Name: microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
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Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH R01 # DE021475 (CTM), ein NIH Predoctoral Ausbildungsbeihilfe 5T32GM007127 (PAE) und ein NSF Graduate Research Fellowship (NAE) gefördert. Wir danken Kevin Schwalbach für die Durchführung BAC Recombineering und Injektionen, Nick Donde zur Erzeugung von Sequenzierungsdaten CRISPR Sanger und Katherine Lipari für hilfreiche Rückmeldung über die Injektionsprotokoll.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Injizieren einer Zell stickleback Embryonen für die Transgenese oder Genom Bearbeitung präsentiert drei wichtigsten Herausforderungen. Zuerst in Bezug auf Genaktivität, die stickleback embryonalen Chorion ist hart und wird oft Nadeln brechen. Dieses Problem kann teilweise durch Verwendung dicker und stärker Glasmikropipetten und Einspritzen senkrecht zur Chorion (siehe Protokoll, 2) überwunden werden. dass so wenig Wasser wie möglich sichergestellt wird, zu den Embryonen hinzugefügt (gerade genug, um das Chorion zu verursachen aus der Zelle zu quellen und heben weg) hilft Chorion Härte zu reduzieren. Das Chorion härtet im Laufe der Zeit, so arbeiten schnell, nachdem die Embryonen Befeuchtung ist wichtig. Halten der Embryonen in einer Feuchtigkeitskammer vor der Injektion, so daß sie nicht austrocknen ist ebenfalls kritisch. Einige Kupplungen und sogar einzelne Embryonen haben einfach viel dicker und härter Chorion; manchmal Bewegen auf die nächste Embryo oder mit einer neuen Kupplung versucht ist die einfachste Lösung. Es ist viel einfacher, ein d zu überspringen<html> ifficult Embryo als eine beschädigte Nadel zu ersetzen. Backup-Nadeln bereit Injektionen können im Fall von Nadelbruch fortzusetzen. Wenn BACs Injizieren, ist es üblich, die Nadel zu verstopfen. Die Nadel kann durch leichtes Kratzen oder wieder brechen die Spitze mit einer Pinzette unclogged werden oder durch den konstanten Luftdruckschalter mit dem Clog zu spülen. Zweitens im Embryo die erste Zelle zu identifizieren ist eine Herausforderung; es ist oft ziemlich abgeflacht und schwierig für Anfänger, um zu sehen, und ist besonders sichtbar, wenn sie direkt an sie suchen. Oft kann der Blastomere nur als leicht angehoben Beule im Profil zu sehen. Daher ist es am besten , die Zelle im Profil (3B) zu identifizieren und dann drehen sanft den Embryo nach vorn und zur Seite , so wird die Zelle das Ende der abgewinkelte Nadel stellen (obwohl die Zelle oft unsichtbar sein wird , aus diesem Blickwinkel, der dunklere Farbe der Blastomere in Abbildung 3 ist aus Gründen der Klarheit übertrieben). e_content &quot;&gt; Drittens ist das Zytoplasma Targeting auch schwierig, vor allem, wenn die erste Zelle besonders flach. für den dicksten Teil der Blastomere Ziel (in der Regel der Mittelpunkt) die Möglichkeit des Einspritzens in Zytoplasma verbessert. Während in der Nähe von dem Cytoplasma in den Dotter Injizieren erfolgreich transgene Fische produzieren, scheint die Effizienz zu erhöhen und die Letalität verringert, wenn das Zytoplasma mit einer einzigen Nadeleinstich ausgerichtet ist. Manchmal werden einzelne Kupplungen besonders dünne Blastomeren aufweisen, so dass das Eigelb zu vermeiden fast unmöglich ist. Warten länger als 25 min beginnen Injektionen helfen können (einige Kupplungen bis ~ 45 min nach der Befruchtung nicht eine volle Größe Blastomere bilden), aber wenn die Blastomeren nie in der Größe zu erhöhen, ist es oft einfacher, eine neue Kupplung von Eiern zu erhalten, als zu versuchen, abgeflachten Zellen zu injizieren . Übermäßige Letalität folgenden Injektionen können aus verschiedenen Gründen auftreten. Blunt Nadeln und / oder eine zu große Nadelbohrung Größe verursachen too viel Schaden an der Zelle und / oder Ursache Cytoplasma austreten. Einige DNA-Konstrukte scheinen besonders tödlich zu sein; kann die Konzentration von DNA Senkung verbessern Überleben, aber niedriger Transgene Raten. Aufräumen Plasmide zuerst mit einem Midiprep-Kit, das eine Endotoxin Spülung enthält durch eine zweite PCR-Cleanup Kit gefolgt verringert die Toxizität konstruieren. Schließlich kann Genom Bearbeitung eines Funktionsverlust-Mutation erzeugen, die sich entwickelnden Embryonen tödlich ist. Reduzierung der Konzentration des CRISPR oder TALEN mRNAs können die mosaicism des Embryos erhöhen, um Letalität zu verhindern, kann aber mutiertes Allel Rückgewinnungseffizienz reduzieren. Ein zuvor veröffentlichten Protokoll für transgene Stichlinge Erzeugen eines Meganuclease Verfahren 21 berichtete über eine 4-7% Transgen Keimbahn - Übertragungsrate von F 0 Gründer Fisch verwendet wird . Die Tol2 Methode hier ergab berichtet in mehreren genomischen integrat bis zu 72% Transgen Keimbahn - Übertragungsrate von F 0 Gründer Fisch ( was anzeigt ,Ionen). Die früheren Studie eine Meganuclease Methode berichteten 40% der injizierten Embryonen zeigen spezifische GFP-Expression, ähnlich der hier berichtet. Während also ähnliche Raten von transgenen F 0 Gründer für transgene Fische sowohl durch die Meganuclease und Tol2 Methoden erzeugt beobachtet werden, die Keimbahn - Übertragungsrate scheint viel höher für Tol2 vermittelte transgenics. Als Genome Editing-Technologien werden weiter voran, noch spezifischere genetische Manipulationen möglich geworden, in Stichlinge und andere Fischarten. Zum Beispiel gerichtet Reparatur 46 und homologe Rekombination ermöglicht Allel - Swaps zwischen Meeres- und Süßwasser stickleback Genome und modifizierte CRISPRs können gezielt eingesetzt werden , um zu aktivieren oder die Genexpression 47 hemmen. Diese spannende Technologien für die Genom Bearbeitung und Analyse über die genetische Basis vieler interessanter morphologischer und physiologischer Merkmale zu neuen Erkenntnissen führen und Verhaltens Phänotypen in STICklebacks und andere Fischarten.

