We thank the Western University of Health Sciences for the Intramural Grant.

يتم تنفيذ البروتوكول هو موضح أدناه تحت إشراف وموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة الغربية. يتم تنفيذ جميع التجارب في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية ذات الصلة، وتنظيم والهيئات التنظيمية. 1. خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة كاملة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام خزانة السلامة البيولوجية من الدرجة الثانية، وإعداد المتوسطة كاملة عن طريق إضافة جو معقم و مطهر مصل الجنين البقري (FBS) والستربتومايسين البنسلين (P / S) لزجاجة 500 مل من RPMI المتوسطة. المزيج بلطف يحوم. التركيز النهائي من كل ملحق 10٪ FBS و 1٪ P / S (ت / ت). على سبيل المثال، تكملة 500 مل من وسائل الاعلام مع 56 مل FBS و 6 مل P / S. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع المتوسطة كاملة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد وخلايا المكاثره <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد خلايا PANC-1 GFP من النيتروجين السائل. ذوبان الجليد قارورة من الإثارة لطيف في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. ملاحظة:وينبغي أن يكون الذوبان السريع (حوالي 2-3 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسمية T-75 قوارير ليتم استخدامها مع (أ) اسم خط الخلية، تاريخ (ب) عدد مرور، (ج)، وبالاحرف الاولى (د) الباحث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح القارورة مع الايثانول 70٪ ونقل قنينة إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنشر الخلايا، إضافة 9.0 مل من المتوسط ​​الشامل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. باستخدام ماصة 1.0 مل، ونقل بعناية تعليق الخلية وتعليقه في 9 مل من المتوسط ​​الشامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 8 دقائق على RT. نقل قارورة المخروطية إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، ونضح طاف دون الإخلال بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق بيليه في 10 مل من المتوسط ​​كاملة جديدة من قبل pipetting بلطف تعليق صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا مع عدادة الكريات ولوحة منها في T-75 قوارير في مناطق ذات كثافة من 2.1 × 10 6 خلايا / قارورة. ضع قارورة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الخلايا يوميا بالعين وتحت المجهر. إذا الانفلونزامعرف هناك حاجة إلى التجديد، جو معقم و مطهر نضح المتوسط ​​النمو الكامل من القارورة وتجاهل. إضافة حجم مساو من المتوسط ​​كاملة جديدة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشر خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جو معقم و مطهر إزالة المتوسطة من القارورة. إضافة 5 مل من Dulbecco والمالحة العازلة الفوسفات (DPBS) لشطف الخلايا والتخلص منها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا من قارورة وذلك بإضافة 3 مل من التربسين 0.25٪. احتضان القارورة التي تحتوي على التربسين عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪ لمدة 5 إلى 10 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الخلايا تحت المجهر (10X التكبير) وضمان أن تكون مستديرة وينحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحييد التربسين بإضافة حجم مساو من المتوسط ​​كاملة وتفتيت كتل من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ونقل حجم التعليق الخلية المناسبة لقوارير جديدة في كثافة الخلية المذكورة في 1.2.7. إضافة وسائط جديدة بما فيه الكفاية بحيث الحجم النهائي هو 10 مل لكل قارورة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Suspens خليةإعداد أيون لحقن ملاحظة: منذ الغشاء مصفوفة الطابق السفلي، وتركيز عال، يتصلب في RT، والحفاظ على جميع المواد على الجليد. ضع كل نصائح ماصة معقمة وقارورة في الثلاجة بين عشية وضحاها، والحفاظ على الجليد بينما كان يعمل على التعليق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء زجاجة من وسائل الاعلام RPMI دون أي إضافات على الجليد. ذوبان الجليد في غشاء مصفوفة الطابق السفلي، وتركيز عال، وذلك باتباع تعليمات الشركة الصانعة. ويفضل، قسامة في قوارير صغيرة لتجنب متعددة تجميد أذاب دورات 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسائل الإعلام نضح من جميع القوارير، وشطف مع 5 مل من DPBS. كرر جميع الخطوات في القسم السابق تصل إلى الخطوة 1.3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 125 x ج لمدة 8 دقائق على RT. نقل قارورة المخروطية إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وإعادة تعليق بيليه باستخدام 10 مل من DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بلطف تعليق صعودا وهبوطا لتفريق بيليه. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي مرة أخرى كما هو مبين في الصورةتيب 1.4.3. نضح طاف واعتمادا على عدد من الخلايا، إضافة مخفف المناسب لانتاج 3 × 10 6 الخلايا في حجم 50 ميكرولتر. سوف مخفف يكون مزيجا من وسائل الإعلام الحرة في الدم وتركيز عال الغشاء القاعدي مصفوفة في 1: (ت / ت) نسبة 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة تعليق بلطف والحفاظ على الجليد في جميع الأوقات. تعليق جاهز الآن للحقن. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زرع الجراحية ملاحظة: تأكد من أن جميع المواد والأدوات الجراحية المعقمة. ممارسة تقنيات العقيم في جميع الأوقات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وسادة التدفئة على الطاولة، وتغطي مع ثنى العقيمة. إعداد آلة التخدير وضمان كافة المستلزمات هي في متناول الذراع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع خطم الحيوان في قناع التخدير وإعداد التخدير إلى 1 لتر / دقيقة من الأوكسجين و 2.5٪ الأيزوفلورين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فرك بلطف الجهة الحيوان مع اليود، وشطف مع 70٪ من الإيثانول. كرر ثلاث مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكيدهو تخدير الحيوان بالكامل من قبل معسر مخلب هند. الحيوان هو تخدير كامل وعلى استعداد لإجراء عملية جراحية إذا لوحظ أي رد. ومع ذلك، إذا flinches الحيوان، وضمان وجود تخدير كاف في المرذاذ والسماح للحيوان المزيد من الوقت للذهاب تماما تحت التخدير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ما يقرب من 200 ميكرولتر من تعليق خلية في