Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).

1. Hücre Hasat <ol><li> Primer doku hasat hücrelerin Not: Primer doku hasat hücreleri için tarif edilen işlem, fare meme tümör dokusu için özel olarak uygulanabilir ve başka kaynaklardan, birincil dokular için uygulanabilir olmayabilir. <ol><li> 5 mg hiyaluronidaz ve doku gramı başına 10 ml DMEM / F12 ortamında 30 mg kolajenaz çözülmesiyle sindirim tamponu hazırlayın işlenecek. sindirim tampon sterilize filtre. </li><li> Fare ve kayıt tümör ağırlığından birincil meme bezi tümörü izole edin. </li><li> en az 5 dakika süreyle 10. neşter ile dokusunu inceltmek. </li><li> sindirim tamponu (doku gramı başına 10 ml tampon) uygun hacme kıyılmış doku ekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de 1-3 saat boyunca 100 rpm&#39;de sindirim tamponu içinde kıyılmış doku çalkalayın. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine 0.4 um&#39;lik bir filtre boyunca hücrelerin geçirilerek tek bir hücre süspansiyonu elde edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleriC. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> Yeniden süspanse 4 ml DMEM / F12 içinde topak, 5 ml yuvarlak tabanlı bir tüpe transfer. </li></ol></li><li> Doku kültüründen hasat hücrelerin <ol><li> Plakayı ya da oda sıcaklığında, kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yapışık hücre şişesi. Not: hasat hücreleri için tarif edilen teknik, insan embriyonik kök hücre (HESC) kültürü hücrelerinin yapışık özellikle geçerlidir. Bununla birlikte, tarif edilen protokol kalan diğer kültürlenmiş hücre çizgileri, yapışkan olmayan hatları ve primer hücreler geniş çapta uygulanabilir. </li><li> yapışkan hücrelerden tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için optimize edilmiş bir ısıtılmış (37 ° C), tripsin ve diğer enzimatik sindirim reaktif ekleyin. Üreticinin protokolü takip edin. Not: tripsin ve diğer enzimatik ayrılma reaktif hücre işaretçileri etkileme potansiyeli vardır. </li><li> 37 ° C&#39;de inkübasyona bırakılır2-5 dakika hücreleri ayırmak için ° C. yüksek confluency kültürler için, hafifçe hücreleri ayırmak yardımcı olmak için plakayı dokunun. </li><li> 5 mL&#39;lik yuvarlak tabanlı tüp içine levhadan tamamen müstakil hücreleri aktarın ve yavaşça hücreleri ayırmak için 1 ml pipet kullanılarak pipetleyin. Not: Tüm adımlar, alternatif olarak, bir 96 yuvalı yuvarlak tabanlı plaka içinde gerçekleştirilebilir örneklerin çok sayıda işlem için. 96 oyuklu bir formatta örneklerinin işlemden geçirilmesi için tüm yıkamalar 250 uL&#39;lik bir hacimde gerçekleştirilir. Toplam hacim 300 uL aşmayacak şekilde diğer adımlarda açıklanan miktarlar ayarlanabilir. </li><li> (PBS içinde% 0.5 BSA ve% 0.02 sodyum azit) eşit hacimde yıkama tamponu ile enzimatik sindirim reaksiyon ajanı söndürüldü. NOT: Sodyum azid tehlikeli kimyasaldır. Uygun güvenlik önlemleri kendi üretim ve taşıma bakımından uyulmalıdır. </li><li> 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> süspanse edin1 ml serumsuz ortamdaki hücreler. </li><li> bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 10 uL transfer hücreleri sayın. tripan mavisi ve bir hemositometrede transfer veya otomatik hücre sayım sisteminde bilinen bir orana kısım seyreltin. </li></ol></li><li> S-faz nüfus Etiketleme NOT: S-fazı etiketleme olmayan gerçekleştirilecekse 1.4 kök devam edin. <ol><li> Her 2 x 10 6 hücre analiz edilmesi için serumsuz DMEM F12 veya diğer uygun ortam içinde 10 uM 5-İyodo-2&#39;-deoksiüridin, 1 mL (DUK) hazırlayın. </li><li> Her 2 x 10 6 hücre için serumsuz ortam içinde 10 uM Idu 500 uL ekleyin. Not: DUK etiketleme serum ihtiva eden ortam içinde yapılabilir olmakla birlikte, serbest protein, ölü hücrelerin uygun etiketleme önlenmesi, sisplatin ile reaksiyona girer. Serum içeren ortam etiketleme DUK sırasında kullanılan, ek bir yıkama aşaması serumsuz ortam sisplatin ölü / canlı sta öncesinde serum proteinleri uzaklaştırmak için gerekli olan biradencilik. </li><li> Yavaşça 1 mL pipet ile pelet yeniden süspanse edin. </li><li> hafif sallama ile 37 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edilir. </li></ol></li><li> Canlı / Ölü etiketleme <ol><li> Her bir örnek için serumsuz DMEM-F12 ya da hücre tipi, uygun ortam içinde 50 uM sisplatin 500 uL hazırlar. Not: DUK S-fazı nüfusun etiketleme değildir yapılacak ise, 4 x 10 6 hücre / mL&#39;lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon örnekleri. sisplatin ekleyerek tekdüze canlı / ölü etiketleme için çözümlerin daha çabuk karışmasını sağlayan önce hücrelerin tekrar asılı. </li><li> Örnekler 2 x 10 6 hücre başına 50 uM sisplatin 500 uL ekleyin. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde 1 dakika için oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. </li><li> Yıkama tamponunun eşit bir hacmi ile sisplatin söndürün. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> İki kez yıkayın numuneleri500 uL yıkama tamponu ile aşırı sisplatin kaldırın. </li><li> İki kez 500 uL PBS ile yıkayın numuneler aşırı protein kaldırmak için. </li></ol></li><li> Numune sabitleme <ol><li> 500 ul PBS içerisinde yeniden süspanse örneği. </li><li> % 2&#39;lik bir nihai konsantrasyona PBS içinde% 4 PFA eşit miktarda ilave et; pipet karıştırmak için. Not: 6.9 arasında olan pH seviyesini ve 0.44 um filtre içinden geçmesi, toz,% 4 PFA taze hazırlayın. PBS içinde% 4 PFA, iki haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. genellikle ölçülen kütle kanallarında parazite yol açabileceği metal kirleticiler içerir olarak, özel olarak, test edilinceye ampuller verilen önceden yapılmış formalin, kaçının. PFA alt konsantrasyonu yeterli olduğu ve antikor bağlanması ile tespit etkisini en aza indirmek için yardım ancak ampirik olarak test edilmelidir olabilir. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle yüzer wi aspirethout topağına zarar. </li><li> PBS ile yıkayın örnekleri PFA çözüm kaldırın. NOT: Bu adımda numuneler 4 ° C&#39;de kısaca saklanabilir. 4 ° C&#39;de uzun süreli depolama örneğinin bozulmasına neden ve azaltılmış lekeleme olabilir. </li></ol></li></ol> 2. Barkodlama NOT: Monoizotopik sisplatin barkodlama ve paladyum barkod kullanan için metodoloji aynı anda sunulurken, ya bağımsız kullanılabilir veya deney için gerekli değilse tamamen kaçınılmalıdır. <ol><li> Monoizotopik Cisplatin Barkodlanması NOT: Canlı / Ölü boyama kanalları bakım örtüşen itimat sisplatin barkodlama ve sisplatin canlı hücrelerde bu arka plan sisplatin Canlı / Ölü boyanma sağlamak için alınması gereken bu yana sisplatin barkod doğruluğu engel olabilecek bu şekilde en aza indirilir. <ol><li> PBS içinde 200 uM ila 1 mM monoizotopik sisplatin stok çözeltileri ile seyreltilir. </li><li> e içinACH benzersiz sisplatin barkod bu barkod alan her 2 x 10 6 hücre için 500 ul PBS ile 1.5 ml tüp hazırlanır. </li><li> Her benzersiz barkod 200 nM nihai konsantrasyona geçerli her Monoizotopik sisplatin eklemek hazırlamak için. </li><li> 2 x 10 6 hücre başına 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> Her bir örnek için, karşılık gelen barkod çözeltisinin eşit hacim. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Yıkama tamponunun eşit bir hacmi ile sisplatin söndürün. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> iki kez 500 uL yıkama tamponu ile yıkayın örnekleri fazla sisplatin kaldırın. </li></ol></li><li> paladyum Barkodlama Not: Paladyum barkod reaktifleri, hazırlanan 5 ya da ticari olarak satın alınabilir. <ol><li> kısmi Geçicipermeabilization 19 NOT: reaktif hücre zarlarını geçmek ve sağlam hücre etiket için palladyum şelasyon barkod kısmi geçirgenliği gerektirir. <ol><li> 500 uL PBS ile yıkayın örnekler. </li><li> 500 uL PBS artı% 0.02 saponin ile yıkayın örnekler. </li><li> kalıntı hacme yeniden süspanse pelet. </li></ol></li><li> Paladyum barkodu sistemi. <ol><li> 1 ml buzla soğutulmuş PBS artı% 0.02 saponin paladyum barkod reaktifi 100x stokunu. </li><li> Hızla yeniden süspansiyon haline getirilmiş numune için seyreltilmiş barkod reaktifmi. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> Yıkama örnekleri iki kez 500 uL yıkama tamponu. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Hücre Yüzeyi Boyama NOT: Hücre yüzey boyama öncesinde tespit canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu thei için afinite kaybeder antikorlar için gerekli olabilirtespit sonrasında R epitopu. Bazı hücre numuneleri, örneğin arka planı azaltmak için önceki antikor etiketleme lökositlerin Fc engellenmesi gibi ek bloke yararlanabilir. Optimum bloke ampirik olarak belirli bir numune tipi için belirlenmelidir. <ol><li> Hücre yüzeyi antikor boyama paneli hazırlayın. <ol><li> 1.5 ml tüp içine her numune başına 0.5 mg / mL, hücre yüzeyi antikorun 0.5 uL, ya deneysel olarak belirlenmiş miktarda bir araya getirin. örnek başına 10 uL hacmi getirmek için gerektiğinde yıkama tamponu ilave edin. Pipetleme ile karıştırın. NOT: titrasyon deneyi ile empirik deney öncesinde her bir antikor için seyreltme çalışma belirler. </li><li> eşit biçimde, her bir numune için bir 1.5 ml tüp içine Bölünmüş hücre yüzeyi antikor havuzu lekelenmesine. </li><li> Her numune için, 1.5 ml bir tüp içinde, yıkama tampon 500 ul hazırlayın. </li></ol></li><li> Tüm numuneler için normalize hacmindeki numunelerine Hücre yüzeyi lekelenmesi uygulayın. NOT: ens içinBirden fazla numune boyunca ure tutarlı Antikor etiketleme dikkatli bir numune hacmi ve antikor konsantrasyonunu kontrol etmek için son derece önemlidir. Aşağıdaki adımlar, antikor ilave edildikten sonra son numune hacimleri tek biçimli olduğu sağlayarak bu kıvam elde etmek amacı. <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> 50 uL 200 uL pipet seti ile, parçalara ayrılır, hücre yüzey antikoru havuzunun bir tüpe örnek pelet ve transfer kalan çözelti çıkarın. </li><li> Pipet ucu içine hava çizmeden alikot tüp tüm sıvı kadar Pipet. </li><li> Pipet pistonu tutan çekme önlemek için ise hava tampon ve pistonu serbest yıkama 500 uL hazırlanmış bir tüp içine ucu hareket eder. </li><li> örnek üzere pipet ucu içeriğini geri eklenir ve yavaşça pipetleme ile sıvı içinde örnek tekrar süspansiyon. </li><li> 1 için numune inkübesürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında h. </li><li> iki kez 500 uL yıkama tamponu ile yıkayın örnekleri tüm serbest antikor, yıkanıp emin olmak için. </li><li> 500 uL PBS ile yıkayın