We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.

Çoğalma Tahliller için hazırlanması 1. Hücreler Not: her yöntem analiz için aynı biçimde aynı şekilde ve tohum iki hücre çizgileri hazırlamak. <ol><li> T- MCF-7-Lego ve MCF-7-Δ40p53 75 cm2 doku kültürü şişeleri 75-80% konfluansa 7 hücreleri büyümek kırmızısız fenol,% 10 cenin sığır serumu ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (FBS) , 200 mM L-glutamin, 2 ug / ml insülin, ve% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de 1 ug / ml Puromisinin. Steril bir biyogüvenlik kabini sınıf II hücreleri anlaştım. Not: izdiham hücreleri büyümek için geçen süre tohumlama seyreltme bağlı olarak değişir. Çoğalma denemeleri hücreleri kaplama için hazırlık olarak, 1 hücreleri tohum: takviye edilmiş DMEM içinde 3 seyreltme ve% 75-80 konflüansa kadar 3 gün boyunca normal büyüme koşullarında muhafaza. </li><li> içine medya dökünüz, şişesi hücreleri çıkarmak içinBir çöp konteyneri. Hemen önceden ısıtılmış 2x tripsin 2 ml hücre tabakası yıkayın. Aspire tripsin. % 5 CO2 ile 37 ° C de 5 dakika süreyle bir inkübatör hücre tabakası ve yere önceden ısıtılmış tripsin bir 2 ml ilave edilir. <ol><li> Hücreler ayırmak kez taze DMEM takviye ısıtılan 10 ml hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 491 x g&#39;de, steril bir 15 ml tüp ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın. Dikkatle aspire ve süpernatant atın. </li></ol></li><li> Taze DMEM 5 ml hücre pelletini. 96-delikli plakalardaki hücreler tohum doğru yoğunluğu belirlemek için bir hücre sayımı gerçekleştirin. <ol><li> 900 ul 1X Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) içinde hücre süspansiyonu 100 ul seyreltilir. otomatik hücre tezgahın üzerine yeni bir 60 mikron sensörünü yerleştirin. pistonu basılı tutun ve seyreltilmiş hücre süspansiyonu sensörü daldırın. Yavaş yavaş hücre tezgahın üzerine pistonu bırakın. Hücre cou gelen sensörünü çıkarınnter Tamamlandığında. Not: Hücre sayısı hücre / ml hücre sayacı görüntülenir. </li></ol></li><li> % 20 konfluansa ° &#39;de, bir 96-çukurlu plaka içinde (DMEM), 100 ul&#39;lik bir son hacim tohum hücreleri 3-5 gün (Tablo 1 e bakınız) üzerinden çoğalması, hücre büyümesi ve ölçümü için yer açmak için. üç kez tüm hücre hatları tohumu. Not: Bu deney için, üç farklı hücre yoğunlukları en uygun hücre yoğunluğu belirlemek için değerlendirildi. Gerekli hücre sayıları Tablo 1&#39;de özetlenmiştir. Tohum hücreleri düşük yoğunlukta daha uzun vadeli büyüme ölçümü gerekirse. <ol><li> Hemasitometre ve lüminesans tabanlı deneyleri için, (yani deney başına 4 tabak) zaman noktası başına bir tabak hazırlayın. Hücre görüntüleme deneyi için, deney süresince sadece bir plaka hazırlanması. </li></ol></li><li> 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de hücreleri korumak. </li></ol> 2. belirlenmesi Hücre Bize güveninHemasitometre ing <ol><li> bir hücre kültür inkübatörü içinde 37 ° C&#39;de önceden sıcak hem de orta ve tripsin, fırında ya da su banyosu. Bir atık kabı içine hücrelerden aspire medya, 2x tripsin 30 ul ile bir kez yıkayın ve tripsin aspire. </li><li> 2x tripsin 30 ul ile tekrar hücreler yıkanır ve 37 ° C&#39;de 5 dakika süreyle inkübe edilir. Yavaşça plaka hücreleri çıkarmak için plakanın kenarına dokunun. takviye edilmiş DMEM içinde 50 ul ilave edin ve hücreleri, tek bir hücre süspansiyonu oluşana kadar pipetleme