ile ilk plazmidler temizleniyor toksisitesini inşa azaltır. Son olarak, genom düzenleme embriyolar geliştirmek için öldürücü olan fonksiyon mutasyon kaybı üretebilir. CRISPR veya TALEN mRNA konsantrasyonunun azaltılması ölümleri önlediği embriyonun Mozaiklik artırabilir, ancak mutant alel kurtarma etkinliğini azaltabilir. Bir meganuclease yöntemi 21 kullanılarak transgenik Sticklebacks üretmek için bir protokol daha önce yayınlanmış F 0 kurucu balık bir% 4-7 transgen germ iletim hızını bildirdi. Burada bildirilen Tol2 yöntemi F 0 kurucu balık% 72 transgen germ iletim hızı kadar (birden genomik bütünleşik belirten sonuçlandıiyonlar). Bir meganuclease yöntemi kullanarak önceki çalışma burada bildirilen benzer özel GFP ifade gösteren enjekte edilen embriyoların% 40 bildirmişlerdir. Transgenik F 0 kurucularından benzer oranlar meganuclease ve Tol2 yöntemlerle hem tarafından oluşturulan transgenik balık gözlenir Böylece, germ iletim hızı Tol2 aracılı transgenik için çok daha yüksek görünmektedir. genom düzenleme teknolojileri ilerlemeye devam ettikçe, daha da spesifik genetik manipülasyonlar dikenli balıkgil ve diğer balık türlerinin mümkün hale gelecektir. Örneğin, yönetmenliğini onarım 46 ve homolog rekombinasyon deniz ve tatlı su dikenli genomları ve modifiye CRISPRs arasında alel swapları özellikle kullanılan etkinleştirmek veya gen ifadesini 47 inhibe olabilir sağlayacaktır. genom düzenleme ve analiz için bu heyecan verici teknolojiler birçok ilginç morfolojik, fizyolojik genetik temeli konusunda yeni anlayışlar ve STIC davranışsal fenotipleri yol açacaktırklebacks ve diğer balık türleri.