örnekler. </li><li> 500 ul PBS içinde hücre pelletini. </li><li> PBS içinde% 4 PFA eşit miktarda ilave et; pipet karıştırmak için. </li><li> bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol></li></ol> 4. hücre geçirgenliği ve hücre içi boyanması <ol><li> Hücre permeabilization <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> Pelet ayrışmış kadar yavaşça girdap oluşturarak kalıntı hacim içinde tekrar süspansiyon hücreleri. Not: MeOH birbirlerine yapışmasını hücreleri neden olur eklenmesi ve kısmen örnek kaybına neden olan bir ince film üretmek için önce hücreleri ayırmak için başarısızlık. </li><li> Hemen 1 ml, 2 x 10 6 100% MeOH ilave &lt;/ Sup&gt; hücreler ve karıştırmak için hafifçe pipet. Not: diğer geçirgenleştirilmesi yöntemleri MeOH ile ikame edilebilir ve bazı hücre tipleri için uygun geçirgenliği elde etmek için gerekli olabilir. hala tutarlı geçirgenliği sağlarken, bazı hücre kaynakları için bir% 0.1 Triton X-100, geçirgenliği için PBS çözeltisi içinde% 0.2 Tween-20 veya% 0.1 saponin, daha iyi bir hücre bütünlüğünü muhafaza edebilir. </li><li> geçirgenliği için 4 ° C&#39;de 24 saat, en fazla en az 1 saat süre ile veya en fazla inkübe edin. Not: MeOH örnekleri -80 ° C&#39;de en fazla 1 aya kadar saklanabilir Bu adımda. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> Her MeOH örnek permeabilize kullanılan ml yıkama tamponu 1 mL ekleyin. Yavaşça hücre pelletini. </li><li> 500 uL yıkama tamponu ile iki kez örnek yıkayın. </li></ol></li><li> Hücre içi antikoru boyama paneli hazırlayın. <ol><li>1.5 ml tüp içine her numune başına 0.5 mg / mL, hücre içi antikoru 0.5 uL, ya deneysel olarak belirlenmiş miktarda bir araya getirin. örnek başına 10 uL hacmi getirmek için gerektiğinde yıkama tamponu ilave edin. Pipetleme ile karıştırın. </li><li> eşit biçimde, her bir numune için bir 1.5 ml tüp içine hücre içi antikoru havuzu bölme. </li><li> Her numune için, 1.5 ml bir tüp içinde, yıkama tamponu 500 uL hazırlayın. </li></ol></li><li> Tüm numuneler için normalize hacmindeki numunelerine intraselüler boyama uygulayın. Not: dikkatle numune hacmi ve antikor konsantrasyonunu kontrol etmek için çok önemli olan çok sayıda numune tutarlı antikor etiketleme sağlamak. <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> 50 uL ayarlanmış 200 uL pipetle numunelere hücre yüzeyi antikor havuzunun bir tüpe örnek pelet ve transfer çözeltisi kalan kaldır. </li><li> Pipetkadar alikot tüp içindeki sıvı tüm pipet içine hava çekmek olmadan. </li><li> Pipet pistonu tutan çekme önlemek için ise hava 50 uL bir toplam numune hacmi için yıkama tamponu hazırlanması, tampon ve pistonu serbest yıkama 500 uL hazırlanmış bir tüp içine ucu hareket eder. </li><li> örnek üzere pipet ucu içeriğini geri eklenir ve yavaşça pipetleme ile sıvı içinde örnek tekrar süspansiyon. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1 saat için inkübe edin. </li><li> Yıkama örnekleri iki kez 500 uL yıkama tamponu. </li><li> 500 uL PBS ile yıkayın örnekler. </li></ol></li></ol> 5. İridyum Etiketleme <ol><li> Fix numuneleri <ol><li> 500 ul PBS içinde yeniden süspanse örnekleri. </li><li> PBS içinde% 4 PFA 500 uL ekleyin. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika içinde en az inkübe edin. </li></ol></li><li> DNA iridyum etiketleme uygulayın <ol><li&gt; 62.5 nM konsantrasyona PBS içinde% 4 PFA içinde 125 uM 500x iridyum interkalasyon reaktifi seyreltin. </li><li> örnekler 500 uL 62.5 nM iridyum PFA solüsyonu ekleyin. NOT: overstaining önlemek için 2.000: permeabilize hücreleri kullanılarak deneyler için, bir son 1 seyreltme için 500x Ir191 / 193 stok seyreltin. </li><li> sürekli karıştırma ile bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. Not: güçlü Ir193 sinyalleri Pt194 kütle kanala katkı olumsuz barkod kalitesini etkileyebilir çünkü monoizotopik sisplatin barkodu performans daha uzun, 15 dakika boyunca iridyum ile örnekleri inkübe yoksa. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li><li> iki kez süzüldü, iyonu giderilmiş su içinde 500 uL% 0.1 BSA ile yıkayın örnekler. NOT: Bir kere mümkünse biz 24 saat içinde numuneleri çalıştırmanızı öneririz hazırladı. Hazırlanan numuneler, 4 ° C&#39;de kısa süreli saklanabilirancak bakım bozulmasını önlemek için alınmalıdır. bu alet temizleme azalacaktır makinesinin püskürtme odası ve örnekleyici konileri birikimini azaltmak gibi son yıkama BSA&#39;sız süzülmüş deiyonize su içinde yapılmalıdır mümkünse. HESC için, BSA boru yüzeyine yapışmasını örnek kaybını önlemek için de dahil olmak üzere iken, bu yıkama işlemi gerekmektedir. </li></ol></li></ol> 6. Acquisition&#39;ın Örnekleri hazırlayın <ol><li> hücre sayımı <ol><li> süzülmüş deiyonize su içinde 500 uL% 0.1 BSA içinde yeniden süspanse hücreleri ve 35 um hücre filtresi kapağı boyunca taze tüpe filtre. NOT: son yıkar için BSA seviyesini düşürmek Kitle sitometrisi püskürtücü kalıntısından azalır. Yapışmayan hücreler yıkanır ve süzülmüş deiyonize su içinde yeniden süspanse edilebilir. </li><li> mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu 10 uL transfer hücreleri sayın. bilinen bir orana kısım seyreltintripan mavisi (hücre görselleştirme yardım etmek için) ve bir hemositometrede veya otomatik hücre sayımı sistemine aktarılır. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. Boşaltacaktır ya da dikkatle topağına zarar vermeden süpernatant aspire. </li></ol></li><li> Hazırlama ve yük örnekleri <ol><li> Kalibrasyon boncuklar buzdolabından çıkarın ve yeniden süspansiyon haline getirilmesi şiddetle çalkalanır hazırlamak. </li><li> otomatik numune alıcı sitometri kütlesi kullanılarak örnekleri çalışan, daha sonra analiz edilecek olan arzu edilen hücre sayısını eklemek numune plakasının her oyuğuna kalibrasyon, boncuk tanelerin 50 uL ekleyin. kılavuzu enjeksiyon ile çalışan örnekleri örneklemek için kalibrasyon, boncuk tanelerin 50 mcL ise, süzüldü, iyonu giderilmiş su içinde numunenin seyreltilmesi karıştırın ve Kütle sitometrisi örnek enjeksiyon portuna yük örneği. Uygun numune seyreltme analiz edilen hücre tipine bağlı olarak değişebilir, ancak, 10 6 bir seyreltme 1 genel olarak uygundur. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+cytometry:+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer.">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398 (2012).</li><li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization.">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li><li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization.">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li><li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry.">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li><li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm.">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li><li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+(CyTOF).">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li><li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry.">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li><li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry.">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li><li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling.">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li><li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle.">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li><li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry.">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum.">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li><li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry.">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).</li><li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry.">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li><li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival/proliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem/progenitor+cells.">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li><li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development.">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li><li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE.">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li><li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia.">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li><li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining.">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li><li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards.">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li><li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data.">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li><li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data.">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li><li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry.">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li><li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizaing+Data+using+t-SNE.">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li><li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry:+Measure+for+measure.">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li><li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+cytometry.">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li><li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brilliant+violet+fluorophores:+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments.">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li><li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-FISH:+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry.">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li><li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells.">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada sunulan protokol başarıyla çeşitli kültürlenmiş hücre çizgileri (H1 ve H9 HESC, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) ve birincil doku örnekleri (fare kemik iliği, fare embriyonik karaciğer, fare yetişkin işlenmesi için kullanılan edilmiştir karaciğer, fare tümör). Bağımsız kaynağı, hücre durumunu muhafaza sitometrisi kütle analizi için uygun olmalıdır, ancak bir protokol optimizasyon gerektirebilir ise tek hücre halinde ayrılabilir bir doku. Bazı epitoplar kullanılan spesifi...