Ein wesentlicher Bestandteil der das Verständnis, wie die biologische Vielfalt entsteht, wird die genetischen und entwicklungs Basen entwickelt phänotypische Veränderungen in der Natur zu bestimmen. Die Dreistachliger Stichling Fisch, Gasterosteus aculeatus hat als hervorragendes Modell entstand für die genetische Grundlage der Evolution zu studieren. Stichlinge haben viele adaptive evolutionäre Veränderungen erfahren , wie Meeresfische unzählige Süßwasser - Umgebungen auf der ganzen nördlichen Hemisphäre besiedelt haben, in dramatischen morphologischen resultierenden, physiologische und Verhaltensänderungen 1. Den Genomen von Individuen 20-1 stickleback Populationen sequenziert und zusammengesetzt wurden und eine hohe Dichte Kopplungskarte erzeugt wurde , um die Baugruppe 2,3 noch weiter zu verbessern. Die genetische Kartierung Experimente haben genomischen Regionen identifiziert entwickelt Phänotypen zugrunde liegenden 4 - 6, und in einigen Fällen haben die funktionelle Rolle von spezifischen Kandidatengene wurden 7,8 getestet. Eine Reihe von Genomregionen morphologischen Veränderungen zugrunde liegen , wurden mit vielversprechenden Kandidaten - Gene identifiziert, aber diese Kandidaten noch nicht funktionell 9 getestet - 12. Darüber hinaus Stichlinge sind gemeinsame Modelle für Untersuchungen der Populationsgenetik / Genomik 13,14, Speziation 15, Verhalten 1, Endokrinologie 16, Ökotoxikologie 17, Immunologie und Parasitologie 18 19. Zukünftige Untersuchungen in jedem dieser Felder wird von der Fähigkeit profitieren funktionelle genetische Manipulationen in sticklebacks auszuführen. Neben ihrer kodierenden Sequenzen zu manipulieren, können die Rollen von Kandidatengenen durch das Studium ihrer cis - Aufsichtsrechtliche Sequenzen und funktionell steigend, fallend oder Eliminierung der Expression des Kandidatengens zu beurteilen. Mikroinjektions und Transgene Methoden in Stichlinge sind gut 7,8,20 etabliert und wurden ursprünglich entwickelt , unter Verwendung einer Meganuclease-vermittelte21 Verfahren zuerst in Medaka 22 beschrieben. Das modifizierte Mikroinjektions hier vorgestellten Verfahren ist gleichermaßen für Tol2-vermittelte Transgenese optimiert und vor kurzem Genome Editing Reagenzien einschließlich Talens und CRISPRs entwickelt. Änderungen an cis Aufsichtsrechtliche Elemente sind gedacht , um morphologische Entwicklung kritisch zu sein, als cis Aufsichtsrechtliche Veränderungen 23 die negativen pleiotrope Auswirkungen von Codierungs Mutationen vermeiden. Aus diesem Grund hat die Prüfung und den Vergleich mutmaßliche cis Aufsichtsrechtliche Sequenzen ein zentrales Ziel einer zunehmenden Zahl von Evolutionsstudien werden. Darüber hinaus sind die meisten Menschen eine Krankheit Varianten regulatorischen Varianten 24,25 und Modellwirbel Systeme sind sehr cis Aufsichtsrechtliche Element Funktion und Logik erforderlich , um zu studieren. Fische , die ihre Embryonen von außen in großer Zahl befruchten bieten leistungsstarke wirbel Systeme cis -Regelung zu studieren. Die Tol2 Transposon System, bei dem foreign DNA in das Genom integriert werden soll , wird flankiert von Tol2 Transposase Websites und Bindung koinjizierten mit Tol2 Transposase mRNA arbeitet, mit hoher Effizienz für die erfolgreiche Integration von Plasmid in Fisch - Genome - Konstrukte 26 - 28. Typischerweise wird ein potentieller Enhancer stromaufwärts von einem basalen Promotor kloniert (wie hsp70l 29) und fluoreszierendes Reportergens wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder mCherry in einem Tol2 Rückgrat und injizierte mit Transposase mRNA 26. Die Beobachtung der Expression des fluoreszierenden Reporter, entweder in injizierten Embryonen oder Nachkommen mit stabil integrierten Transgene, liefert Informationen über die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression durch die vermeintliche Enhancer angetrieben. In weiteren Experimenten validiert Enhancer verwendet werden gewebespezifische Überexpression von Genen von Interesse zu fahren. Für die Analyse von größeren cis Aufsichtsrechtliche Regionen, hochwertige Großeinsatz genomic Bibliotheken bakterielle künstliche Chromosomen (BACs) verwendet haben 30 für beide Meeres- und Süßwasser Stichlinge gebaut. Diese BACs kann recombineered ein Gen mit einem fluoreszierenden Reporter - Gen in Zusammenhang mit einer großen (150-200 kb) genomischen Region 31 zu ersetzen. Die fluoreszierenden Reporter wird dann in einem Raum-Zeit-Muster ausgedrückt als durch regulatorische Sequenzen innerhalb des BAC bestimmt. Für Studien in Fisch kann Tol2 Sites zur BAC hinzugefügt werden 32,33 genomische Integration zu erleichtern. In späteren Stadien der Entwicklung , wenn in situ Hybridisierung technisch anspruchsvoll ist, kann die Fluoreszenz Auslesen des BAC verwendet werden , um Muster der Genexpression zu untersuchen, wie sie für stickleback Bone morphogenetic protein 6 (BMP6) 20 gezeigt. Zusätzlich können fluoreszierende Expressionsmuster in einem Individuum über die Zeit verfolgt werden, die nicht mit in situ Hybridisierung durchgeführt werden. BACs auch eine additiona hinzuzufügen verwendet werdenl Kopie einer genomischen Region Dosierung eines Gens von Interesse zu erhöhen. Zur Untersuchung der Genfunktion, Genom Bearbeitung ist eine explosionsartig expandierenden Bereich, der verwendet werden kann , gezielt Änderungen an genomische Sequenzen in einer Vielzahl von Organismen , 34 zu erzeugen. Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens) sind modular aufgebaut, sequenzspezifische Nukleasen ursprünglich aus Pflanzenpathogene isoliert , die genau direkt zu einer genomischen Sequenz der Wahl zu binden , konstruiert werden können , und ein Doppelstrang 35,36 brechen erzeugen. Clustered regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CAS - Systeme wurden ursprünglich in Bakterien gefunden und eine Führung RNA verwenden und die Cas9 Protein eine Pause in einer Ziel - DNA - Sequenz , die komplementär zu der Führung 37 zu erzeugen. Die anschließende Reparatur des Doppelstrangbruchs beiden erstellt von TALENS und CRISPRs hinterlässt häufig eine kleine Insertion oder Deletion, die die Funktion der Zielsequenz stören können35-37. In Stichlinge wurden Talens verwendet Genexpression stören durch einen Verstärker 20 Targeting, und beide Talens und CRISPRs wurden in kodierenden Sequenzen (nicht veröffentlichte Daten) erfolgreich Mutationen erzeugt. Ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von CRISPRs für den Einsatz in Zebrabärbling als Richtlinie verwendet werden 38 CRISPRs für Stichlinge zu entwickeln. Transgene und Genombearbeitungs Experimente erfordern Einführung von Nukleinsäuren in eine neu-Zellen embryo gedüngt. Durch Einführen des Transgens oder Genom-Bearbeitungswerkzeug früh in der Entwicklung, die Anzahl von genetisch manipulierten Tochterzellen im Embryo maximiert. Injizierten Embryonen werden dann visuell auf Fluoreszenz abgeschirmt oder molekular für Genom-Modifikationen durchmustert. Wenn Zellen zu der Keimbahn beitragen erfolgreich ausgerichtet sind, kann das Transgen oder Mutation werden, um eine Untergruppe von Nachkommen weitergegeben, auch wenn Nacheinspritzung Lethalität hoch ist. Die Mosaik-Fisch kreuzt werden kann, oderintercrossed und deren Nachkommen gesiebt, um die mutierten Allele oder ein stabil integriertes Transgen von Interesse zu erholen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für Transgene und Genom Bearbeitung von Reagenzien in einer Zell stickleback Embryonen und Überwachung für eine erfolgreiche genomischen Änderungen.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with transillumination</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Manual micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 Micromanipulator</td></tr><tr><td>Pressure Injecion system</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Back pressure unit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette holder kit</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Magnetic base holder</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>Magnetic base</td><td></td></tr><tr><td>Foot switch</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Iron plate (magnetic base)</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Disposable transfer pipettes</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0.5% phenol red in DPBS</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P0290</td><td>injection tracer</td></tr><tr><td>#5 forceps, biologie dumoxel&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>for needle breaking</td></tr><tr><td>Micropipette Storage Jar</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>holds needles</td></tr><tr><td>6&quot;, 6 teeth per inch plaster drywall saw</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td><td>hold eggs for injection</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm glass plate</td><td>any hardware store</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID&amp;nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*harder glass than zebrafish injection capillaries</td></tr><tr><td>150 x 15mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>raise stickleback embryos</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Petri dish</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>store eggs pre-injection</td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>fish anaesthesia/euthanasia</td></tr><tr><td>Sp6 transcription kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>For transcription of TALENs and transposase mRNA</td></tr><tr><td>RNeasy cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>purify transposase or TALEN RNA</td></tr><tr><td>QiaQuick PCR cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>clean up plasmids for injection</td></tr><tr><td>Proteinase K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>for DNA preparation</td></tr><tr><td>Nucleobond BAC 100 kit</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>for BAC DNA preparation</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymerase</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen PlasmidPlus Midi kit</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>contains endotoxin rinse buffer</td></tr><tr><td>QIAQuick Gel Extraction</td><td>Qiagen</td><td>28704&amp;nbsp;</td><td>for sequencing induced mutations</td></tr><tr><td>Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (molecular biology grade)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Tris-acetate-EDTA buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0.5-10 Kb RNA ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop&amp;nbsp; Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus DNA Ladder</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8.3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>12-strip PCR tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