حقنة 1.0 مل السل مع إبرة G 18 (تبريد سابقا). استبدال الإبرة مع 27 G إبرة والعودة إلى الجليد حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد المنطقة العامة للالطحال (الربع العلوي الأيسر من البطن) وباستخدام ملقط قرصة الجلد على رأس تلك المنطقة. باستخدام مقص جراحي إجراء شق ما يقرب من 1.0 سم إلى خلق جيب. وبالمثل، قرصة العضلات الملساء على رأس الطحال وقطع طريق من أجل الوصول إلى التجويف البريتوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتزاع بلطف نهاية الذيلية من الطحال والخروج به من الجسم. وسوف تعلق البنكرياس إلى الطحال. نشر البنكرياس باستخدام الحادي والرطبerile Q-طرف وتحديد ذيل البنكرياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم حقن 50 ميكرولتر في ذيل البنكرياس، وترك الإبرة داخل لمدة 10 ثانية، وتناوب ببطء الإبرة من البنكرياس. وهناك زرع ناجحة تبدو وكأنها فقاعة سطحية دون أي تسرب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العودة البنكرياس والطحال إلى تجويف البريتوني. أولا ضع العضلات ثم أرفق الجلد بشكل منفصل. استخدام خياطة 6-0 أو مشبك لإغلاق الجرح. لتجنب الألم في الحيوان وإدارة كيتوبروفين تحت الجلد (SC) (5 ملغ / كلغ) على مدى 24 ساعة. بدلا من ذلك، إدارة الشوري البوبرينورفين (0،05 حتي 0،1 ملغ / كلغ) كل 12 ساعة خلال فترة 36 ​​ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد الحيوانات من التخدير وإعادته إلى قفصه. كما رصد للألم. يجب توفير الحيوانات مع تخفيف الآلام في وقت (أو حتى قبل - وقائي) عملية جراحية. يجب توفير تخفيف الآلام إضافية للحيوانات التي تواجه الألم وفقا لIACCUC بروتوكول أو على النحو الذي يحدده فيتميل البيطري أو من ينوب عنه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التصوير فيفو ملاحظة: تم تنفيذ التقاط الصور باستخدام نظام التصوير التجاري مجهزة غرفة مظلمة والفلاتر المناسبة للتصوير GFP. تم إنجاز الحصول على الصور باستخدام كاميرا CCD ونظام بصري تتكون من عدسات قابلة للتبديل الإثارة / الانبعاثات (الإثارة: 455-495 نانومتر، الانبعاثات: 513-557 نانومتر). تم القبض على الصور الحقل مشرق بدون فلتر في 1 × 1 binning عن كل نقطة زمنية. الإثارة من GFP استخدمت مصدر زينون ضوء متعدد الأطياف. واستمرت الحيوانات تحت التخدير في جميع مراحل عملية التصوير من خلال ربط جهاز التخدير لمشعب التخدير الغاز المتكامل في غرفة مظلمة من نظام التصوير. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوان على النحو المبين في 1.5.2. قناع التخدير في المناطق الداخلية من غرفة مظلمة نظام التصوير التجاري من أجل الحفاظ على الحيوان تحت التخدير أثناء التصويرعملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الصحيحة الإثارة وانبعاث المرشحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ عن طريق الحصول على الصورة الأولية باستخدام الضوء الأبيض فقط. الحفاظ على نفس الموقف من الحيوانات طوال الدورة التصوير والتحول إلى المرشحات GFP لالتقاط صورة الثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على أفضل النتائج ركب كل من الصور. تحليل صورة لمنطقة الفلورسنت وكثافة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Smyth, E., Cunningham, D., Kasper, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Harrison's Principles of Internal Medicine. , (2015).</li><li>Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+borderline+resectable+pancreatic+cancer.">Management of borderline resectable pancreatic cancer.</a> World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).</li><li>De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+pancreatic+cancer.">Diagnosis and management of pancreatic cancer.</a> Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).</li><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7, 645-658 (2007).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+orthotopic+xenografts:+better+mimic+of+metastasis+than+subcutaneous+xenografts.">Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts.</a> Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+uses+of+fluorescent+proteins+to+visualize+cancer+in+vivo.">The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo.</a> Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).</li><li>Jiang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+orthotopic+pancreatic+cancer+mouse+model:+cells+suspended+and+injected+in+Matrigel.">Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel.</a> World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).</li><li>Arranz, A., Ripoll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+optical+imaging+for+pharmacological+studies.">Advances in optical imaging for pharmacological studies.</a> Front Pharmacol. 6, 189 (2015).</li><li>Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+serial+selection+of+human+pancreatic+cancer+cells+in+orthotopic+mouse+models+produces+high+metastatic+variants+irrespective+of+Kras+status.">In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status.</a> J Surg Res. 184, 290-298 (2013).</li><li>Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice.">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).</li><li>Katz, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+efficacy+of+adjuvant+cytosine-analogue+CS-682+in+a+fluorescent+orthotopic+model+of+human+pancreatic+cancer.">Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer.</a> Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).</li><li>Bouvet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+imaging+of+primary+tumor+growth+and+multiple+metastatic+events+in+a+pancreatic+cancer+orthotopic+model.">Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.</a> Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن تصف نموذج الفئران مثلي من سرطان البنكرياس الذي يعبر عن GFP، مما يسمح بمراقبة غير الغازية من نمو الورم باستخدام الجسم كله في الجسم الحي التصوير فلوري (الشكل 1). هذه التقنية تتيح لنا مراقبة تطور الورم في الوقت الحقيقي (الشكل 3). يمكن أن يكون أداة ?...

