We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.

대량 살상 무기 확산 시험 법 1. 준비 세포 주 : 각각의 방법은 분석 될 수 있도록 동일한 포맷에 동일하게 종자의 두 세포주를 준비한다. <ol><li> 사용 T에 MCF-7 레고 및 MCF-7 Δ40p53 75 ㎠로 조직 배양 플라스크 75-80% 합류 7 세포 성장 페놀 레드없는 10 % 소 태아 혈청으로 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM) (FBS) 200 mM의 L- 글루타민, 2 μg의 / ㎖ 인슐린, 5 % CO 2, 37 ℃에서 1 μg의 / ml의 퓨로 마이신. 멸균 바이오 안전성 캐비닛 클래스 II의 셀을 처리합니다. 참고 : 합류로 세포를 성장하는 데 걸리는 시간은 시드 희석에 따라 변한다. 확산 분석을위한 세포를 도금에 대비, 1에서 세포를 시드 : 보충 DMEM 3 희석 및 75~80%의 자랄 때까지 3 일 동안 정상적인 성장 조건에서 유지한다. </li><li> 에 미디어를 붓고, 플라스크에서 세포를 제거하려면폐기물 용기. 즉시 예열 배 트립신 2 ㎖의 세포 층을 세척한다. 기음 트립신. 5 % CO 2, 37 ℃에서 5 분 동안 항온 세포층과 장소에 미리 가온 된 트립신의 또이 용액을 추가한다. <ol><li> 세포가 분리되면, 신선한 DMEM을 보충 따뜻해진 10 ml의 세포를 씻는다. RT에서 5 분 동안 491 XG에 멸균 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송. 조심스럽게 기음과 뜨는 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 신선한 보충 된 DMEM 5 ml의 세포 펠렛을 재현 탁. 96- 웰 플레이트에서 세포를 배정하는 정확한 농도를 결정하기 위해 셀 카운트를 수행한다. <ol><li> 900 ㎕의 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)에 세포 현탁액 100 ㎕를 희석. 자동 세포 계수기에 새로운 60 μm의 센서를 배치합니다. 플런저를 누른 상태에서 희석 세포 현탁액에 센서를 잠수함. 천천히 셀 카운터에 플런저를 놓습니다. 셀 COU에서 센서를 제거nter 완료 할 때. 주 : 세포 수는 세포 / ml의 세포 카운터에 표시된다. </li></ol></li><li> 20 % 컨 플루 ~에서 96 웰 플레이트 (DMEM)에서 100 μL의 최종 부피에서 종자 세포 3~5일 (표 1 참조)를 통해 증식 세포 증식 측정을위한 공간을 허용한다. 세중의 모든 세포 라인을 시드. 주 :이 실험을 위해, 세 가지 세포 밀도는 최적의 세포 밀도를 결정하기 위해 평가 하였다. 필요한 세포 수는 표 1에 요약되어있다. 종자 세포를 낮은 밀도보다 장기 성장의 측정이 필요한 경우. <ol><li> 혈구 및 발광 기반 분석의 경우 (즉, 분석 당 4 판) 시점 당 한 판을 준비합니다. 셀 메이져 분석의 경우, 실험 지속 기간 동안 하나의 플레이트를 준비한다. </li></ol></li><li> 24 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 유지한다. </li></ol> 2. 결정 세포는 우리를 카운트혈구를 보내고 <ol><li> 세포 배양 인큐베이터에서 37 ° C까지 사전 따뜻한 두 매체와 트립신, 오븐 또는 물 목욕. 폐기물 용기에 세포를 대기음 매체는 2 배 트립신 30 μl를 한 번 세척하고, 트립신을 대기음. </li><li> 배 트립신 30 μl를 다시 세포를 씻으, 37 ° C에서 5 분 동안 품어. 부드럽게 판에서 셀을 제거하기 위해 판의 가장자리를 누릅니다. 보충 된 DMEM 50 μl를 첨가하고 세포를 단일 세포 현탁액을 형성 할 때까지 피펫 팅하여 세포를 혼합한다. </li><li> 70 % 에탄올로 표면과 유리 커버를 청소하여 혈구를 준비합니다. </li><li> 계산 챔버 위에 유리 커버 슬립을 놓고 &#39;뉴턴의 굴절 반지&#39;커버 슬립의 가장자리와 혈구 사이에 볼 수있을 때까지 부착합니다. 