microinjection for transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks

Die Dreistachliger Stichling Fisch hat sich als leistungsfähiges System entstanden, die genetische Basis einer Vielzahl von morphologischen, physiologischen und verhaltens Phänotypen zu untersuchen. Die bemerkenswert unterschiedlichen Phänotypen, die sich entwickelt haben als die Populationen im Meer zu unzähligen Süßwasser-Umgebungen anzupassen, kombiniert mit der Fähigkeit Meeres- und Süßwasserformen zu überqueren, bieten einen seltenen wirbel System, bei dem Genetik verwendet werden können genomische Regionen abzubilden Züge entwickelt steuern. Ausgezeichnete genomische Ressourcen sind ab sofort verfügbar, molekulargenetische Dissektion entwickelt Änderungen zu erleichtern. Während Kartierungsexperimente Listen interessante Kandidatengene erzeugen, sind funktionelle genetische Manipulationen erforderlich, um die Rolle dieser Gene zu testen. Die Genregulation können mit transgenen Reporter Plasmide und BACs integriert in das Genom untersucht werden, unter Verwendung des Tol2 Transposase-System. Funktionen von spezifischen Kandidatengene und cis - Aufsichtsrechtliche Elemente können durch Induktion gezielt beurteilt werdenMutationen mit TALEN und CRISPR / Cas9 Genome Editing Reagenzien. Alle Methoden erfordern Nukleinsäuren in befruchtete eine Zelle stickleback Embryonen Einführung machte eine Aufgabe, durch die dicke Chorion von stickleback Embryonen herausfordernd und die relativ kleinen und dünnen Blastomere. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Nukleinsäuren in stickleback Embryonen für transgene und Genombearbeitungsanwendungen beschrieben Genexpression und Funktion zu untersuchen, ebenso wie Techniken, um den Erfolg der Transgenese zu bewerten und stabile Linien wiederherzustellen.

