Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH R01 # DE021475 (CTM), ein NIH Predoctoral Ausbildungsbeihilfe 5T32GM007127 (PAE) und ein NSF Graduate Research Fellowship (NAE) gefördert. Wir danken Kevin Schwalbach für die Durchführung BAC Recombineering und Injektionen, Nick Donde zur Erzeugung von Sequenzierungsdaten CRISPR Sanger und Katherine Lipari für hilfreiche Rückmeldung über die Injektionsprotokoll.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Injizieren einer Zell stickleback Embryonen für die Transgenese oder Genom Bearbeitung präsentiert drei wichtigsten Herausforderungen. Zuerst in Bezug auf Genaktivität, die stickleback embryonalen Chorion ist hart und wird oft Nadeln brechen. Dieses Problem kann teilweise durch Verwendung dicker und stärker Glasmikropipetten und Einspritzen senkrecht zur Chorion (siehe Protokoll, 2) überwunden werden. dass so wenig Wasser wie möglich sichergestellt wird, zu den Embryonen hinzugefügt (gerade genug...

Ein wesentlicher Bestandteil der das Verständnis, wie die biologische Vielfalt entsteht, wird die genetischen und entwicklungs Basen entwickelt phänotypische Veränderungen in der Natur zu bestimmen. Die Dreistachliger Stichling Fisch, Gasterosteus aculeatus hat als hervorragendes Modell entstand für die genetische Grundlage der Evolution zu studieren. Stichlinge haben viele adaptive evolutionäre Veränderungen erfahren , wie Meeresfische unzählige Süßwasser - Umgebungen auf der ganzen nördlichen Hemisphäre besiedelt haben, in dramatischen morphologischen resultierenden, physiologische und Verhaltensänderungen 1. Den Genomen von Individuen 20-1 stickleback Populationen sequenziert und zusammengesetzt wurden und eine hohe Dichte Kopplungskarte erzeugt wurde , um die Baugruppe 2,3 noch weiter zu verbessern. Die genetische Kartierung Experimente haben genomischen Regionen identifiziert entwickelt Phänotypen zugrunde liegenden 4 - 6, und in einigen Fällen haben die funktionelle Rolle von spezifischen Kandidatengene wurden 7,8 getestet. Eine Reihe von Genomregionen morphologischen Veränderungen zugrunde liegen , wurden mit vielversprechenden Kandidaten - Gene identifiziert, aber diese Kandidaten noch nicht funktionell 9 getestet - 12. Darüber hinaus Stichlinge sind gemeinsame Modelle für Untersuchungen der Populationsgenetik / Genomik 13,14, Speziation 15, Verhalten 1, Endokrinologie 16, Ökotoxikologie 17, Immunologie und Parasitologie 18 19. Zukünftige Untersuchungen in jedem dieser Felder wird von der Fähigkeit profitieren funktionelle genetische Manipulationen in sticklebacks auszuführen. Neben ihrer kodierenden Sequenzen zu manipulieren, können die Rollen von Kandidatengenen durch das Studium ihrer cis - Aufsichtsrechtliche Sequenzen und funktionell steigend, fallend oder Eliminierung der Expression des Kandidatengens zu beurteilen. Mikroinjektions und Transgene Methoden in Stichlinge sind gut 7,8,20 etabliert und wurden ursprünglich entwickelt , unter Verwendung einer Meganuclease-vermittelte21 Verfahren zuerst in Medaka 22 beschrieben. Das modifizierte Mikroinjektions hier vorgestellten Verfahren ist gleichermaßen für Tol2-vermittelte Transgenese optimiert und vor kurzem Genome Editing Reagenzien einschließlich Talens und CRISPRs entwickelt. Änderungen an cis Aufsichtsrechtliche Elemente sind gedacht , um morphologische Entwicklung kritisch zu sein, als cis Aufsichtsrechtliche Veränderungen 23 die negativen pleiotrope Auswirkungen von Codierungs Mutationen vermeiden. Aus diesem Grund hat die Prüfung und den Vergleich mutmaßliche cis Aufsichtsrechtliche Sequenzen ein zentrales Ziel einer zunehmenden Zahl von Evolutionsstudien werden. Darüber hinaus sind die meisten Menschen eine Krankheit Varianten regulatorischen Varianten 24,25 und Modellwirbel Systeme sind sehr cis Aufsichtsrechtliche Element Funktion und Logik erforderlich , um zu studieren. Fische , die ihre Embryonen von außen in großer Zahl befruchten bieten leistungsstarke wirbel Systeme cis -Regelung zu studieren. Die Tol2 Transposon System, bei dem foreign DNA in das Genom integriert werden soll , wird flankiert von Tol2 Transposase Websites und Bindung koinjizierten mit Tol2 Transposase mRNA arbeitet, mit hoher Effizienz für die erfolgreiche Integration von Plasmid in Fisch - Genome - Konstrukte 26 - 28. Typischerweise wird ein potentieller Enhancer stromaufwärts von einem basalen Promotor kloniert (wie hsp70l 29) und fluoreszierendes Reportergens wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder mCherry in einem Tol2 Rückgrat und injizierte mit Transposase mRNA 26. Die Beobachtung der Expression des fluoreszierenden Reporter, entweder in injizierten Embryonen oder Nachkommen mit stabil integrierten Transgene, liefert Informationen über die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression durch die vermeintliche Enhancer angetrieben. In weiteren Experimenten validiert Enhancer verwendet werden gewebespezifische Überexpression von Genen von Interesse zu fahren. Für die Analyse von größeren cis Aufsichtsrechtliche Regionen, hochwertige Großeinsatz genomic Bibliotheken bakterielle künstliche Chromosomen (BACs) verwendet haben 30 für beide Meeres- und Süßwasser Stichlinge gebaut. Diese BACs kann recombineered ein Gen mit einem fluoreszierenden Reporter - Gen in Zusammenhang mit einer großen (150-200 kb) genomischen Region 31 zu ersetzen. Die fluoreszierenden Reporter wird dann in einem Raum-Zeit-Muster ausgedrückt als durch regulatorische Sequenzen innerhalb des BAC bestimmt. Für Studien in Fisch kann Tol2 Sites zur BAC hinzugefügt werden 32,33 genomische Integration zu erleichtern. In späteren Stadien der Entwicklung , wenn in situ Hybridisierung technisch anspruchsvoll ist, kann die Fluoreszenz Auslesen des BAC verwendet werden , um Muster der Genexpression zu untersuchen, wie sie für stickleback Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) 20 gezeigt. Zusätzlich können fluoreszierende Expressionsmuster in einem Individuum über die Zeit verfolgt werden, die nicht mit in situ Hybridisierung durchgeführt werden. BACs auch eine additiona hinzuzufügen verwendet werdenl Kopie einer genomischen Region Dosierung eines Gens von Interesse zu erhöhen. Zur Untersuchung der Genfunktion, Genom Bearbeitung ist eine explosionsartig expandierenden Bereich, der verwendet werden kann , gezielt Änderungen an genomische Sequenzen in einer Vielzahl von Organismen , 34 zu erzeugen. Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens) sind modular aufgebaut, sequenzspezifische Nukleasen ursprünglich aus Pflanzenpathogene isoliert , die genau direkt zu einer genomischen Sequenz der Wahl zu binden , konstruiert werden können , und ein Doppelstrang 35,36 brechen erzeugen. Clustered regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CAS - Systeme wurden ursprünglich in Bakterien gefunden und eine Führung RNA verwenden und die Cas9 Protein eine Pause in einer Ziel - DNA - Sequenz , die komplementär zu der Führung 37 zu erzeugen. Die anschließende Reparatur des Doppelstrangbruchs beiden erstellt von TALENS und CRISPRs hinterlässt häufig eine kleine Insertion oder Deletion, die die Funktion der Zielsequenz stören können35-37. In Stichlinge wurden Talens verwendet Genexpression stören durch einen Verstärker 20 Targeting, und beide Talens und CRISPRs wurden in kodierenden Sequenzen (nicht veröffentlichte Daten) erfolgreich Mutationen erzeugt. Ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von CRISPRs für den Einsatz in Zebrabärbling als Richtlinie verwendet werden 38 CRISPRs für Stichlinge zu entwickeln. Transgene und Genombearbeitungs Experimente erfordern Einführung von Nukleinsäuren in eine neu-Zellen embryo gedüngt. Durch Einführen des Transgens oder Genom-Bearbeitungswerkzeug früh in der Entwicklung, die Anzahl von genetisch manipulierten Tochterzellen im Embryo maximiert. Injizierten Embryonen werden dann visuell auf Fluoreszenz abgeschirmt oder molekular für Genom-Modifikationen durchmustert. Wenn Zellen zu der Keimbahn beitragen erfolgreich ausgerichtet sind, kann das Transgen oder Mutation werden, um eine Untergruppe von Nachkommen weitergegeben, auch wenn Nacheinspritzung Lethalität hoch ist. Die Mosaik-Fisch kreuzt werden kann, oderintercrossed und deren Nachkommen gesiebt, um die mutierten Allele oder ein stabil integriertes Transgen von Interesse zu erholen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für Transgene und Genom Bearbeitung von Reagenzien in einer Zell stickleback Embryonen und Überwachung für eine erfolgreiche genomischen Änderungen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="647">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Stereomicroscope with transillumination</td>
			<td style="width:145px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">S6e/ KL300 LED</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Manual micromanipulator</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MM33</td>
			<td style="width:167px;">Marzhauser M33 Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pressure Injecion system</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPPI-3</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Back pressure unit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">BPU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette holder kit</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">MPIP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Magnetic base holder</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">Magnetic base</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Foot switch</td>
			<td style="width:145px;">Applied Scientific Instrumentation</td>
			<td style="width:119px;">FSW</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Iron plate (magnetic base)</td>
			<td style="width:145px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">IP</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:145px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Disposable transfer pipettes</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5% phenol red in DPBS</td>
			<td style="width:145px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">P0290</td>
			<td style="width:167px;">injection tracer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">#5 forceps, biologie dumoxel&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td style="width:167px;">for needle breaking</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Micropipette Storage Jar</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">E210</td>
			<td>holds needles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">6&#34;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td>
			<td style="width:145px;">Lenox</td>
			<td>20571 (S636RP)</td>
			<td>hold eggs for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">13 cm x 13 cm glass plate</td>
			<td style="width:145px;">any hardware store</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&#160;</td>
			<td style="width:145px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:119px;">1B100-F4</td>
			<td style="width:167px;">*harder glass than zebrafish injection capillaries</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">150 x 15mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td>raise stickleback embryos</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 x 10mm petri dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">08-757-100A</td>
			<td>store eggs pre-injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instant Ocean Salt</td>
			<td style="width:145px;">Instant Ocean</td>
			<td>SS15-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tricaine methanesulfonate/MS-222</td>
			<td style="width:145px;">Western Chemical Inc</td>
			<td style="width:119px;">MS222</td>
			<td style="width:167px;">fish anaesthesia/euthanasia</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Sp6 transcription kit</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM1340</td>
			<td style="width:167px;">For transcription of TALENs and transposase mRNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RNeasy cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td style="width:167px;">purify transposase or TALEN RNA</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QiaQuick PCR cleanup kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28104</td>
			<td style="width:167px;">clean up plasmids for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Proteinase K 20 mg/ml</td>
			<td style="width:145px;">Ambion</td>
			<td style="width:119px;">AM2546</td>
			<td style="width:167px;">for DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nucleobond BAC 100 kit</td>
			<td style="width:145px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740579</td>
			<td>for BAC DNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NotI</td>
			<td style="width:145px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">F-530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12943</td>
			<td style="width:167px;">contains endotoxin rinse buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">QIAQuick Gel Extraction</td>
			<td style="width:145px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28704&#160;</td>
			<td>for sequencing induced mutations</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P2069-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>S2889-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ethanol (molecular biology grade)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>E7023-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50X Tris-acetate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">B49</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.5-10KbRNA ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nanodrop&#160; Spectrophotometer</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10X PBS</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1kb Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NP-40</td>
			<td style="width:145px;">ThermoFisher</td>
			<td>28324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td>P1379-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris pH 8.3</td>
			<td style="width:145px;">Teknova</td>
			<td>T1083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">12-strip PCR tube</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AB-1113</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