참고 :이 커버 슬립 올바르게 혈구에 부착 된 것을 나타냅니다. </li><li> 부드럽게 모세관 운동에 의해 카운팅 챔버를 채우고, 커버 슬립에 따라 세포 현탁액 20 μL 피펫.현미경의 10 배 배율에서 혈구를 놓고 그리드 레이아웃 계산 실을 시각화. </li><li> 그리드 레이아웃의 4 바깥 쪽 사각형의 세포를 계산합니다. 정확성을 개선하기 위해 추가로 외부 사각형의 반복 계산이 필요하거나 수까지 70에 도달하면 - 100 세포 14, 15입니다. <ol><li> 다음과 같이 ml의 당 세포 농도를 계산 : 사각형의 X 희석 계수 당 평균 세포 수를 (사용 된 경우) 10 (4) X </li></ol></li><li> 반복 2.1-2.8 매 24 시간 96 시간 동안 후 파종 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 발광 기반 분석법을 이용하여 세포 증식을 결정 참고 :이 엔드 포인트의 측정이다. 시약을 세포에 첨가하면, 플레이트 번만 정량화 할 수있다. <ol><li> 30 분 동안 22 ℃로 물을 욕조에 해동 발광 시약. </li><li> 부드럽게 균질 혼합물을 얻기 위해 병을 반전시킴으로써 시약을 혼합한다. </li><li> 단계에서 (시드 세포의 한 판 평형1.5)을 실온에서 30 분 동안. </li><li> 각 웰에 발광 시약 100 μl를 추가합니다. 2 분 동안 궤도 통에 내용을 섞는다. 플레이트는 실온에서 10 분 동안 배양 할 수 있습니다. </li><li> 다중 모드 플레이트 판독기 소프트웨어를 사용하여 발광 실험 설정. <ol><li> 멀티 모드 플레이트 리더를 켜고 소프트웨어를 엽니 다. &#39;작업 관리자&#39;에서 &#39;실험&#39;을 선택하고 파일 &#39;new&#39;.Select 만드는&#39;측 도구 모음에서, 그리고 아래의 &#39;프로토콜 절차&#39;를 &#39;탭을 선택&#39;. </li><li> 선택 &#39;Grenier의 96 평평한 바닥&#39;플레이트 유형 및 &#39;사용 뚜껑&#39;확인란을 선택합니다. &#39;읽는 방법&#39;상자에서 &#39;읽기&#39;작업을 선택합니다. &#39;발광&#39;검출 방법을 선택합니다. &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> 읽기 단계 상자에서 &#39;전체 판&#39;탭에서 스캔 할 수있는 우물을 선택하고 빈 우물을 행동 우물을 선택합니다. </li><li> (: 구멍, 거울 : 없음 예를 들어, 플러그, 엠) 빈 필터 설정 필터를 설정합니다. 에 게인을 설정135 웰 당 0.5 초 적분 시간과 6.5 mm의 높이를 판독. 발광 읽기 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭하십시오. </li></ol></li><li> 발광 읽기를 수행 <ol><li> &#39;기기 제어&#39;탭을 선택하여 플레이트 홀더를 꺼내와 &#39;뚜껑을 보장하는 것은 켜져 판 홀더에 96 웰 플레이트를 out&#39;.Place 판을 클릭합니다. 아래 &#39;기기 제어&#39;탭 &#39;에 판&#39;을 클릭하여 판 홀더를 닫습니다. 발광 읽기를 수행하기 위해 도구 모음에서 &#39;지금 읽기&#39;를 클릭합니다. </li><li> 또한 추가 분석을 위해 스프레드 시트에 각각의 상대 발광 장치 (RLU) 측정을 보냅니다. </li></ol></li><li> 반복 세포를 파종 한 후 증식에게 96 시간에 매일 24 시간 최대를 기록 할 3.1-3.6 단계를 반복합니다. </li></ol> 4. 