ile hücrelerin karışımı. </li><li> % 70 etanol ile yüzey ve cam kapağı temizleme hemasitometre hazırlayın. </li><li> sayma odaları üzerinde cam kapak-slip yerleştirin ve &#39;Newton kırılma halkaları&#39; kapak kayma kenarları ve hemasitometre arasında görülebilir kadar yapıştırın. Not: Bu kapak-slip doğru hemasitometre yapıştırılır işaret etmektedir. </li><li> Yavaşça kılcal hareketi ile sayma odasını doldurmak, kapak kayma altında hücre süspansiyonu 20 ul pipetle.Bir mikroskop 10x büyütme altında hemasitometre yerleştirin ve ızgara düzeninde sayma odaları görselleştirmek. </li><li> ızgara düzeni 4 dış meydanlarında hücreleri saymak. Doğruluğu artırmak için ek dış kareler tekrar sayımı gerekli ya da sayısı kadar 70 ulaştıysa - 100 hücre 14,15. <ol><li> Aşağıdaki gibi ml başına hücre konsantrasyonunu hesaplayın: kare x seyreltme faktörü başına ortalama hücre sayısını (kullanılıyorsa) 10 4 x </li></ol></li><li> Tekrarlayın 2,1-2,8 her 24 saat 96 saat sonrası tohumlama adımları. </li></ol> 3. Lüminesans bazlı analiz kullanılarak hücre çoğalması belirleme Not: Bu bir bitiş noktası ölçümüdür. Reaktif hücrelere ilave edildikten sonra, levha bir kez belirlenebilir. <ol><li> 30 dakika boyunca 22 ° C su banyosu içinde çözülme lüminesans reajanı. </li><li> Yavaşça homojen bir karışım elde etmek için şişeyi ters çevirerek reaktifi karıştırın. </li><li> aşama (tohumlanmış hücrelerin bir plaka dengeye1.5), 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> Her bir oyuğa lüminesan reaktif 100 ul ekle. 2 dakika boyunca orbital bir karıştırıcı üzerinde içeriği karıştırın. Plaka, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübasyona izin verin. </li><li> Çok modlu plaka okuyucu yazılımı kullanarak bir parlaklık deney kurma. <ol><li> Çok modlu plaka okuyucu açın ve yazılımı açın. &#39;Görev yöneticisi&#39; olarak, &#39;deney&#39; seçin ve dosya &#39;new&#39;.Select oluşturmak&#39; &#39;yan araç çubuğundan ve altında&#39; protokol prosedürü &#39;sekmesinde,&#39; seçin. </li><li> Seç &#39;Grenier 96 düz dipli&#39; plaka tipi ve &#39;kullanım kapak&#39; kutusunu işaretleyin. &#39;Okundu yöntem&#39; kutusunun altında &#39;okumak&#39; eylemi seçin. &#39;Lüminesans&#39; algılama yöntemini seçin. &#39;Tamam&#39; ı tıklatın. </li><li> okuma adım kutusunda, &#39;Tam plakanın&#39; sekmesinin altında taranacak kuyu seçin ve boş kuyu hareket kuyu seçin. </li><li> (: Delik, ayna: yok örneğin, fiş, Em) boş filtreye filtre seti ayarlayın. için kazanç ayarlayın135, oyuk başına 0.5 saniyelik bir entegrasyon süresi ve 6.5 mm kadar bir yüksekliğe sahip oku. lüminesans okuma ayarları kaydetmek için &#39;OK&#39; tıklayın. </li></ol></li><li> Bir Lüminesans Oku Sahne <ol><li> &#39;Enstrüman kontrolü&#39; sekmesini seçerek plaka tutucu çıkarın ve &#39;kapağı sağlamaya, plaka sahibinin üzerine 96-plaka out&#39;.Place plaka üzerine tıklayın. altında &#39;araç kontrolü&#39; sekmesinin plaka &#39;tıklayarak plaka yuvasını kapatın. Işıklı okuma gerçekleştirmek için araç çubuğundan &#39;şimdi okuma&#39; üzerine tıklayın. </li><li> iyi daha fazla analiz için bir elektronik tabloya her biri için nispi Işıklı birimi (RLU) ölçümleri ihracat. </li></ol></li><li> Tekrarlayın hücrelerin ekim sonra yayılması 96 saat her 24 saat kadar kaydetmek için 3.1-3.6 adımları tekrarlayın. </li></ol> 4. Hücre Imager Kullanımı Cep Sayısı belirlenmesi <ol><li> Çok modlu hücre görüntüleyici yazılımı kullanarak bir hücre görüntüleme deney kurma <ol><li> Çok modlu hücre kamera ve açık th açıne yazılımı. </li><li> &#39;Görev yöneticisi&#39; olarak, &#39;deneyleri&#39; sekmesini seçin ve &#39;araç çubuğunu tıklayın&#39; dosyasını &#39;new&#39;.On oluşturmak&#39; protokol &#39;sekmesini ve açık&#39; prosedürü &#39;tab.Select&#39; ayarlanan sıcaklık &#39;eylem. &#39;Açık&#39; için inkübatör ayarlayın ve 37 ° C sıcaklığı ayarlamak ve bir sonraki adım &#39;kutu ile devam etmeden önce&#39; ön ısıtma &#39;kontrol edin. Ayarları kaydetmek için &#39;OK&#39; tıklayın. </li><li> &#39;Okumak&#39; eylemi seçin. , &#39;Image&#39; algılama yöntemine tıklayın &#39;son nokta / kinetik&#39; okuma türünü ve &#39;filtreleri&#39; optik türünü seçin. plaka üzerinde tam plaka &#39;sekmesinin üzerine OK&#39;.Click&#39; tıklayın ve kuyu yansıması. Ayarları kaydetmek için &#39;OK&#39; tıklayın. </li><li> &#39;Amaç&#39; seçenekler açılır menüden 2.5X hedefi seçin. GFP 469, 525 ve Parlak Field: &#39;kanalların sekmesinin altında, iki kanal seçin. Her iki kanal için &#39;otomatik&#39; pozlama kontrol edin ve iyice otomatik pozlama seçin. </li><li> aut belirlemeko odak ayarları, &#39;otomatik odaklama&#39; seçin ve &#39;seçenekleri&#39; üzerine tıklayın. otomatik odaklama seçenekleri için, &#39;o zaman otomatik odak tarama ve&#39; yöntemini seçin. Ayarları kaydetmek için &#39;OK&#39; tıklayın. </li><li> Set yatay ve dikey aralığı (um) = 2.881 ve dikey aralık (mikron) = 2.127 ile 3 x 2 montajda kuyu başına birden fazla görüntüleri taramak için 0.Select iyi (um) merkezinden ofset dikey. Prosedür ayarları kaydetmek için &#39;OK&#39; tıklayın. Not: Okuma parametreleri için Tablo 2&#39;ye bakınız. </li></ol></li><li> Seçilen Plate Oku Deneme Sahne <ol><li> Kapağı sağlanması üzerinde, &#39;araç kontrolü&#39; sekmesine tıklayın ve &#39;plaka dışarı&#39; function.Place plaka tutucuya 96-plaka seçin. &#39;Enstrüman kontrolü&#39; sekmesi altında, fonksiyon &#39;plaka&#39; seçin. Seçin plaka sekmesinden &#39;şimdi okuma&#39;. 96 saat sonrası tohumlama için her 24 saat kadar okumak tekrarlayın. </li></ol></li><li> Kullanımı Cep Kont AnaliziHücre Görüntüleyici Yazılımı. <ol><li> Bir görüntüyü analiz etmek, görüntülü plaka üzerinde &#39;veri&#39; sekmesine tıklayın, seçin &#39;resim [GFP 469, 525 + Aydınlık alan]&#39;. iyi görüntülü bir çift tıklayın. </li><li> Yüklenen bir resmin üzerine tıklayın. Seç &#39;analiz&#39; ve montajı tek bir görüntü analiz edilecek seçin. GFP &#39;OK&#39;.Check&#39; Click &#39;sadece kanal ve Tablo 3&#39;te belirtilen olarak ayarlanmış parametreler. Click&#39; görüntülü hücrelere parametreleri uygulamak için BAŞLAT &#39;. </li><li> görüntü başına hücre sayımı belirlemek için kullanılır görüntülü hücrelerin üzerine yerleştirilen hücre sayım maskesi, gözlemleyin. Click Deney boyunca görüntülenmiş her plaka için bu ayarları &#39;değişiklikleri uygulamak&#39; ve korumak. </li><li> Bir kez geri görüntülü plaka, açılan menüden &#39;veri&#39; damla tıklayın ve &#39;hücre sayımı&#39; seçeneğini seçin. Bu kuyu başına toplam hücre sayısını oluşturur. </li><li> daha fazla analiz için o &#39;ihracat&#39; sekmesini tıklayarak bir elektronik tabloya tüm veri ihracatoyuk başına hücre sayımı f. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer.+p53,+guardian+of+the+genome.">Cancer. p53, guardian of the genome.</a> Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).</li><li>Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TP53+mutations+in+human+cancers:+origins,+consequences,+and+clinical+use.">TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).</li><li>Olivier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+value+of+somatic+TP53+gene+mutations+in+1,794+patients+with+breast+cancer.">The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer.</a> Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).</li><li>Bourdon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+isoforms+can+regulate+p53+transcriptional+activity.">p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity.</a> Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).</li><li>Avery-Kiejda, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecular+weight+variants+of+p53+are+expressed+in+human+melanoma+cells+and+are+induced+by+the+DNA-damaging+agent+cisplatin.">Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin.</a> Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).</li><li>Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+mRNA+expression+of+p53+isoforms+in+breast+cancer+is+associated+with+clinical+features+and+outcome.">The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome.</a> Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).</li><li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+&amp;#34;gene+ontology&amp;#34;+(LeGO)+vectors+for+functional+gene+analysis.">A multicolor panel of novel lentiviral &amp;#34;gene ontology&amp;#34; (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Biology. , 25-31 (2006).</li><li>Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+to+measure+cell+proliferation+in+two+and+three+dimensions.">The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions.</a> Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+multiple+assay+endpoints+to+investigate+the+effects+of+incubation+time,+dose+of+toxin,+and+plating+density+in+cell-based+cytotoxicity+assays.">Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays.</a> Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).</li><li>Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).</li><li>Banks, P., Brescia, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).</li><li>Bastidas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).</li><li>Bastidas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2012).</li><li>Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Assays.">Cell Viability Assays.</a> Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).</li><li>Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancies+between+metabolic+activity+and+DNA+content+as+tool+to+assess+cell+proliferation+in+cancer+research.">Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).</li><li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Bu protokol, kültürlenmiş hücrelerde hücre çoğalmasını ölçmek için üç farklı yöntem incelenmiştir. Her yöntem 96 saat boyunca hücre çoğalmasının tekrarlanabilir ve hassas ölçümler yeteneğine sahip olduğunu ve sonuçlar (Şekil 2 ve 3) test edilen yöntemlerin her karşılaştırılabilirdir. Lüminesans bazlı analiz ve hücre görüntüleme yöntemi Hem 96 saat sonra, hücre çoğalmasında lineer artış gösteren, en güçlü sonuç (Şekil 2B, C)....