Für Reportergen Transgenen , die Enhancer - Aktivität aufweisen, führt erfolgreiche Injektion in spezifische, zelluläre Expression des Transgens (4A, 4C). Eingespritzte Fische können dann kreuzt werden , um stabile Linien (Beispiel einer BAC stabilen Linie in 4B gezeigt) zu erzeugen. Die Injektion von DNA in stickleback Embryonen führt in der Regel weit höher Letalität als RNA allein. Es ist typisch auf 50% zu sehen , nach oben (manchmal sogar mehr) Letalität oder Malformation (siehe Abbildung 4D - F, 4E) nach Tol2 Reporter Injektion Konstrukte (ähnlich dem zuvor beschriebenen Verfahren Meganuclease 21). Allerdings unterscheiden sich die Ergebnisse auf dem spezifischen Konstrukt, dem Embryo Morphologie weit basiert und Skill-Level. Für einen aktiven Verstärker, 40-50% der Embryonen werden im allgemeinen gewebespezifische Expression des Transgens, beispielsweise in den mittleren und Brustflossen (F zeigenild 5). Der Grad der Hintergrund und nicht - spezifische Fluoreszenz (Figur 4G - I) variiert in Abhängigkeit von dem verwendeten Promotor weithin basiert; Der Zebrafisch hsp70l Promotor dazu neigt , in Muskel- und Nervengewebe leaky, besonders zu sein, und neigen dazu , BACs hohe Hintergrundexpression in den Dotter (ähnlich Figur 4G) zu haben. Der Karpfen Beta Aktin 41 Promotor ist weniger undicht , sondern auch Laufwerke deutlich schwächer GFP - Expression. Übertragung des Plasmids Tol2 Transgenen kann hoch sein, mit bis zu 100% der GFP + F 0 Fisch Herstellung von transgenen Nachkommen (Tabelle 2). Allerdings variiert der Prozentsatz der Nachkommen das Transgen trägt , weit, von &lt;1% bis 72% (Tabelle 2). Speichern nur GFP + injizierten Embryonen erhöht im Allgemeinen die Übertragungseffizienz. BACs neigen weitaus geringere Transgene Raten aufweisen, mit nur bis zu 10% von F 0 injiziert stickleback Embryonen in erwarteten Gewebe zeigt Fluoreszenz. Die transMission Rate von BACs ist geringer als die von Plasmid - Konstrukte, mit nur bis zu 14% der gescreenten stickleback die BAC (Tabelle 2) zu übertragen, die auf den ausgewiesenen Übertragungsrate von 15% in Zebrabärbling 32 ähnlich ist. Im Gegensatz zu der relativ niedrigen Effizienz der BAC Transgenese, typischerweise 70-100% der gescreenten Fisch mit TALENS injiziert mosaic Läsionen (in n = 10 injiziert Kupplungen, die für Läsionen gescreent wurden). Diese Zahl könnte mit einem weniger effizienten TALEN Paar niedriger sein, und mit Injektionsqualität variieren. 6 zeigt eine PCR / Restriktionsverdau für 10 Embryonen aus einer einzigen Kupplung injiziert mit Talens eine PvuII Schnitt - Stelle innerhalb Tfap2a Targeting. Eine ungeschnittene Amplikon in jeder der injizierten Embryonen (Spuren 1-10) zeigt an, dass ein Teil der Zellen in jedem Embryo Läsionen an der Target-Locus tragen, obwohl jeder Embryo mit einem signifikanten Wildtyp cut Band hoch mosaic ist. the Amplikon von injizierten Embryonen in den Spuren 11-12 sind mit PvuII vollständig verdaut. TALEN induzierte Mutationen werden leicht auf die nächste Generation übertragen wird. Mit zwei verschiedenen TALEN setzt, 50% und 90% der durchleuchteten F 0 s Läsionen übertragen Nachkommen mit 20-90% der Nachkommen Läsionen in positive Kupplungen (Tabelle 3) trägt. Während CRISPR / Cas9 Effizienz hat in stickleback, mit einer CRISPR Führungs Targeting Pitx2, eine von drei injizierten Embryonen hatten Läsionen basierend auf Sanger Sequenzierung eines PCR - Produkt des CRISPR Ziel (das ungeschnittene Band wurde nach sequenziert Restriktionsverdau, Figur nicht optimiert 7). Der Verlust von Sequenzqualität an der Schnittstelle vorhergesagt zeigt eine Mischung aus molekularen Läsionen vorliegen. Fin Ausschnitt erwachsenen F 0 Fisch und Screening für Läsionen eine PCR und Restriktionsverdau - Test unter Verwendung gefunden 22.10 Fisch mit somatischen Läsionen in der Seitenflosse. Eine repräsentative Untergruppe dieser Tiere sind in Abbildung 8 gezeigt &lt;/ Strong&gt;; 3 einzelne # weist einen hohen Prozentsatz an DNA mit Läsionen, während einzelne # 2 einen geringen Prozentsatz an DNA mit Läsionen aufweist. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54055/54055fig4.jpg" /> Abbildung 4. Beispiele von injizierten Embryonen. (A) Mosaic Embryo mit einem Enhancer injiziert , die GFP - Expression in Brust (Stern) und mittlere Rippen (Pfeilspitze) bei 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) antreibt. Maßstabsbalken = 500 &amp; mgr; m. (B) Stabile Leitung eines Reporter BAC , die GFP - Expression im embryonalen Herzen bei 4 dpf antreibt. (C) Mosaic Embryo mit einem Col2a1a Enhancer injiziert , die mCherry Ausdruck in der Chorda bei 4 dpf antreibt. Der Col2 a1a Enhancer wurde aus stickleback DNA mit Primern kloniert 5&#39;-CGCTCCTTGAGGGTTTGAGCTG-3 &#39;und 5&#39;-ATACTGTGCTCATTTCGGCCGT-3&#39; , die die konservierte orthologen Enhancer berichtet in Dale und Topczewski amplifizieren2011 45. (D) Beispiel eines normalerweise injizierten Embryos entwickeln. (E - F) Beispiele für fehlerhafte Embryonen mit Injektions Trauma; E fehlt das linke Auge und F hat nekrotischen Gewebes entlang der rechten Seite (Pfeilspitzen). (G) Beispiel für diffuse GFP - Expression in Eigelb, wahrscheinlich das Ergebnis der Injektion in den Dotter statt der Blastomere. (H) Beispiel der unspezifischen GFP - Expression in der Epidermis (Pfeilspitze). (I) Helle, unspezifisch, granulare GFP - Expression. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54055/54055fig5.jpg" /> Abbildung 5. Effizienz der Reporterkonstrukt Injektion. Zehn Kupplungen wurden mit einem 190 bp stickleback BMP6 Enhancer constr injiziertdukt , die Brustflosse und mittlere Flosse Ausdruck bei 5 dpf 20 antreibt. Von jeder Kupplung wurden mindestens 20 Embryonen mit gewebespezifischen (Brust- und / oder medianen fin) und / oder unspezifische (alle anderen Geweben) GFP-Expression erzielt. Der Prozentsatz der überlebenden Embryonen aller injiziert mit unspezifischen und gewebespezifische Expression als boxplot gezeigt. Horizontale Linien zeigen das erste Quartil, Median und das dritte Quartil; Whiskers erstrecken sich innerhalb von 1,5 IQR (Quartilsabstand) des ersten und dritten Quartil Datum. Die Daten werden von Erickson angepasst et al. 2015 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/54055/54055fig6.jpg" /> Abbildung 6. PCR und Restriktionsverdau für TALEN-induzierten Läsionen zu screenen. Ein TALEN Paar Targeting Tfap2a </em&gt; Wurde erzeugt und wie beschrieben injiziert. DNA wurde hergestellt, wie oben von 2 dpf injizierten Embryonen beschrieben und ein 297 bp Fragment, das die Zielsequenz TALEN umgebenden war PCR durch eine High-Fidelity-DNA-Polymerase amplifiziert unter Verwendung der Primer 5&#39;-GGGTCGTTGACGTGCGAGTAA-3 &#39;und 5&#39;-AGCGGGACAACGTCATCACTTA-3&#39;. Bahnen 1-10 injiziert, Spuren 11-12 sind nicht injizierten, verdaut Kontrollen, und die Spuren 13-14 sind nicht injizierten, unverdaute Kontrollen. PvuII schneidet die Wildtyp-Sequenz in zwei etwa gleich große Bands. Ungeschnittenen Banden zeigen Gegenwart von molekularem Läsionen in der Zielsequenz. Alle injizierten Embryonen in den Spuren 1-10 zeigen Anzeichen von molekularen Läsionen (unverdaute Bänder), aber alle Embryonen entweder monoallelic Mutationen und / oder sind Mosaik , wie sie auch (Wildtyp) Bänder geschnitten haben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier anzuschauen größere Version der Figur.