Bu protokol, tümör modeli progresyonu hakkında tahribatsız bir şekilde bilgi sağlar. Ayrıca, yaş eşleşmesi örneklerine güvenmek yerine, tekil agregalar içindeki tüm ilaç rejimleri boyunca terapötik yanıtın göstergelerini verir. Agregalar içinde hücre yoğunluğu ve canlılık elde etmek için kullanılan geleneksel yöntemler, numune fiksasyonu ve kesitleme gerektirirken, bizimki verileri tahribatsız bir şekilde sağlar.
Böylece, değişiklikler zaman içinde tek bir toplama içinde izlenebilir. Bu tekniğin, agrega modellerinin gizli bölgelerinde ilaç yanıtı hakkındaki anlayışımızı geliştirmesi ve bu modellerin in vivo yanıtları ve ilaç tarama uygulamalarını ne kadar iyi yansıttığına dair etkileri olması beklenmektedir. Başlamak için, standart koşullarda istenen hücre hatlarının% 70 ila% 90 birleşimli hücre kültürlerini hazırlayın.
Standart tripsinizasyon yöntemini izleyerek kültür şişelerinden ayrılan hücre monokatmanları, hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne ekler. Bir hemositometreye hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini ekleyin ve süspansiyondaki hücre sayısını belirlemek için mikroskopi yoluyla sayın. Pelet hücreleri santrifüjleme yoluyla ve ortamdaki hücreleri mililitre başına 2,5 kat 10 ila beşinci hücreler arasında istenen konsantrasyonda yeniden askıya alır.
Bodrum membran matrisi ile hazırlanan süspansiyonlar için, matris şişesini eksi 20 santigrat derece depodan çıkarın ve gece boyunca çözülmesi için buzdolabına yerleştirin. Büyüme ortamı içeren bir kap hazırlayın ve soğutmak için 10 dakika soğutun. Dondurulmuş bir pipet ucu kullanarak, matrisi soğutulmuş ortama ekleyin, böylece bu çözeltinin son konsantrasyonu% 5 olacaktır Bu ortamın 50 mikrolitresini, yuvarlak tabanlı, yapışmaz 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna ekleyin, böylece bu kuyucuklardaki matrisin son konsantrasyonu, hücre süspansiyonunun eklenmesini takiben% 2,5 olacaktır.
Matrissiz hazırlanan süspansiyonlar için, her bir kuyucuğa 50 mikrolitre düz büyüme ortamı ekleyin. Her bir kuyucuğa 50 mikrolitre hücre süspansiyonu dağıtın. Her bir kuyucuğun dibinde bir hücre peletinin toplanmasını sağlamak için tohumlamanın hemen ardından oda sıcaklığında 10 dakika boyunca plakaları 123 G'de santrifüj yapın.
Yapısal görüntüleme için bir OCT sistemi kullanın. Yüksek çözünürlüklü görüntü toplama için A tarama hızını 5,5 kilohertz olarak ayarlayın. Sıvı ortamdaki numuneler için kırılma indeksini 1,33'e ayarlayın.
Ekranın sağ tarafındaki görüntü parametreleri penceresinde, X, Y ve Z değerlerini girerek görüş alanını, örneğin bu ilgi alanı içinde kapsanacak şekilde ayarlayın. 3D Alma Modu'na tıklayın ve ardından örneğin 3D hacim taramasını toplamak için Kaydet'e tıklayın. Birim yeniden yapılandırması oluşturmak için Imaris'i açın ve arenalarındaki dönüştürülmüş TIF dosyasına gidin.
Düzenlemeye gidin, ardından Görüntü Özellikleri'ne tıklayın ve OCT görüntüsündeki voksel boyutunu ilgili XYZ kutularına girin. Ardından, Tamam'a tıklayın. Nesneler ağacının üstündeki Yeni Yüzeyler Ekle'ye tıklayın. Ağacın altındaki menüde, Otomatik Oluşturmayı Atla üzerine tıklayın ve manuel olarak düzenleyin.