셀 이미 저를 사용하여 세포 수를 결정 <ol><li> 다중 모드 셀 메이져 소프트웨어를 사용하여 세포 이미징 실험 설정 <ol><li> 멀티 모드 셀 이미 저와 오픈 일을 켭니다전자 소프트웨어. </li><li> &#39;작업 관리자&#39;에서 &#39;실험&#39;탭을 선택하고 &#39;도구 모음에서 클릭&#39;파일 &#39;new&#39;.On에게 만들기&#39;프로토콜 &#39;탭을 열고&#39;절차 &#39;tab.Select&#39;설정 온도 &#39;조치를. &#39;에&#39;에 인큐베이터를 설정하고 37 ° C로 온도를 설정하고 다음 단계 &#39;상자를 계속하기 전에&#39;예열 &#39;확인합니다. 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> &#39;읽기&#39;작업을 선택합니다. &#39;이미지&#39;검출 방법을 클릭하여 &#39;엔드 포인트 / 운동&#39;읽기 유형과 &#39;필터&#39;광학 유형을 선택합니다. 접시에 전체 판 &#39;탭&#39;에 OK&#39;.Click &#39;를 클릭하고 우물 군데한다. 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> &#39;목표&#39;옵션 드롭 다운에서 2.5 배의 목표를 선택합니다. GFP 469, 525 및 밝은 필드 &#39;채널&#39;탭에서 두 개의 채널을 선택합니다. 두 채널 모두를위한 &#39;자동&#39;노출을 확인하고 잘 자동 노출을 선택합니다. </li><li> AUT을 확인하려면오 포커스 설정이 &#39;자동 초점&#39;을 선택하고 &#39;옵션&#39;을 클릭합니다. 자동 초점 옵션의 경우, &#39;다음 자동 초점을 스캔하고&#39;방법을 선택합니다. 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. </li><li> 설정 수평 및 수평 간격 (μm의) = 2881 및 수직 간격 (μm의) = 2127으로, 3 × 2 몽타주에 잘 당 여러 이미지를 스캔 0.Select하는 것이 아니라 (μm의)의 중심에서 수직 오프셋. 프로 시저 설정을 저장하려면 &#39;확인&#39;을 클릭합니다. 참고 : 읽기 매개 변수에 대한 표 2를 참조하십시오. </li></ol></li><li> 선정 된 플레이트에 대한 읽기 실험을 수행 <ol><li> 뚜껑을 보장하는 것은 켜져의 &#39;장비 제어&#39;탭을 클릭하고 &#39;밖으로 판&#39;function.Place에게 판 홀더 96 웰 플레이트를 선택합니다. &#39;기기 제어&#39;탭에서 함수 &#39;에서 판&#39;를 선택합니다. 선택 판 탭에서 &#39;지금 읽기&#39;. 96 시간의 후 파종 할 때마다 24 시간까지를 읽어 반복합니다. </li></ol></li><li> 를 사용하여 세포 수의 분석셀 이미 저 소프트웨어. <ol><li> 이미지를 분석하기 위해, 이미지화 된 판의 &#39;데이터&#39;탭을 클릭, 선택 &#39;사진 [GFP 469, 525 + 밝은 필드]. 잘 군데 온 두 번 클릭합니다. </li><li> 로드 이미지를 클릭하십시오. 선택 &#39;분석&#39;과 몽타주의 단일 이미지 분석을 선택합니다. GFP &#39;를 OK&#39;.Check&#39;클릭 &#39;만 채널 및 표 3에 설명 된대로 설정 매개 변수를. 클릭&#39;이미징 세포 매개 변수를 적용 START &#39;를. </li><li> 이미지 당 세포 수를 결정하는 데 사용되는 이미징 셀 위에 위치하는 셀 카운팅 마스크를 관찰한다. 클릭 실험을하는 동안 몇 군데 각 플레이트에 대해이 설정을 &#39;변경 사항을 적용&#39;을 유지한다. </li><li> 일단 다시 이미지화 된 판에, 다운 메뉴에서 &#39;데이터&#39;메뉴를 클릭하고 &#39;세포 수&#39;를 선택합니다. 이것은 물론 당 전체 세포 수를 생성합니다. </li><li> 추가 분석 O를위한 &#39;수출&#39;탭을 클릭하여 스프레드 시트에있는 모든 데이터를 내보내기웰 당 세포 수 (F). </li></ol></li></ol>