Sitometri büyük hücre popülasyonları arasında, bir tek hücre düzeyinde birden, antikor hedefi ölçümünü sağlar. Geleneksel flüoresan bazlı akış sitometrisi olarak, ölçülebilir parametre sayısı parametreleri sayısı arttıkça daha karmaşık dengeleme hesaplamalar gerektirir birden florofor emisyon spektrumu arasındaki spektrum çakışmasının ile sınırlıdır. Bu kısıtlamalar, ağır metal-konjüge edilmiş antikorları tespit edilir ve büyük ölçüde eş zamanlı olarak toplanır parametre sayısını arttırmak ve her bir hücre için yüksek bir boyutsal protein bolluğu profilini elde etmek için bir uçuş (TOF) kütle spektrometresi zaman ile hesaplanır kütle sitometrisi tarafından ele alınmaktadır. enstrümanın sitometrisi kütlenin çalışmaları bir temel anlayış kullanıcıya faydalıdır ve sorun giderme için gerekli olabilir. Daha kapsamlı bir ayar açıklaması ve kitlesel sitometrisi makinesini çalıştıran için,ilgili el yazması 1 &#39;e bakınız. Kısaca, bir hücre numunesi, hücre yüzeyi markerleri sitoplazmik proteinleri, nükleer proteinler, kromatin bağlı proteinleri veya (Şekil 1i) &#39;in diğer epitopları hedefleyen metal konjuge bir antikor paneli ile etiketlenir. Sınıflandırılmış hücreler, bir otomatik numune alıcı ile makineye yüklenmiş, ya el ile enjeksiyon sureti ile bir zamanda bir ya da olduğu, 96 oyuklu bir plaka örnekler. Yüklü hücreler hücreler (Şekil 1ii) kapsül, sıvı damlacıkları spreyini üreten bir nebulizer aracılığıyla enjekte edilir. Hücreler, bir argon plazma lambasının iyonize böylece Bu sprey konumlandırılır. Bu iyonizasyon her bir hücre (Şekil 1iii) oluşturan bütün atomlardan müteşekkil bir partikül bulutu oluşturur. Bu partikül bulutu detektöre ettikçe, düşük atomik kütle atomu, bir dört kutuplu kütle filtre ile yüksek kütle iyonu ayrılır. Geri kalan, yüksek kütle iyonlarını dedektörü, abund devamHer bir izotopun formans (Şekil 1iv) ölçülür. detektör tarafından toplanan ham veriler, hücre olayları tanımlamak için kitle sitometrisi enstrüman yazılımı tarafından analiz edilir. Tanımlanan her bir hücre etkinliği için, her bir kanal tespit sinyali ölçülür ve bir çıkış .fcs dosyaya kaydedilir. ağır metal olarak birleştirilmiş antikorlarını tespit etmek için kullanılan seri kanal% 1&#39;in altında en katılım% 0-4 arasında değişmektedir az spektral örtüşme sergiler. Çünkü kanallar arasında bu düşük çapraz konuşma, analiz 2 önce bir telafi matris veri dönüştürmek için genel olarak gereksizdir. Ancak, bakım, bu gibi, bir yüksek bolluk epitopa sahip bir antikor, bir düşük miktardaki bir antikor atanmış bir kanala sinyali katkıda bulunan bir kütle kanalına tahsis emin olmak için antikorların deneysel panelinin tasarımı sırasında alınmalıdır sinyal katkı alıcı kanalın bir yapay yüksek nüfus oluşturmak. <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; sitometri analizi kütle için numune kesin hazırlanması toplanan numunelerin tiplerine bağlıdır ve deney hipotezi test edilir. Bu farklı hücre tiplerini (insan embriyonik kök hücreler) ve birincil hücreler (fare meme tümörü epitel hücre izolatı) hasat etmek üzere iki protokol örneklerini temin etmektedir. Bir kitle sitometrisi Çalışmanın başlangıcında, her şeyden önce protokolleri ve antikorlar araştırmacının elinde iyi çalışıyoruz yararlanılacak sağlamak için küçük bir pilot deneyi yürütmek için tavsiye edilir. Özel konjüge antikorlar kullanılacak olan bu antikor, konjugasyon sırasında kısmi indirgeme reaksiyonu gibi antikor afinitesini bozmaya potansiyeline sahip, özellikle önemlidir; Bu nedenle, her bir özel antikorun veri doğruluğunu sağlamak için deneysel olarak doğrulanmış edilmesi gerekmektedir. bunlar ne ise hücre yüzeyi antikorları tespit sonrası epitoplarını tanıyacak tahlilinde kullanılabilir veya eğer diğer hususlar anlaşılması,ed hücrelerini canlı uygulanacak. Peptit-MHC 3, 4 boyanması ile oluştuğu bilinmektedir gibi bazı sabitleme hücre yüzeyi antikorlarıyla uygun boyama engelleyebilir. Canlı hücreler üzerinde hücre yüzey antikoru boyamasını gerçekleştirilmesi bazı antikorlar için gerekli olabilir, ama bu antikor bazlı barkod 6, 7, bir durum olduğu halde en çok barkod yöntemleri tespit 5 sonra gerçekleştirilir gibi antikor etiketleme önce barkod seçeneğine engeller olabilir. hücre sayısının belirlenmesi analizi için hazırlanacak olduğunda, makine üzerine yüklenen hücrelerin sadece bir kısmı tespit edilecek biliyoruz ve veri üretmek için önemlidir. nebülizör torçta örnek