يتم تشخيص سرطان البنكرياس مع زيادة تواتر مقارنة مع أنواع أخرى من السرطان وهو السبب الرئيسي ال 4 من الوفيات الناجمة عن السرطان في الولايات المتحدة. من وقت التشخيص، أكثر من 90٪ من المرضى يموتون في غضون خمس سنوات 1،2. حاليا، إزالة ورم الجراحية هي العلاج الوحيد لسرطان البنكرياس، ولكن أقل من 20٪ من المرضى الذين هم وحدهم المؤهلون لإجراء عملية جراحية أساسا لأن في ذلك الوقت من تشخيص المرض في مرحلة متقدمة وانتشر 3،4. عدم وجود أعراض محددة يجعل سرطان البنكرياس مرض صامت. بعض الأعراض تشمل ألم في البطن، وآلام الظهر، وفقدان الشهية، واليرقان والغثيان. وهو ما يمكن تفسيره بسهولة للأمراض الهضمية شيوعا 4. لهذا السبب، من المهم لتطوير أدوات الدوائية جديدة للمساعدة في تشخيص وعلاج سرطان البنكرياس. استخدام النماذج الحيوانية يتيح لنا أن نفهم بيولوجيا pancreسرطان آتيك ويوفر نظرة ثاقبة في تطبيق هذه المعرفة على البشر. نماذج مثلي طعم أجنبي من سرطان البنكرياس واقعية، لأن الأورام تنمو في الجهاز من أصل 5. وعلى النقيض من نماذج غيري الموضع، حيث تزرع خطوط الخلايا أو شظايا ورم تحت الجلد، والنمذجة مثلي يسمح للاستجمام المكروية الورم ويحاكي التفاعل بين الخلايا السرطانية مع محيطه 6. نموذج طعم أجنبي هو موضح هنا يستمد أورام من البنكرياس خط الخلايا السرطانية البشرية PANC-1 GFP، الذي وراثيا للتعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP). تمكين الكشف عن GFP لتصوير غير الغازية ورصد نمو الورم والانبثاث 7. يحدث نمو الورم بسرعة، بشكل عفوي، ويشبه ذلك من الأورام الأولية لمرضى سرطان البنكرياس البشري 8. توفر نماذج مثلي تنبؤ أكثر دقة من فعالية الدواء في استجابة لعوامل علاجية، في حينمحاكاة المكروية الورم. وكما ذكر أعلاه، وهذا نموذج حيواني يتيح الكشف الفلوري من نمو الورم والانبثاث في الوقت الحقيقي. الكشف الفلوري يسمح لتصوير أكثر مباشرة / الحية بالمقارنة مع التألق. مع مضان الضوء المنبعث هو نتيجة الإثارة التي كتبها ضوء آخر من طول موجي أقصر، في حين أنه في التلألؤ، والضوء المنبعث هو نتيجة لتفاعل كيميائي وقد لا يكون انبعاث قوي 9. وعلاوة على ذلك، الجسم كله في التصوير المجراة الفلورسنت هو لا يضر الحيوان ويسمح للباحثين لمراقبة نمو الورم أكثر من مرة ردا على العلاجات العلاجية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI media 1640&#160;</td>
			<td>Caisson Labs&#160;</td>
			<td>RPL03-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin&#160;&#160;</td>
			<td>Thermo Ficher Sci</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel HC&#160;</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>354248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SutureVet PGA 6-0 PGA</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>39010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcare or Foamed Antiseptic Handrub</td>
			<td>Steris</td>
			<td>639680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dubelcco&#39;s Phosphate-Buffered saline)&#160;</td>
			<td>Thermo Ficher Sci</td>
			<td>21300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TB Syringe 27G1/2</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Blutler Schein</td>
			<td>50562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen&#160;</td>
			<td>Fort Dodge Animal Health&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors, 5.5&#34;straight mayo&#160;</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>22-1600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PANC-1 GFP cell line&#160;</td>
			<td>Anticancer, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Animal Imaging System:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iBOx Scientia, UVP :</td>
			<td>UVP, LLC&#160; Upland, CA.&#160;</td>
			<td colspan="2">Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent orthotopic mouse model of pancreatic cancer

