Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).

<ol><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398(2012).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li>
<li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li>
<li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li>
<li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li>
<li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).</li>
<li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival%2Fproliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li>
<li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li>
<li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li>
<li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Measure+for+measure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li>
<li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li>
<li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-FISH%3A+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המובא כאן הועסק בהצלחה לעיבוד של שורות תאים בתרבית שונות (H1 ו- H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) ודגימות רקמה עיקריות (מח עצם עכבר, כבד עוברי בעכבר, מבוגר עכבר כבד, גידולי עכבר). בלי קשר למקור, כל הרקמות שניתן ניתק לתוך תאים בודדים תוך שמירה על מצב הסלולר צריך להיות מקובל ניתוח על ידי המוני cytometry, אולם לעתים יש צורך אופטימיזציה בפרוטוקול. חשוב לציין כי חלק האפיטופים עשוי להיות מושפע ניתוק הספציפי, טיפולי קיבעון permeabilization מנוצלים ושיטות אלה ייתכן שתהיינה צורך לעבור אופטימיזציה מדגם ספציפי. אם אות נמוכה שנצפתה עבור נוגדן ייתכן שניתן לשפר על ידי ביצוע תיוג תא שטח על תאי חיים, שינוי שיטות permeabilization, או לקצר את זמן קיבוע. במידת האפשר בתוך עיצוב ניסיוני, כולל ברקודים ב הזרימת עיבוד דואר מדגם מבטיחה עקבית בין דגימות ברמת ריכוז תא נוגדן. ללא barcoding, גם כאשר מקדישים תשומת לב רבה כדי לשלוט עיבוד מדגם, סביר להניח כי שינויים קלים ריכוז נוגדן וריכוז תא יושקו בין דגימות. יתר על כן, כפי אחוזי התא החיוביים עבור אפיטופים ספציפיים ישתנו כנראה בין דגימות, יחס נוגדנים ל-אפיטופ היעיל בהכרח שונה בין הדגימות גם אם ריכוז הנוגדן הכולל נשמר עקביות, שעשוי להגדיל את הסתירות מכתימות נוגדן. וריאציות אלה, תוך קטין בדרך כלל כאשר התבוננות ערוץ יחיד, יכולות להיות מורכבות מאוד בעת ביצוע ניסוי גבוה פרמטר ועלול להתפרש שלא כהלכה משמעות ביולוגית אם הטיפול אינו נלקח במהלך ניתוח נתונים. ניתוח הנתונים הנובעים מסה cytometry הניסוי יכול ללבוש צורות רבות, ומספר computaגישות תזונתיות הותאמו במיוחד עבור יישום זה. תוך מתן סקירה ממצה של אלגוריתמים שימושיים עבור המוני cytometry ניתוח נתונים הוא מעבר להיקף של כתב היד הזה, גישות כי כבר נוצלו בהצלחה מודגשות וקוראים מעוניינים מופנים משאבים מרובים העוסקים בנושא זה 21, 22, 23. שתי הגישות הזמינות כרגע, המועסק הנרחב ביותר לניתוח של המוני cytometry נתוני עץ פורשים התקדמות של צפיפות לנרמל אירועים (ספייד) ו viSNE. ספייד טפסי אשכולות מקבוצות