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	<li>Lane, D. 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M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrepancies+between+metabolic+activity+and+DNA+content+as+tool+to+assess+cell+proliferation+in+cancer+research.">Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).</li><li>Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜에서 배양 된 세포에서 세포 증식을 측정하는 방법은 세 가지 조사 하였다. 각 방법은 96 시간 동안 세포 증식 재현하고 정확한 측정을 할 수 있었고, 그 결과 (도 2 및 3) ​​실험 방법 각간에 비교 하였다. 발광 기반 분석법 및 세포 영상 법은 모두 96 시간 후 세포 증식의 선형 증가를 나타내는 가장 강력한 결과를 생성 (도 2b, c). 또한, 시간이 지남...

종양 억제 유전자는 p53의는 세포주기 억류, 아폽토시스 및 노화 한 포함한 세포 프로세스의 개수의 필수 레귤레이터이다. 이는 게놈 안정성을 유지할 책임이 있으며, 따라서, 세포 사멸 및 세포 성장의 균형을 유지하는데 중요하다. p53의 돌연변이 암에서 흔히 조절되지 않은 암 세포 증식이 선도 p53의 불 활성화의 주요 원인이다. 흥미롭게도, p53의 돌연변이는 다른 메커니즘은 p53의 기능의 손실에 대해 책임이 있음을 시사 유방암 3의 약 25 %를 차지한다. 최근에 발견 된 p53의 이성체는 인간 암의 다수의 과발현되는 것으로 도시되어 있고, p53의 기능 4,5-를 변조 할 수있다. 우리는 p53의 이성체, Δ40p53는 유방암에서 가장 높은 발현 이성체가 있음을 이전에 도시 한 통상 인접 담배 마는에 비해 상당히 유방암 세포에서 상향 조절된다UE (6). 이것에 따라, 우리는 안정적 레고 IG2 - 순수하지 않아 + 벡터 (GFP의 +)를 이용하여 7 Δ40p53 과발현하는 인간 유방암 세포주 MCF-7 형질. 이들 세포는 높은 Δ40p53 식​​ 유방암 세포에서 세포의 증식 속도가 증가하면 조사 하였다. 시험관 8,9 배양 세포의 세포 증식을 측정하는 다수의 직접 및 간접 방법이있다. 이러한 시간에 따른 연속 측정 또는 종점 분석법 10 중 수행 될 수있다. 기존의 방법은 혈구를 사용하여 세포 계수로, 여전히 유용하다. 이 분석은 낮은 비용과 셀 번호 직접 측정이지만, 계산에서 오류가 큰 표준 편차를 최소화하기 위해 큰 세포 수 및 숙련 된 훈련에 의존 않는다. 고 스루풋 포맷과 호환 측정을 수행 할 필요가 멀티 웰 플레이트 검정의 개발을 유도 하였다. 이 발광 기반 분석은 measu셀 (11, 12)의 대사 활동에 비례하는 발광 신호에 기초하여 세포 수를 재. 최근에, 고 함량의 이미징 플랫폼의 도입 양적 및 질적 표현형 데이터 수집을 제공하는 동안 세포 증식을 모니터링 할 수있는 새로운 도구시키고, 시스템 (13)의 다양한 종류를 포함하고있다. 이들 방법은 모두 연속적인 측정 또는 종점 분석법에 의해 하나, 세포의 성장을 측정하는 길을 제공하며, 각 따라 적절하게 칭량 할 수 모두 감도에 관해서, 시료 번호의 처리량 및 셀 정보 장단점 범위를 가지고 연구 질문에. 이 프로토콜은 감도, 재현성 및 멀티 웰 플레이트 포맷의 다른 범위를 이용하여 각 방법으로 시험관 내에서 세포 증식을 측정하기위한 세 가지 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 혈구 계수 차의 사용과 비교 대상mber 96 시간의 시간 과정을 통해 세포 증식의 측정에 기반 발광 세포 생존력 분석법 및 세포 이미 저. 이를 위해, 벡터 - 형질 도입 된 세포 (MCF-7 LEGO)의 성장은 세 가지 세포 밀도를 사용 Δ40p53 (MCF-7 Δ40p53)를 과발현하는 형질 도입 된 세포와 비교 하​​였다. 세포 증식은 최대 96 시간 동안 매 24 시간을 측정 하였다. 각 방법은 자체의 장점 및 단점을 갖는 것으로, 상기 실험의 목적에 따라 각 여전히 증식 속도에 대한 정보를 제공하기위한 유용한 방법 하였다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium, no phenol-red</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21063-045</td><td>Supplemented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 &amp;micro;g/ml insulin and 1 &amp;micro;g/ml puromycin</td></tr><tr><td>L-glutamine solution (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Insulin solution human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Bovogen Biologicals</td><td>SFBS-F-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>0.5% trypsin-EDTA solution (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15400-054</td><td>Dilute to 2x in DPBS</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>30028-02</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture flask, 75 cm&lt;sup&gt;2 &lt;/sup&gt;growth area</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Scepter 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td>Automated cell counter</td></tr><tr><td>96 well multiwell plate, flat bottom</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Improved Neubauer Hemocytometer</td><td>BOECO Germany</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX51 inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 Assay</td><td>Promega</td><td>G9242</td><td>Luminescence-based assay</td></tr><tr><td>Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging</td></tr><tr><td>Gen5 Data Analysis Software</td><td>BioTek</td><td>GEN5</td><td></td></tr></tbody></table>

comparison of three different methods for determining cell proliferation in breast cancer cell lines

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.