spreyler, bu kayıp verimsizliklere esas kaynaklanmaktadır. Kesin yüzde kaybı% 50-85 arasında olabilir makine kurulumu ve hücre tipi ama sitometrisi kütlesine bağlıdır ve olmalıdeney tasarımı düşündü. Bu protokol, numune başına 2x10 6 hücreleri için optimize edilmiş ama daha küçük ya da daha büyük örneklerin işlenmesi için uyarlanabilir. Bu protokol, ancak örnek sayısı, bir deney içinde tutarlı tutulması önemlidir, 4 x 10 6, 1 x 10 6 örnek boyutları için, en az modifikasyon ile kullanılabilir. Hücre sayısındaki değişimler barkod ve antikor boyama yoğunluğunu etkileyebilir ve numuneler doğrudan karşılaştırılmalarını mümkün boyunca yaklaşık tutarlı tutulmalıdır. tüm deneysel tasarımlar değilse böyle ölü hücre etiketleme ve DNA etiketleme gibi bazı uygulamalar ise, büyük çoğunluğunda yapılmalıdır. Sadece yüzey belirteçleri analiz eden deney ölü hücrelerin etiketlenmesi Rh103 kullanılarak elde edilebilir, ancak Rh103 bu boyama kaybına yol açtığı için geçirimli hale gereklidir deneyler için kaçınılmalıdır. geçirgenliği içeren deneyler için, sisplatin kullanılması tavsiye edilir <sSınıf = &quot;xref&quot;&gt; 8 ve yukarı mümkün olduğunda, yarık PARP ve klivaj Kaspaz tanıyan bir antikor apoptotik ve ölü hücrelerin tespit etmek. Çizgi örnekler, antikor tüketimini azaltmak etme süresini azaltmak ve ortadan kaldırabilen örnek-örnek değişkenlik 9. barkod süreci menşe örnek için her hücre atamak için kullanılan tüm hücreler, benzersiz bir numuneye özgü kod uygulanmasını içerir. örnekleri barkod sonra antikor boyaması, tüm örnekler eşit boyanmış sağlayan bir yönteme önce toplanmış olabilir. Deneysel hatayı en aza indirmek için, barkodun ihtiyatlı ve doğrudan birbirlerine karşılaştırılacak hiçbir örnekleri havuz. Şu anda (aşağıya bakınız) burada sunulmaktadır ikisi analizi 5, 6, 7, sitometrisi kitle için örnek barkod için çeşitli yöntemler de mevcuttur. şu anda mevcut Reagen ile38, antikor hedefi bolluğu ölçmek S-fazı 10 hücreleri tespit canlı ve ölü hücreler 8 ayırt ve çok sayıda numune bir çoğullamalı deneyde hipoksi 11 hücresel seviyelerinin ölçülmesi mümkündür ts. Büyük hücre popülasyonları için yüksek bir parametre, tek bir hücre veri toplamak için bu yeteneği yüksek ölçüde heterojen bir hücre popülasyonlarının iyileştirilmiş profil sağlar ve daha önce, yeni biyolojik anlayış, 12, 13, 14, 15, 16, bir dizi üretti. Yorumlanabilir bilgilere elde edilen kompleks veri Damıtma Kapsayan Ağaç Yoğunluk Normalize Olayların Gelişimi (maça) 17 ve vişne 18 de dahil olmak üzere bilgisayar algoritmaları kullanımını gerektirmiştir. Bu makale erişilebilir bir sunarnasıl genel tasarım ve deney sitometri bir kitle yürütmek ve veri sitometrisi kitlenin temel analizini tanıtır için.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>mTeSR1 medium kit</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>05850</td>
			<td>Warm at room temperature before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F-12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell technologies</td>
			<td>07920</td>
			<td>Warm at 37&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Equitech</td>
			<td>BAH62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ID Pt194</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>Provided at 1mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ID Pt195</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>Provided at 1mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ID Pt196</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td></td>
			<td>Provided at 1mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-400-040-M250</td>
			<td>Soluble to 25mg/ml in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Iodo-2&#39;-deoxyuridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7125</td>
			<td>Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodium 103 intercelating agent</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1105-4</td>
			<td>Chill at -20&#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml 35um filter cap tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EQ four element calibration beads</td>
			<td>Fluidigm</td>
			<td>201078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase Type I-S</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel #10</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z69239</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass cytometry analysis