biyoçeşitlilik doğada evrimleşmiş fenotipik değişikliklerin genetik ve gelişimsel üsleri belirlemektir nasıl ortaya çıktığını anlamak biri temel bileşeni. Threespine dikenli balık, Gasterosteus aculeatus evrim genetik temeli çalışmak için mükemmel bir model olarak ortaya çıkmıştır. Sticklebacks deniz balıkları kuzey yarımkürede etrafında sayısız tatlı su ortamları kolonize gibi dramatik morfolojik, fizyolojik sonuçlanan birçok adaptif evrimsel değişikliklere uğramıştır, ve var davranış değişiklikleri 1. Yirmi bir dikenli popülasyonlardan bireylerin genomları dizilenmiş ve birleştirilmiş ve yüksek yoğunluklu bir bağlantı harita daha düzeneğinin 2,3 geliştirmek için oluşturulduktan edilmiştir. Genetik haritalama deneyleri gelişti fenotipler, bazan 4 yatan genomik bölgeleri belirledik - 6 ve bazı durumlarda, belirli aday genlerin fonksiyonel rolleri 7,8 sınanmıştır. Morfolojik değişikliklerin altında yatan genomik bölgelerin bir dizi vaat aday genler ile tespit edilmiştir, ancak bu adaylar henüz işlevsel 9 test edilmemiştir - 12. Buna ek olarak, Sticklebacks populasyon genetiği / genomik 13,14, türleşme 15, davranış 1, endokrinoloji 16, ekotoksikoloji 17, immünoloji 18 ve Parazitoloji 19 çalışmaları için ortak modellerdir. Bu alanların her birinde gelecek çalışmalar Sticklebacks fonksiyonel genetik manipülasyonlar yapmak için yetenek yararlanacaktır. Kendi kodlama dizileri manipüle ek olarak, bir aday genin rol cis -regulatory dizileri inceleyerek ve fonksiyonel olarak arttırmak, azaltmak ya da aday genin ifadesinin elimine ile değerlendirilebilir. Sticklebacks Mikroenjeksiyon ve transgenezi yöntemleri iyi 7,8,20 oluşturulmuş ve ilk kullanılarak geliştirilmiştir bir meganuclease aracılıyöntem, 21, birinci Medaka 22&#39;de tarif. Burada yer alan değiştirilmiş mikroenjeksiyon yöntemi hem Tol2 aracılı genetik dönüştürme için optimize edilmiş ve en son TALENS ve CRISPRs içeren genom düzenleme reaktifleri geliştirilmiştir. Cis -regulatory elemanlara değişiklikler cis -regulatory değişiklikler mutasyonlar 23 kodlama olumsuz pleiotropik sonuçları önlemek gibi, morfolojik evrimi kritik olduğu düşünülmektedir. Bu nedenle, varsayılan sis -regulatory dizileri test ve karşılaştırma evrim çalışmalarında artan sayıda merkezi hedefi haline gelmiştir. Buna ek olarak, çoğu insan hastalık varyantları şiddetle sis -regulatory eleman fonksiyonu ve mantık incelemek için gerekli olan düzenleyici varyantları 24,25 ve model omurgalı sistemleridir. Çok sayıda dışarıdan kendi embriyolar aşılamak balık sis -Yönetmeliği incelemek için güçlü omurgalı sistemleri sunuyoruz. forei burada Tol2 transpozon sistemi,genomuna entegre edilecek gn DNA Tol2 transposase siteleri ve bağlayıcı ile çevrili, Tol2 transposase mRNA ile işbirliği enjekte başarıyla plazmid balık genomları 26 içine yapıları entegre etmek için yüksek verimlilik ile çalışır - 28. Tipik olarak, potansiyel bir güçlendirici, bir Tol2 omurgada bir (örneğin hsp70l 29 gibi), bazal promotör ve flüoresan raportör gen gibi EGFP gibi (gelişmiş yeşil floresan protein) ya da mCherry akım-yukan klonlandı transposaz mRNA 26 enjekte edilir. floresan muhabiri, ya enjekte edilen embriyoların veya stabil entegre transgenlerin ile yavrularda ifade Gözlem, farazi arttırıcı tarafından yönlendirilen gen ifadesinin zamanmekansal yönetmelik hakkında bilgi sağlar. Diğer deneylerde de, geçerliliği arttırıcı ilgi genlerinin dokuya özel aşırı ekspresyonu tahrik etmek için kullanılabilir. Büyük sis -regulatory bölgelerin analizi, yüksek kalite geniş insert genomunabakteriyel yapay kromozom (BAC) ile ic kütüphaneleri hem deniz ve tatlı su Sticklebacks 30 inşa edilmiştir. Bu BAC&#39;ler büyük (150-200 kb) bağlamında bir flüoresan raportör geninin genomik bölge 31, bir gen yerine recombineered edilebilir. BAC olan düzenleyici diziler tarafından belirlenen flüoresan raportör sonra uzaysal model olarak ifade edilir. Balık çalışmaları için, Tol2 siteleri genomik entegrasyon 32,33 kolaylaştırmak için BAC eklenebilir. Gelişiminin sonraki evrelerinde in situ hibridizasyon teknik açıdan zor olarak, BAC floresan okuyucu dikenli kemik morfogenetik protein 6 (Bmp6) 20 için gösterildiği gibi, gen ekspresyonu örüntüleri incelemek için kullanılabilir. Buna ek olarak, bir bireyde, floresan ekspresyon modelleri, in situ hibridizasyon ile başarılı olamaz zaman üzerinde takip edilebilir. BAC&#39;ler, aynı zamanda bir additiona eklemek için kullanılabilirbir genomik bölgenin L kopya ilgi konusu bir genin dozajı artırmak. Gen fonksiyonunun çalışması için, genom düzenleme organizmaların 34 çeşitli genomik dizileri hedef alan değişiklikleri