של תאים עם ביטוי סמן דומה ומייצג כל אשכול כצומת. צמתים אלו מסודרות לתוך עץ ספייד שבו צומת דומים מחובר באמצעות קו (האיור 3G). viSNE מנצל השכן סטוכסטיים-מבוזרת t הטמעת האלגוריתם 24 כדי ליצור ייצוג דו ממדי שלהנתונים הגבוהים מימד תוך שמירה על מבנה נתונים הכולל. שניהם ספייד viSNE כתובים MATLAB, קוד המקור זמין באופן חופשי וניתן להפעלה על ידי משתמשים עם MATLAB. בנוסף, גרסה עצמאית של ספייד נגישה. בעוד cytometry מונית מתיר כיום אוסף של המספר הגבוה ביותר של פרמטרים, cytometry המבוסס תג פלורסנט עשוי להיות גישה טובה יותר עבור יישומים מסוימים. זרימת cytometry הקרינה יכולה לנתח יותר תאים לשנייה, עד 5 x 10 4 לעומת 500-1,000 עבור המוני cytometry, והוא זמין יותר תוקף נוגדנים 25. התקדמות נוספת בזרימת פלואורסצנטי cytometry, כגון היפר-ספקטרלית cytometry 26 ו fluorophores חדש זרימת פלואורסצנטי 27 איפור cytometry חלופה עבור כל הניסויים מלבד פרמטר גבוה מאוד. טכניקות נוספות כגון מדידת RNA 28 בעבר רק אפשריעל ידי זרימת קרינה מבוססת cytometry הותאם לאחרונה המוני cytometry המתיר זיהוי סימולטני של חלבון ו RNA 29. רחבה עתידית של זמין איזוטופים ריאגנטים ליותר לגמרי לנצל את החלון ההמוני של איזוטופים מדידים להרחיב את הרפרטואר של מאפייני הסלולר מדידים תרחיב את עומק פרופיל אפשרי על ידי המוני cytometry. המספר הרב של פרמטרים שעשויים להיות מנותח בו זמנית על ידי cytometry מסה מאוד מרחיב את השאלות הניסיוניות שניתן לחקור. אנו מקווים שמאמר זה פרוטוקול וידאו המלווה יאפשר לחוקרים המעוניינים ביעילות רבה יותר לנצל המונית cytometry לקדם את מחקריהם.

Cytometry מאפשרת מדידה בו זמנית של הנוגדן מכוון מרובים ברמה תא בודד באוכלוסיות גדולות של תאים. בשנת cytometry זרימת קרינה המבוססת מסורתית, מספר הפרמטרים שניתן לכמת מוגבל על ידי חפיפה ספקטרלית בין ספקטרום הפליטה של ​​fluorophores המרובה, אשר דורש חישובי פיצוי מורכבים יותר ויותר ככל שגדל מספר פרמטרים. מגבלות אלה מטופלות על ידי המוני cytometry, שבו נוגדנים כבדים מצומדות מתכת מזוהות לכמת ידי זמן של ספקטרומטריית מסת טיסה (TOF) כדי להרחיב את מספר הפרמטרים מאוד שנאספו בו זמנית להניב פרופיל חלבון-שפע ממדי גבוה עבור כל תא יחיד. הבנה בסיסית של פעולתו של המסה cytometry המכשיר מועילה המשתמש ועלולה להיות חיוני לפתרון בעיות. לקבלת תיאור מפורט יותר של כוונון והפעלה מכונית cytometry ההמונית,לראות את כתב יד 1 קשור. בקצרה, מדגם התא מסומן עם פאנל של נוגדנים מצומדות מתכת מיקוד סמנים פני התא, חלבונים ציטופלסמית, חלבונים גרעיניים, חלבונים או אפיטופים אחרים הנכנס הכרומטין של עניין (איור 1i). תאי שכותרתו נטענים על גבי המכונה, או אחד בכל פעם על ידי הזרקה ידנית או באמצעות autosampler כי דגימות צלחת 96-היטב. תאי טעון מוזרקים דרך nebulizer, אשר מייצר נתזי טיפות נוזל בבועה התאים (איור 1ii). ספריי זה ממוקמים כך התאים מיוננים על ידי לפיד פלזמת ארגון. יינון זה יוצר ענן חלקיקים מורכבים מכל אטומי המרכיבים של כל תא (1iii איור). כמו ענן החלקיקים הזה נוסע הגלאי, אטומי מסה אטומיים נמוכים מופרדים מן יוני מסה הגבוהים על ידי מסנן מונית quadrupole. יוני המסה הגבוהים הנותרים ממשיכים הגלאי, שבו abund<html> אהה של כל איזוטופ מכמתים (1iv איור). הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי הגלאי, מנותחים על ידי תוכנת מכשיר cytometry ההמונית לזהות אירועי תא. עבור כל אירוע התא מזוהה, האות זוהה בכל ערוץ כימות הציל לקובץ .fcs פלט. ערוצי המונית המשמשים לאיתור הנוגדנים כבד מתכת מצומדות להפגין חפיפה ספקטרלית מינימאלית, אשר נעה בין 0-4% עם רוב התרומות מתחת 1%. בגלל הצטלבות נמוכה זו בין ערוצים, זה בדרך כלל לא נחוץ להפוך את הנתונים עם מטריצת פיצויים לפני הניתוח 2. עם זאת, יש להיזהר בעת העיצוב של לוח ניסיוני של נוגדנים כדי להבטיח כי נוגדן עם אפיטופ גבוה שפע אינו מוקצה ערוץ מסה שתורם אות לערוץ מוקצה נוגדנים נמוך שפע, הכיוון שהדבר עלול ליצור אוכלוסייה גבוהה באופן מלאכותי באפיק קבלת תרומת האות. תחת = &quot;jove_content&quot;&gt; ההכנה המדויקת של דגימות עבור המוני cytometry ניתוח התלות גבוהה סוגי דגימות נאספות ואת ההשערה הניסיונית נבדקת. אנו מספקים דוגמאות של שני פרוטוקולי ניקיון סוגים שונים של תאים (תאי גזע עובריים אנושיים) תאים ראשוניים (לבודד תאי האפיתל גידול עכבר שד). כאשר מתחיל מחקר cytometry ההמוני, מומלץ לבצע תחילה ניסוי פיילוט קטן כדי להבטיח כי כל הפרוטוקולים והנוגדנים להיות מנוצלים פועלים כראוי בידי החוקר. הדבר נכון במיוחד כאשר חיוני נוגדנים מצומדות מותאם אישית כדי לשמש, כמו תגובת ההפחתה החלקית במהלך נטיית הנוגדן בעל הפוטנציאל לשבש זיקת נוגדן; ולכן, כל נוגדן מותאם אישית צריך להיות תוקף אמפירי כדי להבטיח דיוק הנתונים. שיקולים נוספים כוללים קביעה אם נוגדנים פני תא כדי להיות בשימוש assay יכירו האפיטופים שלהם לאחר קיבוע או אם הם neאד להיות מיושם לחיות תאים. חלק הקיבעון יכול למנוע צביעה נכונה עם נוגדנים פני תא כידוע להתרחש עם פפטיד-MHC מכתים 3, 4. Performing מכתים נוגדן תא השטח על תאים חיים עשוי להיות נחוץ עבור נוגדנים מסוימים, אבל זה מונע את האפשרות של barcoding לפני תיוג נוגדן כמו שיטות barcoding ביותר מבוצעות לאחר קיבוע 5 למרות barcoding מבוססי נוגדנים 6, 7 הוא חריג. בעת קביעת מספר התאים להיות מוכן לניתוח, חשוב לדעת כי רק חלק קטן של התאים הועמסו על המכונית יאותר ולהפיק נתונים. הפסד זה נובע בעיקר מחוסר יעילות כאשר nebulizer תרסיסים מדגם בבית לפיד. הפסד האחוז המדויק תלוי המסה cytometry התקנת מכונית וסוג התא אבל יכול לנוע בין 50-85% וצריך להיותבחשבון בעת ​​תכנון הניסוי. פרוטוקול זה ממוטב עבור 2x10 6 תאים לדגימה אך ניתן להתאים לעיבוד גודל מדגם קטן או גדול. פרוטוקול זה יכול לשמש עם שינויים מינימליים עבור גודל מדגם מ 1 x 10 6 4 x 10 6, אולם חשוב כי גודל המדגם להישמר עקבי במסגרת ניסוי. שינויים במספר תאים יכולים להשפיע על עוצמת מכתים barcoding נוגדנים צריך להישמר עקבי בערך ברחבי דגימות כדי להשוות ישירות. כמה נהלים, כגון תיוג תא מת תיוג DNA, צריכות להתבצע הרוב המכריע, אם כל העיצובים הניסיונות לא. התיוג של תאים מתים בניסויי ניתוח רק סמני משטח יכול להיות מושג באמצעות Rh103, אבל Rh103 יש להימנע עבור ניסויים שבם permeabilization נדרש כפי שהיא גורמת להפסד מכתים. בניסויים מעורבים permeabilization, מומלץ לנצל cisplatin <sעד