Die Dreistachliger Stichling Fisch hat sich als leistungsfähiges System entstanden, die genetische Basis einer Vielzahl von morphologischen, physiologischen und verhaltens Phänotypen zu untersuchen. Die bemerkenswert unterschiedlichen Phänotypen, die sich entwickelt haben als die Populationen im Meer zu unzähligen Süßwasser-Umgebungen anzupassen, kombiniert mit der Fähigkeit Meeres- und Süßwasserformen zu überqueren, bieten einen seltenen wirbel System, bei dem Genetik verwendet werden können genomische Regionen abzubilden Züge entwickelt steuern. Ausgezeichnete genomische Ressourcen sind ab sofort verfügbar, molekulargenetische Dissektion entwickelt Änderungen zu erleichtern. Während Kartierungsexperimente Listen interessante Kandidatengene erzeugen, sind funktionelle genetische Manipulationen erforderlich, um die Rolle dieser Gene zu testen. Die Genregulation können mit transgenen Reporter Plasmide und BACs integriert in das Genom untersucht werden, unter Verwendung des Tol2 Transposase-System. Funktionen von spezifischen Kandidatengene und cis - Aufsichtsrechtliche Elemente können durch Induktion gezielt beurteilt werdenMutationen mit TALEN und CRISPR / Cas9 Genome Editing Reagenzien. Alle Methoden erfordern Nukleinsäuren in befruchtete eine Zelle stickleback Embryonen Einführung machte eine Aufgabe, durch die dicke Chorion von stickleback Embryonen herausfordernd und die relativ kleinen und dünnen Blastomere. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Nukleinsäuren in stickleback Embryonen für transgene und Genombearbeitungsanwendungen beschrieben Genexpression und Funktion zu untersuchen, ebenso wie Techniken, um den Erfolg der Transgenese zu bewerten und stabile Linien wiederherzustellen.