</a> Abbildung 7. Sanger - Sequenzierung aus Mosaik - F 0 CRISPR / Cas9 injizierten Embryo. A CRISPR Führungs RNA (5&#39;-GTGGACCAACCTCACGG-3 &#39;) gegen Pitx2 (oben gezeigt) war coinjiziert mit Cas9 mRNA (transkribiert von pCS2-nCas9n Plasmid als 38 beschrieben) und Embryonen für Läsionen gescreent eine Restriktionsenzym - Assay. Die ungeschnittene Band wurde Gel extrahiert und durch Sanger-Sequenzierung sequenziert. Die Sequenz Qualität verschlechtert an der vorhergesagten Spaltstelle (unten Pfeil) aufgrund der Mosaik - Mix von Läsionen in der injizierten Embryos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig7large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/54055/54055fig8.jpg" /> Abbildung 8. Analyse von CRISPR F 0 Schwanzflosse Clips. Die DNA wurde aus Finne Clips F vorbereitet 0 Jugendlichen aus Embryonen mit CRISPRs gegen Pitx2 injiziert angehoben. Die CRISPR / Cas9 Target wurde mit Primern amplifiziert 5&#39;-CTCGGATGACCCTTCAAAAA-3 &#39;und 5&#39;-GGCCCAAATTACCCACATTT-3&#39;, und das Produkt wurde mit EcoRI verdaut. Vier Individuen gezeigt; ein ungeschnittenen PCR-Produkt ist auf der linken Seite und verdaute PCR-Produkt ist auf der rechten Seite für jeden einzelnen nummeriert. Produkt die Größe des ungeschnittenen Band (~ 230 bp) in der verdauten Spur zeigt das Vorhandensein einer Läsion. Personen, 2, 3 und 4 zeigen alle Anzeichen für eine molekulare Läsion zeigte mit Sternchen, mit mosaicism zwischen Individuen variieren. Relevante Leitergrößen sind auf der linken Seite angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig8large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54055/54055fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bauen </td><td> GFP Nachkommen / total F0 gescreent Fisch (%) </td><td> % F1 - Nachkommen positiv </td><td> Hinweis </td></tr><tr><td> BAC A </td><td> 6/46 (13%) </td><td> 19.04% </td><td></td></tr><tr><td> BAC B </td><td> 1/41 (2%) </td><td> 4% </td><td></td></tr><tr><td> BAC C </td><td> 5/42 (12%) </td><td> 3-40% </td><td></td></tr><tr><td> BAC D </td><td> 3/22 (14%) </td><td> 5-15% </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid-A </td><td> 2/38 (5%) </td><td> 2-5% </td><td> alle F0 Embryonen abgeschirmt, nicht nur GFP + </td></tr><tr><td> Plasmid B </td><td> 3/16 (19%) </td><td> &lt;1-8% </td><td> alle F0 Embryonen abgeschirmt, nicht nur GFP + </td></tr><tr><td> Plasmid-C </td><td> 1/11 (9%) </td><td> 10% </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid-D </td><td> 2/11 (18%) </td><td> 1-45% </td><td> Plasmid D injiziert2 genetischen Hintergrund </td></tr><tr><td> Plasmid-D </td><td> 5/5 (100%) </td><td> 16-72% </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid-E </td><td> 2/3 (67%) </td><td> 22.02% </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid F </td><td> 2/6 (33%) </td><td> &lt;1-65% </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid-G </td><td> 3/8 (38%) </td><td> 2-56% </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid-H </td><td> 3/18 (17%) </td><td> nicht gewertet </td><td></td></tr><tr><td> Plasmid I </td><td> 5/24 (21%) </td><td> nicht gewertet </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 2:. Transgene Übertragungseffizienzen für BACs und Enhancer - Konstrukte F 0 injizierten Embryonen wurden angehoben bis zum Erwachsenenalter und dann kreuzt zu Wildtyp - Fisch und die F 1 Nachkommen erzielte für GFP - Fluoreszenz. Die Anzahl der F 0 Personen, die das Transgen übertragen ist ausdrEssed als Prozentsatz aller 0 Fisch F gescreent. Die prozentualen Bereich von F 1 Nachkommen das Transgen trägt , wird auch für diese Kupplungen gezeigt , die GFP positive Fisch hatte. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> TALEN </td><td> % F0 Übertragung von Läsionen </td><td> % F1 - Nachkommen positiv </td></tr><tr><td> EIN </td><td> 9/10 (90%) </td><td> 20-90% </td></tr><tr><td> B </td><td> 4/8 (50%) </td><td> 20-72% </td></tr></tbody></table> Tabelle 3:. Übertragungseffizienz für zwei TALEN Paare F 0 injizierten Embryonen bis zum Erwachsenenalter angehoben wurden und dann kreuzt zu Wildtyp - Fisch und die Nachkommen F 1 verschaltet für TALEN Läsionen. Der Prozentsatz der injizierten Individuen Übertragung Läsionen wird, sowie der Bereich der Prozentsätze der Nachkommen mit Läsionen in diesen Kupplungen gezeigtendie übertragen Läsionen. TALEN A 20 einen BMP6 Enhancer gezielte, TALEN B gezielte Tfap2a (nicht veröffentlicht).