oluşturmak için kullanılabilecek bir patlayıcı genişleyen bir alandır. Transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazlar (TALENS) ilk olarak tam olarak tercih edilen bir genomik sekansa doğrudan bağlanan ve bir çift şerit 35,36 kırmak oluşturmak için tasarlanmış olabilir bitki patojenleri izole modüler, sekansa özel nükleazlar bulunmaktadır. Kümelenmiş düzenli aralıklarla yerleştirilmişlerdir kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / CAS sistemleri ilk bakterilerde bulunan ve kılavuzun 37 tamamlayıcı bir hedef DNA dizisinin bir ara oluşturmak için bir kılavuz RNA ve Cas9 proteini kullanmak edildi. genellikle TALENS ve CRISPRs ile oluşturulan çift iplik kırılım onarımı sonraki hedef sekansın fonksiyonunu bozabilir küçük ekleme veya delesyon, geride bırakır35-37. Sticklebacks olarak, TALENS bir takviye 20 hedef gen ekspresyonunu bölmek için kullanılmaktadır ve TALENS ve CRISPRs iki başarılı dizileri (yayınlanmamış veriler) kodlayan mutasyonlar üretmişlerdir. Zebrabalıkları kullanılmak için CRISPRs üretimi için ayrıntılı bir protokol Sticklebacks 38 için CRISPRs geliştirmek için bir kılavuz olarak kullanılabilir. Transjenik ve genom düzenleme deneyleri yeni döllenmiş tek hücre embriyoya nükleik asitlerin giriş gerektirir. erken gelişim transgen ya da genom-düzenleme aracı tanıştırarak, embriyo genetik manipüle kızı hücrelerin sayısı maksimize edilir. Enjekte embriyolar daha sonra görsel floresan için tarama ya da moleküler genom değişiklikleri için taranmaktadır. germline katkıda hücreler başarıyla hedef ise, transgen veya mutasyon enjeksiyon sonrası öldürücülüğü yüksek olsa bile, yavru bir alt kümesine geçebilir. mozaik balık outcrossed olabilir veyaintercrossed ve onların yavrularının mutant allel ya da ilgi kararlı biçimde entegre edilmiş transgen kurtarmak için gösterildi. Bu protokol, tek hücreli dikenli embriyolar transgenlerin ve genom düzenleme maddeleri eklemek ve başarılı genomik değişiklik izlenmesi için yöntemler tarif etmektedir.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with transillumination</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 Micromanipulator</td></tr><tr><td>Pressure Injecion system</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Back pressure unit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base holder</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic base</td><td></td></tr><tr><td>Foot switch</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Iron plate (magnetic base)</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Disposable transfer pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0.5% phenol red in DPBS</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P0290</td><td>injection tracer</td></tr><tr><td>#5 forceps, biologie dumoxel&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>for needle breaking</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>holds needles</td></tr><tr><td>6&quot;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td><td>hold eggs for injection</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm glass plate</td><td>any hardware store</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*harder glass than zebrafish injection capillaries</td></tr><tr><td>150 x 15mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>raise stickleback embryos</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>store eggs pre-injection</td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>fish anaesthesia/euthanasia</td></tr><tr><td>Sp6 transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>For transcription of TALENs and transposase mRNA</td></tr><tr><td>RNeasy cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>purify transposase or TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>clean up plasmids for injection</td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Nucleobond BAC 100 kit</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>for BAC DNA preparation</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>contains endotoxin rinse buffer</td></tr><tr><td>QIAQuick Gel Extraction</td><td>Qiagen</td><td>28704&amp;nbsp;</td><td>for sequencing induced mutations</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (molecular biology grade)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tris-acetate-EDTA buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0.5-10 Kb RNA ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&amp;nbsp; Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>12-strip PCR tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