Für Reportergen Transgenen , die Enhancer - Aktivität aufweisen, führt erfolgreiche Injektion in spezifische, zelluläre Expression des Transgens (4A, 4C). Eingespritzte Fische können dann kreuzt werden , um stabile Linien (Beispiel einer BAC stabilen Linie in 4B gezeigt) zu erzeugen. Die Injektion von DNA in stickleback Embryonen führt in der Regel weit höher Letalität als RNA allein. Es ist typisch auf 50% zu sehen , nach oben (...

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Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

microinjection-for-transgenesis-genome-editing-threespine

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.8K Aufrufe.  University of California, Berkeley.  Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling. 

Serie: Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

The question of how chromatin regulators and chromatin states affect the genome in vivo is key to our understanding of how early cell fate decisions are made in the developing embryo. ChIP-Seq&#8212;the most popular approach to investigate chromatin features at a global level&#8212;is outlined here for Xenopus embryos.

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Mosaic Zebrafisch Transgenese für Funktionelle Genomanalyse Candidate Cooperative Gene in Tumor Pathogenese

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Mikrostrukturierter Apparate für optimierte Mikroinjektion und Imaging von Zebrafischlarven

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Mikroinjektion basierenden System für In Vivo Implantation von embryonalen Kardiomyozyten des aviären Embryos

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

Ei-Mikroinjektion und effiziente Mating für die Genombearbeitung im Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Gehirnorganoid-Erzeugung aus induzierten pluripotenten Stammzellen in hausgemachten Mini-Bioreaktoren

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...