Kütle sitometrisi ağır metal etiketler, iyi sitometrisi geleneksel floresan bazlı akışıyla mümkün olanın ötesine parametreleri ve derin analiz için imkânlar artırılmıştır ölçüde olan bir yaklaşımla konjuge antikorları kullanır. Herhangi bir yeni teknoloji olduğu gibi, yüksek kaliteli veri güvenilir nesil sağlamaya yardımcı kritik adımlar vardır. kütle sitometri analizi için hücre örneklerinin işleme için birden çok teknikler içerir optimize edilmiş bir protokol burada sunulmuştur. Burada anlatılan yöntemleri kullanıcı ortak tuzaklardan kaçınmak ve yanlış verilere yol açabilir değişkenliği, minimize ederek tutarlı sonuçlar elde yardımcı olacaktır. Deneysel tasarım bilgilendirmek için, protokol ve araştırılmaktadır sisteminin biyolojide yeni bulgular ortaya çıkarmada bu etkinliği açısından isteğe bağlı veya alternatif aşamalar arkasındaki mantık kaplıdır. Son olarak, temsilci veri teknikleri présente beklenen sonuçları göstermek için sunulmuşturBurada d.

Burada sunulan protokol geniş yalnızca küçük değişiklikler ile kültürlenen ve primer hücre örneklerinin çeşitli uygulanabilir. örneğin barkod veya hücre yüzeyi boyama gibi bazı elemanlar, gerekli olmadığında deney gereksinimlerine bağlı olarak, bir modüler şekilde gerçekleştirilebilir. bütünüyle Kullanılan bu protokol ölü hücre dışlama, S-fazı nüfus tanımlanması için etiketlenmiş ve 38 kadar, antikor hedefi ölçümü için boyanmış numunelerin...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis at JoVE.com