threespine dikenli balık morfolojik, fizyolojik çeşitli genetik temelini incelemek için güçlü sistemi ve davranışsal fenotipleri olarak ortaya çıkmıştır. deniz ve tatlı su formlarını geçmeye yeteneği ile kombine deniz popülasyonları sayısız tatlı su ortamlarına adapte olarak geliştiğini oldukça farklı fenotipleri, genetik özellikleri gelişti kontrol edilmesi genomik bölgeleri eşleştirmek için kullanılabilecek nadir bir omurgalı sistem sağlar. Mükemmel genomik kaynakları gelişti değişikliklerin moleküler genetik diseksiyon kolaylaştırılması, artık mevcuttur. haritalama deneyleri ilginç aday genlerin listeleri oluşturmak iken, fonksiyonel genetik manipülasyonlar bu genlerin rolleri test etmek için gereklidir. Gen düzenlemesi Tol2 transposaz sistemi kullanılarak genomuna entegre transgenik raportör plazmid ve BACler ile incelenebilir. Belirli aday genler ve sis -regulatory elemanların fonksiyonları hedeflenen indükleyerek değerlendirilebilirTALEN ve CRISPR / Cas9 genom düzenleme reaktifleri ile mutasyonları. Tüm yöntemler, döllenmiş tek hücre dikenli embriyolar nükleik asitleri ilave gerektirir, bir görev dikenli embriyo kalın koryon ve nispeten küçük ve ince blastomere ile zor oldu. Burada, dikenli embriyolar nükleik asitlerin mikroenjeksiyon için ayrıntılı bir protokol transgenik ve genom düzenleme gen ekspresyonu ve fonksiyon çalışma uygulamaları yanı sıra, transgenesis başarısını değerlendirme ve kararlı çizgiler kurtarmak için teknikler tarif edilmiştir.

Güçlendirici etkiye sahip raportör gen transgenlerin için, başarılı bir enjeksiyon transgeni (Şekil 4A, 4C) spesifik hücresel ifadesi ile sonuçlanır. Enjekte balıklar sonra kararlı çizgiler (Şekil 4B&#39;de gösterilen bir BAC stabil hattı örneği) üretilmesi için çaprazlanırlar edilebilir. dikenli embriyolara DNA enjekte tipik olarak tek başına RNA çok daha yüksek öldürücülüğü sonuçlanır. Bu% 50&#39;ye varan görmek tipiktir (bazen daha fazla) öldürücülüğü veya malformasyon (Şekil 4D bkz - K, 4I) Tol2 muhabiri enjekte sonra (benzer daha önce tarif meganuclease yöntemine 21) oluşturur. Ancak sonuçlar yaygın özel yapı, embriyo morfolojisi ve beceri düzeyine bağlı olarak değişir. Etkin bir arttırıcı için, embriyoların% 40-50, genellikle (ortalama ve göğüs yüzgeçleri, örneğin F doku spesifik transgen ekspresyonunu gösterirŞEKIL 5). Arka plan ve spesifik olmayan floresan derecesi (Şekil 4G - I) yaygın olarak kullanılan promotör göre değişir; Zebra balığı hsp70l organizatörü özellikle kas ve sinir dokusunda, sızdıran olma eğilimindedir ve BAC (Şekil 4G benzer) sarısında yüksek arka plan ifadeye sahip olma eğilimindedir. Sazan beta aktin 41 organizatörü az sızdıran ama aynı zamanda oldukça sönük GFP sürücüler. Tol2 plazmid transgenlerin İletim GFP + F 0 balık üreten transgenik yavruları (Tablo 2) kadar% 100, yüksek olabilir. Ancak, transgen taşıyan yavruların yüzdesi arasında &lt;% 1% 72 (Tablo 2), büyük ölçüde değişmektedir. Sadece GFP + enjekte embriyolar kaydetme genellikle iletim verimliliğini artırır. BAC beklenen dokularda floresan gösteren F 0 enjekte dikenli embriyoların sadece% 10&#39;a kadar olan, çok daha düşük transgenesis fiyat bilgisi eğilimindedir. transBAC&#39;lerin görevin oranı zebrabalıkları 32% 15 bildirilen aktarım oranına benzerdir BAC (Tablo 2), iletme filtrelenmiş dikenli balıkgil olduğunda, en fazla% 14 olan, plasmid konstruktlarının daha düşüktür. BAC transgenesis nispeten düşük verimlilik aksine, filtrelenmiş balık tipik olarak% 70-100 TALENS enjekte (n = 10 lezyonlar için taranmıştır debriyajlar enjekte) mozaik lezyonlar vardır. Bu sayı, daha az verimli bir TALEN çifti ile daha düşük olabilir, ve enjeksiyon kalitesi ile değişebilir. 6 Talens Tfap2a içinde Pvull bir kesme yerine hedefleme enjekte tek kavrama 10 embriyo için bir PCR / sınırlama sindirimi göstermektedir. enjekte edilen embriyolar (kulvarlar 1-10) her biri bir kesilmemiş amplikon Her embriyo önemli bir vahşi tip kesme bant yüksek mozaik da her embriyo hücrelerinin bir kısmı, hedef lokusun lezyon taşıyan gösterir. thşerit 11-12 enjeksiyon yapılmamış embriyolar E amplikon tam PvuII ile sindirilir. TALEN indüklenen mutasyon kolaylıkla nesil iletilir. İki farklı TALEN setleri ile,% 50 ve ekranlı F 0 s% 90 pozitif kavramalar (Tablo 3) lezyon taşıyan yavruların 20-90 ile%, yavrular lezyonlar iletti. CRISPR / Cas9 verimliliği bir CRISPR kılavuz lezyonlar CRISPR hedefin PCR ürününün Sanger dizileme dayalı olan üç enjekte edilen embriyoların üzerinden PITX2, bir hedefleme ile, dikenli balıkgil optimize edilmemiş olsa da (kesilmemiş bant kısıtlama sindirim, Şekil aşağıdaki sıralandı 7). tahmin kesim yerinde dizisi kalite kaybı moleküler lezyonların karışımı mevcut gösterir. PCR ve restriksiyon sindirimi tahlili kullanılarak lezyonlarda fin kırpma yetişkin F 0 balık ve tarama fin somatik lezyonlar 10/22 balık bulundu. Bu hayvanların temsili bir alt kümesi, Şekil 8&#39;de gösterilmiştir &lt;/ Strong&gt;; Bireysel 2. lezyonları olan DNA&#39;nın düşük bir yüzde sahipken bireysel 3., lezyonları olan DNA yüksek oranda bulunmaktadır. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54055/54055fig4.jpg" /> Şekil enjekte edilen embriyoların 4. örnekleri. 5 gün sonrası fertilizasyon (dpf) GFP pektoral (yıldız) ifadesini ve medyan yüzgeçleri (ok başı) süren bir arttırıcı enjekte (A) Mozaik embriyo. Ölçek çubuğu = 500 mikron. (B) 4 dpf&#39;e embriyonik kalp GFP ekspresyonu sağlayan bir muhabir BAC Kararlı hattı. 4 dpf&#39;e Notokordun içinde MCherry ifadesini sağlayan bir Col2a1a arttırıcı enjekte (C) Mozaik embriyo. Sütun2 a1a güçlendirici primerleri ile dikenli DNA&#39;sından klonlanmıştır Dale ve Topczewski bildirilen korunmuş ortolog arttırıcı amplifiye 5&#39;-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 &#39;ve 5&#39;-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3&#39;2011 Bir normal enjekte gelişen embriyonun 45. (D) Örnek. (E - F) enjeksiyon travma ile hatalı biçimlendirilmiş embriyoların örnekleri; E sol göz eksik ve F sağ tarafında (ok başları) boyunca nekrotik doku vardır. Sarısında yaygın GFP, yumurta sarısı yerine blastomere içine enjeksiyon olası sonucunun (g), Örnek. Epidermis (ok başı) spesifik olmayan GFP tanımının (H) Örnek. (I) Parlak, non-spesifik granül GFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54055/54055fig5.jpg" /> Şekil 5. raportör yapı enjeksiyon Verimlilik. On kavramalar 190 bp dikenli Bmp6 arttırıcı konstrüksiyonlar enjekte edildi20 dpf 5 de göğüs yüzgeci ve medyan fin ifadesini tahrik UCT. Her bir kavrama olmak üzere, en az 20 embriyo dokuya özgü (Göğüs ve / veya mali medyan olarak) ve / veya spesifik olmayan (diğer tüm dokular) GFP tanımı sahip olması açısından değerlendirildi. spesifik olmayan ve dokuya özel bir ifade olan tüm enjekte kalan embriyoların yüzdesi Boxplot olarak gösterilir. Yatay