배양 된 세포의 증식 - Δ40p53 MCF-7 세포를 형질 도입의 세포 증식을 측정하는 다른 방법을 연구하는 비 형질 MCF-7 레고 유방암 세포주와 비교 하​​였다. 비교 된 세 가지 방법 - 도식에 설명 된 분석 - 종래 방법 혈구 세포 생존력 발광 분석법 및 세포 이미징 (도 1). 각 방법의 장점은 정확하게 시간이 지남에 따라 셀 계수를 측정하는 단점을 가지고 있으며, 가?...

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Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.4K 조회수.  Hunter Medical Research Institute. This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.

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Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

연구

암 연구학

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile conditions. Different tests seek to identify and quantify these hallmarks of cancerous cells; however, they often focus on a single aspect of cellular transformation and, in fact, multiple tests are required for their proper characterization. The purpose of this work is to provide researchers with a set of tools to assess cellular transformation in vitro from a broad perspective, thereby making it possible to draw sound conclusions.
A sustained proliferative signaling activation is the major feature of tumoral tissues and can be easily monitored under in vitro conditions by calculating the number of population doublings achieved over time. Besides, the growth of cells in 3D cultures allows their interaction with surrounding cells, resembling what occurs in vivo. This enables the evaluation of cellular aggregation and, together with immunofluorescent labeling of distinctive cellular markers, to obtain information on another relevant feature of tumoral transformation: the loss of proper organization. Another remarkable characteristic of transformed cells is their capacity to grow without attachment to other cells and to the extracellular matrix, which can be evaluated with the anchorage assay.
Detailed experimental procedures to evaluate cell growth rate, to perform immunofluorescent labeling of cell lineage markers in 3D cultures, and to test anchorage-independent cell growth in soft agar are provided. These methodologies are optimized for Breast Primary Epithelial Cells (BPEC) due to its relevance in breast cancer; however, procedures can be applied to other cell types after some adjustments.

This protocol provides experimental in vitro tools to evaluate the transformation of human mammary cells. Detailed steps to follow-up cell proliferation rate, anchorage-independent growth capacity, and distribution of cell lineages in 3D cultures with basement membrane matrix are described.

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These relatively simple avascular constructs mimic key aspects of in vivo tumors, such as 3D structure and pathophysiological gradients. MCTSs models can provide insights into cancer cell behavior during spheroid development and in response to drugs; however, their requisite size drastically limits the tools used for non-destructive assessment. Optical Coherence Tomography structural imaging and Imaris 3D analysis software are explored for rapid, non-destructive, and label-free measurement of regional cell density within MCTSs. This approach is utilized to assess MCTSs over a 4-day maturation period and throughout an extended 5-day treatment with Trastuzumab, a clinically relevant anti-HER2 drug. Briefly, AU565 HER2+ breast cancer MCTSs were created via liquid overlay with or without the addition of Matrigel (a basement membrane matrix) to explore aggregates of different morphologies (thicker, disk-like 2.5D aggregates or flat 2D aggregates, respectively). Cell density within the outer region, transitional region, and inner core was characterized in matured MCTSs, revealing a cell-density gradient with higher cell densities in core regions compared to outer layers. The matrix addition redistributed cell density and enhanced this gradient, decreasing outer zone density and increasing cell compaction in the cores. Cell density was quantified following drug treatment (0 h, 24 h, 5 days) within progressively deeper 100 &#181;m zones to assess potential regional differences in drug response. By the final timepoint, nearly all cell death appeared to be constrained to the outer 200 &#181;m of each aggregate, while cells deeper in the aggregate appeared largely unaffected, illustrating regional differences in the drug response, possibly due to limitations in drug penetration. The current protocol provides a unique technique to non-destructively quantify regional cell density within dense cellular tissues and measure it longitudinally.