Ekran ayarlama penceresinde, örnek ile arka plan arasındaki kontrastı artırmak ve örnek görselleştirmeyi geliştirmek için kırmızı ve siyah okları manuel olarak kaydırın. Dilim konumunu, numunenin bir kenarındaki dilime ayarlayın. Fareyi gezinme modundan seçim moduna değiştirmek için escape tuşunu kullanın ve ardından Draw'a tıklayın.
Sinyali görüntüleyen bölgenin anahattını manuel olarak izleyin. Giriş kutusuna bir sonraki konumu girerek dilim konumunu ilerletin. Bu sonraki pozisyon, numunede bir öncekinden daha fazla 100 dilime eşit veya daha az olmalıdır.
Sinyali görüntüleyen bölgeyi manuel olarak izleyin. Bu adımı, numunenin karşı kenarına ulaşılana kadar numunenin kalınlığı boyunca tekrarlayın. Ardından, bu dilimleri bir araya getirmek için Yüzey Oluştur'a ve sol menüye tıklayın.
Son olarak, Düzenle'ye tıklayın, ardından Maske Seçimi'ne tıklayın, ardından ses yeniden yapılandırmasını tamamlamak için Tamam'a tıklayın. Örneğin, toplam hücre yoğunluğunu elde etmek için Yeni Noktalar Ekle'yi seçin. Algoritma ayarları menüsünde tüm kutuların seçimini kaldırın.
Kaynak kanal ekranına gitmek için mavi oka tıklayın. Görüntülenen açılır menüden Maskelenmiş Kanal'ı seçin. XY çap kutusuna numunenin ortalama hücre çapını girin.
Arka plan çıkarma işleminin işaretli olduğundan emin olun. Sınıflandırma noktasının ekranına gitmek için mavi oka tıklayın. Menünün altındaki grafikte, sarı eşiğin sol kenarını tıklayıp grafiğin sol kenarına sürükleyerek tüm nesnelerin sarı gölgeli eşiğe dahil edilmesini sağlayın.
Ardından spot oluşturmayı tamamlamak için yeşil oka tıklayın. İstatistikler'e tıklayarak tanımlanan nesnelerin sayısını elde edin. Ardından Genel'e tıklayın ve son olarak Toplam Nokta Sayısı'na tıklayın.
Oluşturulan yüzeye tıklayın ve yüzeyler stil kalitesi sekmesine gidin. En iyi görünürlük için seçimi Merkez Noktası olarak değiştirin ve piksel genişliğini 20'ye eşit olacak şekilde değiştirin. İstatistikler'e gidin.
Ardından Ayrıntılı'yı ve ardından Konum'u tıklayın ve konumu orta noktaya kaydedin. Nesne ağacının üstündeki menüden Yeni Referans Çerçevesi Ekle'yi seçin. Menüdeki X, Y işaretinin yanındaki görünür ve sabit kutuları işaretleyin.
Referans çerçevesi simgesinin ortasını, orta noktayla aynı hizada olacak şekilde tıklatın ve sürükleyin. Görünür XY ve düzeltme kutularının seçimini kaldırın ve XZ için seçin. Bir kez daha, referans çerçevesi simgesinin merkezini tıklayın ve merkez noktasıyla aynı hizada olacak şekilde sürükleyin. Son olarak, referans çerçevesi merkez noktasıyla mükemmel bir şekilde hizalanana kadar bu üç sabit düzlem arasında geçiş yaparak YZ düzlemi için bunu tekrarlayın.
Nesne ağacındaki referans çerçevesine çift tıklayın ve ortasını veya benzerini yeniden adlandırın. Oluşturulan noktalara tıklayın ve İstatistikler'e gidin. Ardından Ayrıntılı'yı ve ardından Konum Referans Çerçevesi'ni tıklayın.
En yüksek değerden en düşük değere doğru sıralanana kadar X pozisyonu referans çerçevesine tıklayın. Agregaların yarıçapını elde etmek için en yüksek değeri kaydedin. İlgilenilen ek yerleri belirlemek için el ile hesaplamalar yapın.