Tümör bastıncı gen p53, hücre döngüsünün durdurulması, apoptoz ve yaşlanma 1 de dahil olmak üzere hücresel süreçleri, bir dizi önemli bir düzenleyicidir. Bu genomik stabilite bakımından sorumlu olan, ve bu nedenle, hücre ölümü ve hücre büyümesinin dengesini sağlamak için çok önemlidir. P53 mutasyonlar kanser yaygındır ve kontrolsüz kanseri hücre çoğalması 2 giden p53 etkisizleştirme başlıca nedenidir. İlginç bir şekilde, p53 mutasyonlar diğer mekanizmalar p53 fonksiyonunun kaybının sorumlu olduğunu göstermektedir, meme kanserlerinin 3 yaklaşık% 25&#39;ini oluşturmaktadır. En son keşfedilen p53 izoformları insan kanserlerinde bir dizi fazla sentezlendiği gösterilmiştir ve p53 fonksiyonunu 4,5 modüle edebilirler. P53 izoformu Δ40p53, göğüs kanseri en yüksek şekilde tanımlanan izoform olduğu daha önce gösterilmiştir ve normal komşu Tiss karşılaştırıldığında önemli ölçüde, meme kanseri hücrelerinde yukarı-regüle edildiğiniue 6. Bunu takiben, stabil bir şekilde LEGO&#39;nun-Ig2-Puro + vektörüne (GFP +) 7 kullanarak Δ40p53 aşın sunmak için insan göğüs kanseri hücre çizgisi, MCF-7 kalıt. Bu hücreler yüksek Δ40p53 sentezleme göğüs kanseri hücrelerinin hücre proliferasyonu oranlarını arttırır araştırmak için kullanıldı. In vitro 8,9 kültürlenen hücrelerin hücre çoğalmasını ölçmek için bir çok, doğrudan ve dolaylı yöntem vardır. Bu süre boyunca sürekli ölçümleri, veya nokta tahlilleri 10 olarak da gerçekleştirilebilir. Geleneksel yöntemler, bir hemasitometre kullanarak hücre sayımı olarak, hala yararlıdır. Bu tahlil düşük maliyetli ve hücre sayısının doğrudan ölçüsüdür, ancak sayıları hata ve geniş standart sapma en aza indirmek için büyük hücre sayımları ve çok yetenekli eğitim güvenmek yok. Yüksek verimli biçimleri ile uyumlu ölçümler yapmak için gerekli çukurlu levha tahlillerinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu parlaklık bazlı deneyler measuhücre 11,12 metabolik aktivitesi ile orantılıdır bir lüminesan sinyal göre hücre sayıları yeniden. Daha yakın zamanlarda, yüksek içerik görüntüleme platformları tanıtımı nicel ve nitel fenotipik veri toplama sağlarken hücre çoğalmasını izlemek yeni araçlar için izin verilen ve sistemlerin 13 çeşitli içerir olmuştur. Tüm bu yöntemler sürekli ölçüm ya da bitiş noktası deneyleri yoluyla, hücre büyümesini ölçmek için yollar sağlamak ve her bağlı buna göre tartılır olabilir bütün bunlar duyarlılık açısından, örnek numaraları verimi ve hücre bilgileri ile avantaj ve dezavantajları bir dizi sahip araştırma sorusu üzerine. Bu protokol, hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve çok-yuvalı plaka formatlarında farklı aralıkları kullanılarak, her yöntem ile, in vitro olarak hücre proliferasyonunu ölçmek için üç farklı yöntem tarif eder. Bu protokol hemositometre sayma cha kullanımını karşılaştırmayı amaçladıkmber, 96 saatlik bir süre boyunca, hücre çoğalmasının ölçülmesi bir lüminesans-bazlı hücre canlılığı deneyi ve hücre görüntüleme. Bunu yapmak için, vektör transduse hücreleri (MCF-7-LEGO&#39;nun) büyüme üç farklı hücre yoğunlukları kullanılarak Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53) aşırı ifade etmek için dönüştürülmüş hücrelere karşılaştırılmıştır. Hücre çoğalması kadar 96 saat boyunca her 24 saatte ölçülmüştür. Her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları var bulundu ve deney amaca bağlı olarak, her hala çoğalması oranı hakkında bilgi veren değerli bir yöntemdir oldu.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium, no phenol-red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 &amp;micro;g/ml insulin and 1 &amp;micro;g/ml puromycin</td></tr><tr><td>L-glutamine solution (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% trypsin-EDTA solution (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Dilute to 2x in DPBS</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask, 75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;growth area</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Automated cell counter</td></tr><tr><td>96 well multiwell plate, flat bottom</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Improved Neubauer Hemocytometer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 Assay</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Luminescence-based assay</td></tr><tr><td>Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging</td></tr><tr><td>Gen5 Data Analysis Software</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