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

sample-preparation-for-mass-cytometry-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

16.0K Görüntüleme.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Video: Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Biyoloji

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Tek Virion Atomik Kuvvet Mikroskopisi ve Süper Çözünürlüklü Floresan Görüntüleme için Numune Hazırlama

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, especially cells in suspension such as hematopoietic stem cells (HSCs), remains limited due to the requirement of a high cell number during sample preparation. There are a few cytospin or monolayer approaches for TEM analysis from scarce samples, but these approaches fail to get significant quantitative data from the limited number of cells. Here, an alternative and novel approach for sample preparation in TEM studies is described for rare cell populations that enables quantitative analysis.
A relatively low cell number, i.e., 10,000 HSCs, was successfully used for TEM analysis compared to the millions of cells typically used for TEM studies. In particular, Evans blue staining was performed after paraformaldehyde-glutaraldehyde (PFA-GA) fixation to visualize the tiny cell pellet, which facilitated embedding in agarose. Clusters of numerous cells were observed in ultra-thin sections. The cells had a well preserved morphology, and the ultra-structural details of the Golgi complex and several mitochondria were visible. This efficient, easy and reproducible protocol allows sample preparation from a low cell number and can be used for qualitative and quantitative TEM analysis on rare cell populations from limited biological samples.

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM analizi için düşük Hücre sayısı ile örnek hazırlanması için alternatif bir yaklaşım

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

Stoma bantlı teyp-kabuğu: Guard hücre numune hazırlama için geliştirilmiş bir yöntem

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

Sample Preparation for Mass-spectrometry-based Proteomics Analysis of Ocular Microvessels

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly expanded our understanding of certain diseases. Mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as a powerful tool to unravel alterations in the molecular mechanisms and protein signaling pathways in the vascular beds in health and disease. However, sample preparation steps prior to MS analyses are crucial to obtain reproducible results and in-depth elucidation of the complex proteome. This is particularly important for preparation of ocular microvessels, where the amount of sample available for analyses is often limited and thus, poses a challenge for optimum protein extraction. This article endeavors to provide an efficient, rapid and robust protocol for sample preparation from an exemplary retrobulbar ocular vascular bed employing the porcine short posterior ciliary arteries. The present method focuses on protein extraction procedures from both the supernatant and pellet of the sample following homogenization, sample cleaning with centrifugal filter devices prior to one-dimensional gel electrophoresis and peptide purification steps for label-free quantification in a liquid chromatography-electrospray ionization-linear ion trap-Orbitrap MS system. Although this method has been developed specifically for proteomics analyses of ocular microvessels, we have also provided convincing evidence that it can also be readily employed for other tissue-based samples.

Proteome characterization of ocular microvascular beds is pivotal for in-depth understanding of many ocular pathologies in humans. This study demonstrates an effective, rapid, and robust method for protein extraction and sample preparation from small blood vessels employing the porcine short posterior ciliary arteries as model vessels for mass-spectrometry-based proteomics analyses.

Oküler yüzdeki kütle spektrometresi esaslı proteomik analiz için numune hazırlama

The use of isolated ocular blood vessels in vitro to decipher the pathophysiological state of the eye using advanced technological approaches has greatly ...

Sample Preparation for Metabolic Profiling using MALDI Mass Spectrometry Imaging

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to investigate the biological activities during development and diseases. Metabolomics approaches&#160;are widely employed in the study of cancer, nutrition/diet, diabetes, and other physiological and pathological conditions involving metabolic processes. An advantageous tool that aids in metabolomic profiling advocated in this paper is matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI). Its ability to detect metabolites in situ without labeling, structural modifications, or other specialized reagents, such as those used in immunostaining, makes MALDI MSI a unique tool in advancing methodologies relevant in the field of metabolomics. An appropriate sample preparation process is critical to yield optimal results and will be the focus of this paper.

The goal of this protocol is to provide detailed guidance on the sample preparation when planning for experiments using MALDI MSI to maximize metabolic and molecular detection in biological samples.

MALDI Kütle Spektrometresi Görüntüleme Kullanarak Metabolik Profilleme için Örnek Hazırlama

Metabolomics, the study to identify and quantify small molecules and metabolites present in an experimental sample, has emerged as an important tool to ...