The present protocol develops an image-based technique for rapid, non-destructive, and label-free regional cell density and viability measurement within 3D tumor aggregates. Findings revealed a cell-density gradient, with higher cell densities in core regions than outer layers in developing aggregates and predominantly peripheral cell death in HER2+ aggregates treated with Trastuzumab.

약물 처리 후 종양 응집체 내의 국소 세포 밀도의 비파괴적 평가

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, including breast carcinomas, are complex 3D tissues composed of cancer epithelial cells and stromal components, including fibroblasts and extracellular matrix (ECM). Yet most in vitro models of breast carcinoma consist only of cancer epithelial cells, omitting the stroma and, therefore, the 3D architecture of a tumor in vivo. Appropriate 3D modeling of carcinoma is important for accurate understanding of tumor biology, behavior, and response to therapy. However, the duration of culture and volume of 3D models is limited by the availability of oxygen and nutrients within the culture. Herein, we demonstrate a method in which breast carcinoma epithelial cells and stromal fibroblasts are incorporated into ECM to generate a 3D breast cancer surrogate that includes stroma and can be cultured as a solid 3D structure or by using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following setup and an initial growth period, surrogates can be used for preclinical drug testing. Alternatively, the cellular and matrix components of the surrogate can be modified to address a variety of biological questions. After culture, surrogates are fixed and processed to paraffin, in a manner similar to the handling of clinical breast carcinoma specimens, for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, the density of cells present, is explained, where ImageJ and CellProfiler image analysis software systems are applied to photomicrographs of histologic sections of surrogates to quantify the number of nucleated cells per area. This can be used as an indicator of the change in cell number over time or the change in cell number resulting from varying growth conditions and treatments.

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

We demonstrate a method to generate 3D breast cancer surrogates, which can be cultured using a perfusion bioreactor system to deliver oxygen and nutrients. Following growth, surrogates are fixed and processed to paraffin for evaluation of parameters of interest. The evaluation of one such parameter, cell density, is explained.

준비 및 분석<em&gt; 체외</em&gt; 3 차원 유방 암 서로 게이트

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

생체공학

고형 종양을 치료하기 위한 이온 채널의 약리학적 표적화

Screening Ion Channels in Cancer Cells

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development of a broad range of disorders or channelopathies. Cancer cells utilize ion channels to drive their own development, as well as to improve as a tumor and to assimilate in a microenvironment that includes various non-cancerous cells. Furthermore, increases in levels of growth factors and hormones within the tumor microenvironment can result in enhanced ion channel expression, which contributes to cancer cell proliferation and survival. Thus, the pharmacological targeting of ion channels is potentially a promising approach to treating solid malignancies, including primary and metastatic brain cancers. Herein, protocols to characterize the function of ion channels in cancerous cells and approaches to analyze modulators of ion channels to determine their impact on cancer viability are described. These include staining a cell(s) for an ion channel(s), testing the polarized state of mitochondria, establishing ion channel function using electrophysiology, and performing viability assays to assess drug potency.

저자 스포트라이트: 암에서 이온 채널의 역할 탐색: 특성화 및 잠재적 치료 접근법 

The pharmacological targeting of ion channels is a promising approach to treating solid tumors. Detailed protocols are provided for characterizing ion channel function in cancer cells and assaying the effects of ion channel modulators on cancer viability.

암세포의 이온 채널 스크리닝

Ion channels are critical for cell development and maintaining cell homeostasis. The perturbation of ion channel function contributes to the development ...

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., immunosuppressive or immunostimulatory) chemical compounds and biologics. One of the earliest steps during mitogenesis is cell enlargement or blastogenic transformation, whereupon the cell volume increases before division. It is usually detectable in the first several hours of T-lymphocyte stimulation. Here, we describe a rapid method to quantify blastogenesis in T lymphocytes isolated from mouse spleens and human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using an automated cell counter. Various commonly used proliferation assays for the most part are laborious and only reflect the overall population effect rather than individual cellular effects within a population. In contrast, the presented automated cell counter assay provides rapid, direct, and precise measurements of cell diameters that can be used for assessing the effectiveness of various mitogens and immunomodulatory drugs in vitro.

T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.

면역 마약 식별을위한 T 림프구에서 미토 겐 유도 블라스의 신속한 정량

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

면역학 및 감염병학

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

생물학

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

유방암 세포주에서 세포 증식을 결정하기위한 세 가지 방법 비교

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셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법