çizgiler ilk çeyreğini, medyan ve üçüncü çeyreğini gösterir; bıyıkları birinci ve üçüncü quartile 1.5 IQR (çeyrekler arası aralık) içinde verisine göre uzatmak. Veri Erickson ve ark., 2015 den uyarlanmıştır <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig5large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54055/54055fig6.jpg" /> Şekil 6. PCR ve restriksiyon sindirimi TALEN kaynaklı lezyonlar için ekran. Tfap2a hedefleyen bir TALEN çifti </em&gt; Oluşturulur ve tarif edildiği gibi enjekte edilmiştir. DNA, 2 dpf enjekte edilen embriyolar yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır ve TALEN hedef sekansı çevreleyen 297 bp&#39;lik bir fragmanı, PCR primerleri 5&#39;-GGGTCGTTGACGTGCGAGTAA-3 &#39;ve-AGCGGGACAACGTCATCACTTA-3 5&#39; &#39;kullanılarak yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı ile amplifiye oldu. Şerit 1-10 şerit 11-12, uninjected olan kontroller sindirilmiş, enjekte ve 13-14 uninjected, sindirilmemiş kontroller şeritleri vardır. Pvull, yaklaşık iki eşit boyutlu şeritler halinde doğal tipte sekansını keser. Ham bantlar hedef sekans moleküler lezyonların varlığına işaret etmektedir. Moleküler lezyonlar (sindirilmemiş bantları), 1-10 belirtileri gösteriyor ancak şerit Tüm enjekte embriyolar embriyolar ya tüm monoallelik mutasyonlara sahip ve / veya onlar da (vahşi tip) bantları kestik olarak mozaik vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig6large.jpg" target="_blank">Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.</a> Mozaik F 0 CRISPR gelen Şekil 7. Sanger sıralama / Cas9 embriyo enjekte etti. (Üst kısmında gösterilir) PITX2 karşı bir CRISPR kılavuz RNA (5&#39;-GTGGACCAACCTCACGG-3 &#39;) birlikte enjekte Cas9 (38 tarif edildiği gibi pCS2-nCas9n plazmid transkribe) mRNA ve embriyolar ile kısıtlayıcı enzim tahlili kullanılarak lezyonlar için taranmıştır oldu. Kesilmemiş bant, jel ile ekstre edilmiş ve Sanger dizileme ile dizilenmiştir. Dizi kalitesi nedeniyle enjekte embriyo mevcut lezyonların mozaik karışımı (aşağıda ok) tahmin bölünme yerinde alçaltır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/54055/54055fig8.jpg" /> Şekil 8. CRI AnaliziSPR F 0 kuyruk yüzgeci görüntüleri. DNA F fin kliplerden PITX2 karşı CRISPRs ile enjekte edilen embriyoların kaldırdı 0 gençlere hazırlandı. CRISPR / Cas9 hedef primerleri 5&#39;-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 &#39;ve 5&#39;-GGCCCAAATTACCCACATTT-3&#39; ile büyütüldü ve ürün EcoRI ile sindirildi. Dört kişi gösterilir; Bir kesilmemiş PCR ürünü solda ve sindirilmiş PCR ürünü her numaralı birey için sağda. Ürün sindirilmiş şeritte kesilmemiş bant (~ 230 bp) boyutu bir lezyon varlığını gösterir. Bireyler 2, moleküler lezyon 3 ve 4 tüm belirtileri gösteriyor, bireyler arasındaki Mozaiklik değişen, yıldız işareti ile belirtilmiştir. İlgili merdiven boyutları sol belirtilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> inşa etmek </td><td> GFP yavrular / toplam F0 (%) balık ekranlı </td><td> % F1 yavrular pozitif </td><td> Not </td></tr><tr><td> BAC A </td><td> 6/46 (% 13) </td><td> 4-19% </td><td></td></tr><tr><td> BAC B </td><td> 1/41 (% 2) </td><td> % 4 </td><td></td></tr><tr><td> BAC C </td><td> 5/42 (% 12) </td><td> 3-40% </td><td></td></tr><tr><td> BAC D </td><td> 3/22 (% 14) </td><td> % 5-15 </td><td></td></tr><tr><td> plazmid </td><td> 2/38 (% 5) </td><td> % 2-5 </td><td> Tüm F0 embriyolar ekranlı, sadece GFP + </td></tr><tr><td> plazmid B </td><td> 3/16 (% 19) </td><td> &lt;% 1-8 </td><td> Tüm F0 embriyolar ekranlı, sadece GFP + </td></tr><tr><td> plazmid C </td><td> 1/11 (% 9) </td><td> % 10 </td><td></td></tr><tr><td> plazmid D </td><td> 2/11 (% 18) </td><td> 1-45% </td><td> plazmid D enjekte2 Genetik arka </td></tr><tr><td> plazmid D </td><td> 5/5 (% 100) </td><td> 16-72% </td><td></td></tr><tr><td> plazmid E </td><td> 2/3 (% 67) </td><td> 2-22% </td><td></td></tr><tr><td> plazmid F </td><td> 2/6 (% 33) </td><td> &lt;1-65% </td><td></td></tr><tr><td> plazmid G </td><td> 3/8 (% 38) </td><td> 2-56% </td><td></td></tr><tr><td> plazmid H </td><td> 3/18 (% 17) </td><td> gol değil </td><td></td></tr><tr><td> plazmit </td><td> 5/24 (% 21) </td><td> gol değil </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 2:. BACS ve güçlendirici yapıları için Transgen iletim verimliliği F 0 enjekte embriyolar yetişkinliğe kaldırdı ve sonra GFP floresan için attı yabani tip balık ve F 1 yavrulara outcrossed bulundu. Transgen iletilen F 0 bireylerin sayısı İfade olduğunuTüm elenmiş F 0 balık yüzdesi olarak işlenmesinde. Transgeni taşıyan F 1 yavru yüzdeleri aralığı da GFP pozitif balık vardı o kavramaları için gösterilir. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> TALEN </td><td> % F0 verici lezyonlar </td><td> % F1 yavrular pozitif </td></tr><tr><td> bir </td><td> 9/10 (% 90) </td><td> % 20-90 </td></tr><tr><td> B </td><td> 4/8 (% 50) </td><td> 20-72% </td></tr></tbody></table> Tablo 3:. İki TALEN çifti için İletim verimlilikleri F 0 embriyolar yetişkinliğe kaldırdı ve daha sonra yabani tip balık ve TALEN lezyonlar için elenmiş F 1 yavrular çaprazlanırlar enjekte edilir. lezyonlar iletilmesi enjekte bireylerin yüzdesi, bu kavramalar lezyonlarıyla yavru yüzdeleri hem de aralık gösterilirBu iletilen lezyonlar. TALEN A Bmp6 arttırıcı 20 hedef, TALEN B (yayımlanmamış) Tfap2a hedef.