يبقى سرطان البنكرياس أحد أكثر أنواع السرطان التي البقاء على قيد الحياة لم تتحسن بشكل كبير في العقود القليلة الماضية. 7٪ فقط من المرضى الذين شخصت سوف يعيش لفترة أطول من خمس سنوات. من أجل فهم وتقليد المكروية من أورام البنكرياس، ونحن استخدام نموذج مثلي الفئران من سرطان البنكرياس الذي يسمح التصوير غير الغازية لتطور الورم في الوقت الحقيقي. علقت الخلايا السرطانية في البنكرياس التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (PANC-1 GFP) في الطابق السفلي مصفوفة الغشاء، وارتفاع تركيز، (على سبيل المثال، Matrigel HC) مع وسائل الإعلام الحرة المصل ثم حقنها في ذيل البنكرياس عن طريق فتح البطن. تعليق الخلية في المصفوفة تركيز عال الطابق السفلي الغشاء يصبح مادة تشبه الجل مرة واحدة تصل درجة حرارة الغرفة. وبالتالي، فإنه المواد الهلامية عندما يتعلق الأمر في اتصال مع البنكرياس، وخلق ختم في موقع الحقن، ومنع أي تسرب الخلية. ويتم رصد نمو الورم والانبثاث إلى أعضاء أخرى في العيشالحيوانات باستخدام مضان. ومن الأهمية بمكان استخدام مرشحات مناسبة لإثارة وانبعاث GFP. وفيما يلي تفصيل الخطوات لزرع مثلي في هذه المقالة بحيث يمكن للباحثين تكرار بسهولة الإجراء في الفئران عارية. الخطوات الرئيسية لهذا البروتوكول هي إعداد تعليق الخلية، زرع الجراحية، وكله الفلورسنت الجسم في التصوير الجسم الحي. تم تصميم هذا النموذج مثلي للتحقيق في فعالية علاجات جديدة على الأورام الابتدائية والمتنقل.

يصف هذا الأسلوب زرع مثلي الجراحية للخلايا السرطانية في البنكرياس الإنسان الفلورسنت، مع التركيز على إعداد تعليق خلية للحقن، والتخدير المناسبة للقوارض، والتسليم من التعليق الخلية عن طريق فتح البطن، واستخدام الفلورسنت في الجسم الحي التصوير ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer at JoVE.com

Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

فلوري مثلي نموذج الفأر من سرطان البنكرياس

A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here.