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Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Mikroinjektions für Transgenese und Genome Editing in Threespine Stichlinge

Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling.

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.9K Aufrufe.  University of California, Berkeley.  Transgene Manipulationen und Genom Bearbeitung sind entscheidend für die funktionell die Rolle von Genen und cis Aufsichtsrechtliche Elemente zu testen. Hier ist eine detaillierte Mikroinjektions Protokoll für die Erzeugung von genomischen Modifikationen (einschließlich Tol2-vermittelte Fluoreszenz-Reporter-Transgen-Konstrukte, Talens, und CRISPRs) für das emergent Modell Fisch vorgestellt, die Dreistachliger Stichling. 

Serie: Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Forschung

Genetik

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Entwicklungsbiologie

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Mikroinjektion von mRNA und Morpholino Antisense Oligonukleotide in Zebrafisch-Embryonen.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologie

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the cerebroventricular microinjection (CVMI) technique as a means to modulate gene expression in the adult zebrafish brain. By using CVMI, substances can be administered into the cerebroventricular fluid and be thoroughly distributed along the rostrocaudal axis of the brain. We particularly focus on the use of antisense morpholino oligonucleotides, which are potent tools for knocking down gene expression in vivo. In our method, when applied, morpholino molecules are taken up by the cells lining the ventricular surface. These cells include the radial glial cells, which act as neurogenic progenitors. Therefore, knocking down gene expression in the radial glial cells is of utmost importance to analyze the widespread neurogenesis response in zebrafish, and also would provide insight into how vertebrates could sustain adult neurogenesis response. Such an understanding would also help the efforts for clinical applications in human neurodegenerative disorders and central nervous system regeneration. Thus, we present the cerebroventricular microinjection method as a quick and efficient way to alter gene expression and neurogenesis response in the adult zebrafish forebrain. We also provide troubleshooting tips and other useful information on how to carry out the CVMI procedure.

In this article, we demonstrate a method for manipulation of gene expression in the ventricular cells of the adult zebrafish telencephalon using antisense morpholino oligonucleotides. We present this method as an efficient and quick protocol that can be used for functional studies in the adult vertebrate brain.

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Neurowissenschaften

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

Mikroinjektion von DNA in Augenknospen in Xenopus laevis Embryonen und Bildgebung von GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Zygoten-Mikroinjektion zur Erzeugung von Genkassetten-, Knock-in- und Flox-Allelen in Mäusen

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Astyanax mexicanus</em&gt; Verwendung von Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite the growing burden of tick-borne diseases, research on ticks has lagged behind insect disease vectors due to challenges in applying genetic transformation tools for functional studies to the unique biology of ticks. Genetic interventions have been gaining attention to reduce mosquito-borne diseases. However, the development of such interventions requires stable germline transformation by injecting embryos. Such an embryo injection technique is lacking for chelicerates, including ticks. Several factors, such as an external thick wax layer on tick embryos, hard chorion, and high intra-oval pressure, are some&#160;obstacles that previously prevented embryo injection protocol development in ticks. The present work has overcome these obstacles, and an embryo injection technique for the black-legged tick, Ixodes scapularis, is described here.&#160;This technique can be used to deliver components, such as CRISPR/Cas9, for stable germline transformations.

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

The present protocol describes a method for injecting tick embryos. Embryo injection is the preferred technique for genetic manipulation to generate transgenic lines.

Embryo-Injektionstechnik zur Gen-Editierung bei der Schwarzbeinigen Zecke (Ixodes scapularis)

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...