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks at JoVE.com

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Threespine Sticklebacks içinde Transgenesis ve Genom Kurgu Mikroenjeksiyon

Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur.

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

microinjection-for-transgenesis-genome-editing-threespine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.9K Görüntüleme.  University of California, Berkeley.  Transgenik manipülasyonlar ve genom düzenleme işlevsel genler ve sis -regulatory unsurların rollerini test etmek için kritik öneme sahiptir. Burada (Tol2 aracılı flüoresan raportör transgen yapıları, Talens ve CRISPRs dahil) genomik değişiklik üretimi için ayrıntılı bir mikroenjeksiyon protokolü acil modeli balık, threespine dikenli balıkgil sunulmuştur. 

Video: Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

CRISPR/Cas9 Protein gen düzenleme için mikroenjeksiyon kanal yayın balığı, Ictalurus yılan, embriyo içine

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Genetik

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embriyo mikroenjeksiyon ve Nasonia vitripennis genom manipülasyon için transplantasyonu tekniği

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Oositlerin Mikroenjeksiyonu ile Genetiği Değiştirilmiş Farelerin Üretilmesi

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Gelişim Biyolojisi

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Zebra balığı Embriyolar mRNA ve morfolino Antisens Oligonükleotidler Mikroenjeksiyon.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biyoloji

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Morfolino Oligonükleotidler bir Cerebroventricular Mikroenjeksiyon kullanarak Yetişkin Zebra balığı Beyin Gen İfade Mikromanipülasyon

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Nörobilim

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Xenopus laevis Embriyolarında Göz tomurcuklarına DNA'nın mikroenjeksiyonu ve GFP'nin Sağlam Optik Aksonal Arbors'u İfade Etme Görüntülemesi, Yaşayan Xenopus Kurbağaları

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

genom Düzenleme<em&gt; Astyanax mexicanustan</emKullanma&gt; Transkripsiyon Aktivatör benzeri Efektör Nükleazlar (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite the growing burden of tick-borne diseases, research on ticks has lagged behind insect disease vectors due to challenges in applying genetic transformation tools for functional studies to the unique biology of ticks. Genetic interventions have been gaining attention to reduce mosquito-borne diseases. However, the development of such interventions requires stable germline transformation by injecting embryos. Such an embryo injection technique is lacking for chelicerates, including ticks. Several factors, such as an external thick wax layer on tick embryos, hard chorion, and high intra-oval pressure, are some&#160;obstacles that previously prevented embryo injection protocol development in ticks. The present work has overcome these obstacles, and an embryo injection technique for the black-legged tick, Ixodes scapularis, is described here.&#160;This technique can be used to deliver components, such as CRISPR/Cas9, for stable germline transformations.

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

The present protocol describes a method for injecting tick embryos. Embryo injection is the preferred technique for genetic manipulation to generate transgenic lines.

Siyah Ayaklı Kene Gen Düzenleme için Embriyo Enjeksiyon Tekniği, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...