Bunu yapmak için, X merkez değerine 100 mikrometre ekleyin ve ardından merkez eksen boyunca ilk konumu tanımlamak için merkez noktasının Y ve Z değerlerini kullanın. Yeni Noktalar Ekle'yi seçin. Ardından Otomatik Oluşturma Düzenlemesini El İle Atla'yı seçin.
Klavyedeki shift düğmesini basılı tutun ve yeni bir nokta yerleştirmek için ekranda herhangi bir yeri tıklatın. İlgilenilen ilk konum için XYZ pozisyon değerlerini girin. Ardından Yeni Referans Çerçevesi Ekle'yi seçin ve noktanın üzerine hizalayın.
Her sıralı X konumuna 100 mikrometre ekleyin. Son referans çerçevesini, numunenin dış yarıçapından 50 mikrometreye eşit olandan daha az bir mesafeye yerleştirin. Oluşturulan noktalara tıklayın ve İstatistikler'e gidin.
Menünün sağ alt köşesinde, Tüm İstatistikleri Dosyaya Aktar'ı tıklayın ve verileri bir e-tabloya kaydedin. E-tabloyu açın. Kaynak referans çerçevesinden uzaklık sekmesine gidin.
Her mesafeyi karşılık gelen referans çerçevesine sayısal olarak atamak için mod işlevini kullanın. Her referans çerçevesindeki mesafelerle çalışmak için bu sütundaki değerleri filtreleyin. Referans çerçevelerinin her biri için, COUNTIF işlevini kullanarak çerçevenin 50 mikrometre içindeki nesnelerin sayısını hesaplayın.
Elde edilen değer, bu bölgesel fişteki hücre sayısına karşılık gelir. Hücre yoğunluğunu elde etmek için bu değeri 100 mikrometre fişinin hacmine bölün. Student's T testi, sferoid çekirdekte MDA-MB-231 sferoid modelleri için geçiş ve dış katmanlardan önemli ölçüde daha yüksek hücre yoğunluğu ortaya koymuştur.
Sonuç, dört gün sonra bu küresel çekirdekte sıkışmayı gösterir. Hem AU565 hem de MDA-MB-231 agrega modellerinde, matrisin eklenmesi hacmi veya hücre sayısını etkilemiyor gibi görünmektedir ve bu nedenle hücre proliferasyonu üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahip gibi görünmektedir. Daha ziyade, matris ilavesi, hücre yoğunluğunu yeniden dağıtarak önemli çekirdek sıkıştırmasını teşvik ediyor ve dış katmanlardaki hücre yoğunluğunu azaltıyor gibi görünmektedir.
Bu bulgular, matrisin farklı meme kanseri hücre hatlarında hücre agregasyonunu sağladığı fiziksel mekanizmalar hakkında değerli bilgiler sağlar. Daha sonra matriks ile hazırlanan AU565 tümörleri sferoidine bakıldığında, olgunlaşmış agregalar trastuzumab ile tedavi edildi ve bölgesel hücre yoğunluğu beş günlük bir ilaç rejimi ile değerlendirildi. Tapalar, agregaların kalınlığı boyunca her 100 mikrometrede bir ayarlandı.
Hücre yoğunluğundaki küçük dalgalanmalar, her bir agreganın iç 500 mikrometresinde zaman içinde minimal hücre ölümünü gösteren küçük dalgalanmalar gözlendi. Hücre ölümünün çoğunlukla tümör sferoidlerinin dış katmanlarında gösterge ilaç yanıtı olarak görselleştirilmesi, trastuzumabın ilaç penetrasyon sorunları ile tutarlıdır. Artık yapıdan ödün vermeden agregalardaki hücre canlılığını tahribatsız bir şekilde ölçebiliyoruz.
Bu, aday anti-kanser ilaçlarının temporal ve penetrasyon niteliklerini tanımlamak için tekil tümör agregalarında uzunlamasına ilaç yanıtının değerlendirilmesini sağlar.