Pancreatic cancer remains one of the cancers for which survival has not improved substantially in the last few decades. Only 7% of diagnosed patients will ...

fluorescent-orthotopic-mouse-model-of-pancreatic-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

16.5K Views.  Western University of Health Sciences. A procedure to implant green fluorescent protein-expressing pancreatic cancer cells (PANC-1 GFP) orthotopically into the pancreas of Balb-c Ola Hsd-Fox1nu mice to assess tumor progression and metastasis is presented here. 

Video: Fluorescent Orthotopic Mouse Model of Pancreatic Cancer

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches including the promising immunotherapeutic strategies. Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique that induces tumor cell death without destruction of adjacent collagenous structures, thus enabling the procedure to be performed in tumors very close to blood vessels. Unlike thermal ablation techniques, IRE results in gradual apoptotic cell death, along with immediate ablation induced necrosis, and is currently in clinical use for selected patients with locally advanced PC. An ablative, non-target specific procedure like IRE can induce a myriad of responses in the tumor microenvironment. A few studies have addressed the effects of IRE on tumor growth in other tumor types, but none have focused on PC. We have developed a syngeneic mouse model of PC in which subcutaneous (SQ) and orthotopic tumors can be successfully treated with IRE in a highly controlled setting, facilitating various longitudinal studies post procedure. This animal model serves as a robust system to study the effects of IRE and ways to improve the clinical efficacy of IRE.

Irreversible electroporation (IRE) is a non-thermal ablation technique used for the treatment of locally advanced pancreatic cancer. Being a relatively new technique, the effects of IRE on the tumor growth are poorly understood. We have developed a syngeneic mouse model that facilitates studying the effects of IRE on pancreatic cancer.

نموذج سرطان البنكرياس سينجينيك ماوس دراسة آثار انهانسر لا رجعة فيه

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

نموذج أورثوتوبيك طرحه ونيون مورين سينجينيك المعتمدة على الاندروجين والاخصاء مقاومة سرطان البروستاتا

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

إيمونوفينوتيبينج من أورثوتوبيك هوموجرافت (سينجينيك) من الفيلق الابتدائي موريني البنكرياس الأقنية غدية بالتدفق الخلوي

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and basic cancer researches. Generations of PDX models in traditional host mice are time-consuming and only working for a small proportion of samples. Recently, zebrafish PDX (zPDX) has emerged as a unique host system, with the characteristics of small-scale and high efficiency. Here, we describe an optimized methodology for generating a dual fluorescence-labeled tumor xenograft model for comparative chemotherapy assessment in zPDX models. Tumor cells and fibroblasts were enriched from freshly-harvested or frozen pancreatic cancer tissue at different culture conditions. Both cell groups were labeled by lentivirus expressing green or red fluorescent proteins, as well as an anti-apoptosis gene BCL2L1. The transfected cells were pre-mixed and co-injected into the 2 dpf larval zebrafish that were then bred in modified E3 medium at 32 &#176;C. The xenograft models were treated by chemotherapy drugs and/or BCL2L1 inhibitor, and the viabilities of both tumor cells and fibroblasts were investigated simultaneously. In summary, this protocol allows researchers to quickly generate a large amount of zPDX models with a heterogeneous tumor microenvironment and provides a longer observation window and a more precise quantitation in assessing the efficiency of drug candidates.

This protocol describes optimization procedures in a virus-based dual fluorescence-labeled tumor xenograft model using larval zebrafish as hosts. This heterogeneous xenograft model mimics the tissue composition of pancreatic cancer microenvironment in vivo and serves as a more precise tool for assessing drug responses in personalized zPDX (zebrafish patient-derived xenograft) models.

نموذج Xenograft غير متجانس ة من سرطان البنكرياس المستمدة من المريض باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي كمضيفين للتقييم المقارن للأدوية

Patient-derived tumor xenograft (PDX) and cell-derived tumor xenograft (CDX) are important techniques for preclinical assessment, medication guidance and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

دراسة ثلاثية سلبية سرطان الثدي باستخدام نموذج سرطان الثدي Orthotopic

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional (3D) tumor architecture and low relevance to human cancer. Researchers have recently developed a 3D in vitro cancer model referred to as tumor organoids that can mimic the characteristics of a native tumor in a culture dish. Here, experimental procedures are described in detail for the establishment of bladder tumor organoids from a carcinogen-induced murine bladder tumor, including culture, passage, and maintenance of the resulting 3D tumor organoids in vitro. In addition, protocols to manipulate the established bladder tumor organoid lines for genetic engineering using lentivirus-mediated transduction are described, including optimized conditions for the efficient introduction of new genetic elements into tumor organoids. Finally, the procedure for orthotopic transplantation of bladder tumor organoids into the wall of the murine bladder for further analysis is laid out. The methods described in this article can facilitate the establishment of an in vitro model for bladder cancer for the development of better therapeutic options.