comparison of three different methods for determining cell proliferation in breast cancer cell lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

kültürlenmiş hücrelerin çoğalmasını,-Δ40p53 MCF-7 hücrelerinin transduse hücre proliferasyon ölçüm farklı yöntemler incelenmesi transdüksiyona MCF-7-LEGO&#39;nun Meme kanseri hücre dizisi ile karşılaştırılmıştır. Karşılaştırıldı üç yöntem - şematik diyagramda özetlenen analizi-alışılmış hemositometre yöntem olup, hücre canlılığı, lüminesans deneyi ve hücre görüntüleme (Şekil 1). Her yöntemin avantajları ve doğru za...

Watch this Scientific Journal Video about Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines at JoVE.com

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Proliferasyonunu belirlenmesi için üç Farklı Yöntemlerle Karşılaştırılması

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

comparison-three-different-methods-for-determining-cell-proliferation

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Görüntüleme.  Hunter Medical Research Institute. This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

Video: Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Kanser Araştırmaları

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These relatively simple avascular constructs mimic key aspects of in vivo tumors, such as 3D structure and pathophysiological gradients. MCTSs models can provide insights into cancer cell behavior during spheroid development and in response to drugs; however, their requisite size drastically limits the tools used for non-destructive assessment. Optical Coherence Tomography structural imaging and Imaris 3D analysis software are explored for rapid, non-destructive, and label-free measurement of regional cell density within MCTSs. This approach is utilized to assess MCTSs over a 4-day maturation period and throughout an extended 5-day treatment with Trastuzumab, a clinically relevant anti-HER2 drug. Briefly, AU565 HER2+ breast cancer MCTSs were created via liquid overlay with or without the addition of Matrigel (a basement membrane matrix) to explore aggregates of different morphologies (thicker, disk-like 2.5D aggregates or flat 2D aggregates, respectively). Cell density within the outer region, transitional region, and inner core was characterized in matured MCTSs, revealing a cell-density gradient with higher cell densities in core regions compared to outer layers. The matrix addition redistributed cell density and enhanced this gradient, decreasing outer zone density and increasing cell compaction in the cores. Cell density was quantified following drug treatment (0 h, 24 h, 5 days) within progressively deeper 100 &#181;m zones to assess potential regional differences in drug response. By the final timepoint, nearly all cell death appeared to be constrained to the outer 200 &#181;m of each aggregate, while cells deeper in the aggregate appeared largely unaffected, illustrating regional differences in the drug response, possibly due to limitations in drug penetration. The current protocol provides a unique technique to non-destructively quantify regional cell density within dense cellular tissues and measure it longitudinally.

The present protocol develops an image-based technique for rapid, non-destructive, and label-free regional cell density and viability measurement within 3D tumor aggregates. Findings revealed a cell-density gradient, with higher cell densities in core regions than outer layers in developing aggregates and predominantly peripheral cell death in HER2+ aggregates treated with Trastuzumab.

İlaç Tedavisini Takiben Tümör Agregaları İçindeki Bölgesel Hücre Yoğunluğunun Tahribatsız Değerlendirilmesi

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

Hazırlama ve Analizler<em&gt; İn Vitro</em&gt; Üç Boyutlu Meme Kanseri Suretler

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Biyomühendislik

Katı Tümörleri Tedavi Etmek için İyon Kanallarının Farmakolojik Hedeflemesi

Screening Ion Channels in Cancer Cells

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development of a broad range of disorders or channelopathies. Cancer cells utilize ion channels to drive their own development, as well as to improve as a tumor and to assimilate in a microenvironment that includes various non-cancerous cells. Furthermore, increases in levels of growth factors and hormones within the tumor microenvironment can result in enhanced ion channel expression, which contributes to cancer cell proliferation and survival. Thus, the pharmacological targeting of ion channels is potentially a promising approach to treating solid malignancies, including primary and metastatic brain cancers. Herein, protocols to characterize the function of ion channels in cancerous cells and approaches to analyze modulators of ion channels to determine their impact on cancer viability are described. These include staining a cell(s) for an ion channel(s), testing the polarized state of mitochondria, establishing ion channel function using electrophysiology, and performing viability assays to assess drug potency.

Yazar Gündemi: Kanserde İyon Kanallarının Rolünü Keşfetmek: Karakterizasyon ve Potansiyel Tedavi Yaklaşımları 

The pharmacological targeting of ion channels is a promising approach to treating solid tumors. Detailed protocols are provided for characterizing ion channel function in cancer cells and assaying the effects of ion channel modulators on cancer viability.

Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

Bağışıklık ilaçlarının tanımlanmasında T lenfositlerinde mitojen kaynaklı blastojenez hızlı bir şekilde belirlenmesini

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Biyoloji

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Meme Kanseri Hücre Hatlarında Hücre Proliferasyonunu belirlenmesi için üç Farklı Yöntemlerle Karşılaştırılması

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hücre viability ve ölüm kanser hücrelerinin 3D Küroid kültürlerde değerlendirilmesi

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

İlaç Tedavisini Takiben Tümör Agregaları İçindeki Bölgesel Hücre Yoğunluğunun Tahribatsız Değerlendirilmesi

Hazırlama ve Analizler

Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Bağışıklık ilaçlarının tanımlanmasında T lenfositlerinde mitojen kaynaklı blastojenez hızlı bir şekilde belirlenmesini

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri