CD8+T hücreleri farklı dokularda farklı özellikler taşırlar, mukozal olmayan ve lenfoid olmayan dokunun kritik bir örneğidir. Doğrudan tam T-hücre biyolojisi anlamak için böbrek yerleşik hücreleri karakterize etmek esastır. Burada böbrek yerleşik CD8 + T hücreleri sonraki akış sitometri analizi barındıran izole etmek için uygun yöntemimizi gösterecektir.
Bu yöntem, enfeksiyonlar dan sonra oluşturulan efektör ve bellek CD8+T hücrelerinin çalışmaları ve otoimmün yanıtlar hakkında bilgi sağlayabilir. İşlem, laboratuvarımiçin araştırma görevlisi olan Dr. Chaoyu Ma tarafından yapılacak. Biotin anti CD8 alfa antikorseyreltme ile başlayın 15 PBS başına mikrogram, her fare için 200 mikrolitre yönetmek için yeterli olduğundan emin olun.
Enjeksiyondan önce, farenin kuyruk damarını bir havai ısı lambası ile 5 ila 10 dakika boyunca ısıtın. Önceden seyreltilmiş antikor karışımından 200 mikrolitreyi 28 kalibrelik bir insülin şırıngasına çekin ve pistonu yukarı aşağı hareket ettirerek hava kabarcıklarını çıkarın. İğne ve şırınga arasında 150 derecelik bir açı oluşturmak için iğneyi bükün, böylece iğne kuyruk damarına paralel olacak şekilde yukarı doğru eğilin.
Bir kemirgen dizginleyici ile fareyi dizginlemek ve damar açıkça görünür hale getirmek için% 70 etanol ile kuyruk sprey. Baskın olmayan elin başparmak ve orta parmakları ile distal ucunda kuyruk tutun, sonra enjeksiyon sitesi altına işaret parmağı yerleştirin. Baskın el ile kalp yönüne paralel olarak damar içine iğne takın ve yavaş yavaş antikor 200 mikrolitre enjekte.
İğneyi çıkarın ve kanama durana kadar enjeksiyon bölgesini hafifçe sıkıştırın. Fareyi ötenazi yaptıktan sonra böbreği makasla inceleyin ve 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Daha fazla işleme kadar buz üzerinde örnekleri bırakın.
Fare başına bir kuyu kullanarak, her kuyuda üç mililitre sindirim çözeltisi içeren altı kuyulu tabaklar hazırlayın ve bunları buzüzerinde saklayın. Her numune tüpüne 300 mikrolitre sindirim çözeltisi ekleyin ve böbrek örneklerini düz bir yay makasla dolayın. Kıymalı böbrek örneklerini sindirim solüsyonu ile altı kuyulu tabaklara aktarın.
Örnekleri 37 derecede, yumuşak bir şekilde 45 dakika sallayarak kuluçkaya yatırın, sonra üç mililitrelik şırınganın dalgıç flanşıyla dokuyu homojenize edin ve 15 mililitrelik konik tüplere aktarın. Örnekleri 500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca aşağı çevirin. Supernatant çıkarın ve% 10 FCS rpmi üç mililitre pelet resuspend.
Beş dakika boyunca 500 kez g ve dört santigrat derece örnek aşağı spin, sonra supernatant kaldırmak ve% 44 yoğunlukgradient orta ve RPMI karışımı beş mililitre ile hücre pelet yeniden askıya. %67 yoğunlukgrad orta ve PBS üç mililitre içeren üç mililitrelik pipet ucu doğrudan her tüpün altına koyun ve ağır çözelti alt kısmında ayrı bir tabaka oluşturur, böylece yavaş yavaş solüsyon bırakın. Azaltılmış gaz ve fren ayarlarıyla numuneleri 20 dakika boyunca 900 kez g'de döndürün ve katmanları bozmadan tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın.
Lenfosit tabakasıdokunmadan bir transfer pipet ile üst tabaka çıkarın ve yeni bir 15 mililitrelik tüp lenfosit tabakası transfer. Tüpü PBS ve %5 FCS ile doldurun, sonra tüpü yavaşça 4-6 kez ters çevirerek karıştırın. Örnekleri 500 kez G ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj ettikten sonra, süpernatantı çıkarın ve 500 mikrolitre tam RPMI ortamıile hücre peletini yeniden askıya alın.
Hücreler şimdi akış sitometri boyama için hazırdır. Yoğunluk santrifüj aracılı lenfosit zenginleştirme sonra bile, son ürün olmayan lenfositlerin büyük bir kısmını görmek çok yaygındı. Ancak canlı lenfositler kazandıktan sonra CD8+T lenfositlerinin tanımlanması kolaydı.
Beklendiği gibi, sadece ekstra vasküler CD8+T hücreleri verimli doku yerleşik bellek T-hücre fenotipler, CD69 upregülasyonu ve Ly6C downregulation gibi elde. Enfekte farelerin aksine, SPF tesisinde bulunan genç naif farelerden izole edilen CD8+T hücrelerinin büyük çoğunluğu CD8 alfa antikoru ile etiketlendi ve bu nedenle intravasküler bölmeye aitti. Bu teknik, yoğun vaskülarize organlarda doku yerleşik bağışıklık hücrelerinin araştırılması büyük ölçüde hızlandırmıştır.