This protocol provides detailed experimental steps to establish a three-dimensional in vitro culture of bladder tumor organoids derived from carcinogen-induced murine bladder cancer. Culture methods including passaging, genetic engineering, and orthotopic transplantation of tumor organoids are described.

الثقافة والتلاعب وزرع تقويم العظام من ورم المثانة الماوس Organoids

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the limitations of current treatments, as the majority of patients do not respond to immunotherapy. Development of accurate preclinical models to quickly identify novel and effective therapeutic combinations are critical to address this unmet clinical need. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) is a canonical example of an immune checkpoint blockade resistant tumor with only 2% of patients responding to immunotherapy. The genetically engineered KrasG12D+/-;Trp53R172H+/-;Pdx-1 Cre (KPC) mouse model of PDA recapitulates human disease and is a valuable tool for assessing therapies for immunotherapy resistant in the preclinical setting, but time to tumor onset is highly variable. Surgical orthotopic tumor implantation models of PDA maintain the immunobiological hallmarks of the KPC tissue-specific tumor microenvironment (TME) but require a time-intensive procedure and introduce aberrant inflammation. Here, we use an ultrasound-guided orthotopic tumor implantation model (UG-OTIM) to non-invasively inject KPC-derived PDA cell lines directly into the mouse pancreas. UG-OTIM tumors grow in the endogenous tissue site, faithfully recapitulate histological features of the PDA TME, and reach enrollment-sized tumors for preclinical studies by four weeks after injection with minimal seeding on the peritoneal wall. The UG-OTIM system described here is a rapid and reproducible tumor model that may allow for high throughput analysis of novel therapeutic combinations in the murine PDA TME.

We describe a protocol for the ultrasound guided implantation of murine-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell lines directly into the native tumor site. This approach resulted in pancreatic tumors detectable by ultrasound scanning within 2-4 weeks of injection, and significantly reduced the proportion tumor cell seeding on the peritoneal wall as compared to surgical orthotopic implantation.

الموجات فوق الصوتية غرس العظام البنكرياس الاقنيه اللحمية

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

An Orthotopic Resectional Mouse Model of Pancreatic Cancer

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer (PC). To address this deficiency, we describe a mouse model involving orthotopic implantation of PC followed by distal pancreatectomy and splenectomy. The model has been demonstrated to be safe and suitably flexible for the study of various therapeutic approaches in adjuvant and neo adjuvant settings.
In this model, a pancreatic tumor is first generated by implanting a mixture of human pancreatic cancer cells (luciferase-tagged AsPC-1) and human cancer associated pancreatic stellate cells into the distal pancreas of Balb/c athymic nude mice. After three weeks, the cancer is resected by re-laparotomy, distal pancreatectomy and splenectomy. In this model, bioluminescence imaging can be used to follow the progress of cancer development and effects of resection/treatments. Following resection, adjuvant therapy can be given. Alternatively, neoadjuvant treatment can be given prior to resection.
Representative data from 45 mice are presented. All mice underwent successful distal pancreatectomy/splenectomy with no issues of hemostasis. A macroscopic proximal pancreatic margin greater than 5 mm was achieved in 43 (96%) mice. The technical success rate of pancreatic resection was 100%, with 0% early mortality and morbidity. None of the animals died during the week after resection.
In summary, we describe a robust and reproducible technique for a surgical resection model of pancreatic cancer in mice which mimics the clinical scenario. The model may be useful for the testing of both adjuvant and neoadjuvant treatments.

In the clinical context, patients with localized pancreatic cancer will undergo pancreatectomy followed by adjuvant treatment. This protocol reported here aims to establish a safe and effective method of modelling this clinical scenario in nude mice, through orthotopic implantation of pancreatic cancer followed by distal pancreatectomy and splenectomy.

نموذج الماوس استئصال العظام لسرطان البنكرياس

There is a lack of satisfactory animal models to study adjuvant and/or neoadjuvant therapy in patients being considered for surgery of pancreatic cancer ...