class = &quot;Xref&quot;&gt; 8 ו, במידת האפשר, נוגדן הכרה PARP ביקע או ביקע caspase לזהות תאים אפופטוטיים מת. דגימות ברקודים יכולות להפחית את צריכת נוגדן, להקטין זמן רכישה ולחסל מדגם ל-מדגם 9 השתנות. תהליך barcoding כרוך החלת דוגמת קוד ספציפי וייחודי לכל התאים, אשר משמש להקצות לכל התא מדגם של מקורו. לאחר barcoding דגימות עשוי להיות ונקווה לפני מכתים נוגדן, תהליך המבטיח את כל דגימות מגואלות באותה מידה. כדי למזער שגיאות ניסיון, זה נבון ברקוד ומכניס כל דגימות כי יש להשוות ישירות זה לזה. נכון לעכשיו קיימות מספר שיטות barcoding דגימות עבור המוני ניתוח cytometry 5, 6, 7, שניים מהם מוצגים כאן (ראו להלן). עם Reagen זמין כרגעTS אפשר לכמת את השפע של 38 הנוגדן מכוון, לזהות תאים S-שלב 10, להבחין בין תאים חיים ומתים 8 ולמדוד רמות הסלולר של היפוקסיה 11 בניסוי מרובב של דגימות מרובות. יכולת זו כדי לאסוף נתונים סלולריים גבוה פרמטר אחד עבור אוכלוסיות תאים גדולות מאפשרת פרופיל משופר של אוכלוסיות תאים הטרוגנית מאוד וכבר הפיקה מספר תובנה ביולוגיות רומן 12, 13, 14, 15, 16. זיקוק הנתונים מורכבים והתוצאה למידע לפירוש דרש שימוש באלגוריתמים חישוביים כולל עץ פורש מהלך האירועים מנורמל צפיפות (ספייד) 17 ו viSNE 18. מאמר זה מציג נגישסקירה של איך לעצב ולבצע מסה cytometry הניסוי ומציג ניתוח בסיסי של המוני cytometry נתונים.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>Stem Cell technologies</td><td>05850</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Warm at 37&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Provided at 1&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>Cisplatin</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Soluble to 25&amp;nbsp;mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2&#039;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>Soluble to 74&amp;nbsp;mg/mL in 0.2&amp;nbsp;N NaOH</td></tr><tr><td>Rhodium 103 intercelating agent</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Chill at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL round bottom tubes</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &amp;#956;m filter cap tubes</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ four element calibration beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase Type I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpel #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation for mass cytometry analysis

Mass cytometry מנצל נוגדנים מצומדות עם תוויות מתכת כבדה, גישה הגדילה את מספר הפרמטרים וההזדמנויות לניתוח עמוק הרבה מעבר למה שאפשר להשיג עם זרימת קרינה המבוססת קונבנציונלית cytometry. כמו בכל טכנולוגיה חדשה, ישנם צעדים קריטיים המסייעים להבטיח את הדור האמין של נתונים איכותיים. אנו מציגים כאן פרוטוקול אופטימיזציה המשלב טכניקות מרובות לעיבוד דגימות תאים לניתוח cytometry ההמוני. השיטות שתוארו כאן תעזורנה למשתמש להימנע ממכשולים נפוצים להשיג תוצאות עקביות על ידי מזעור השתנות, מה שעלול להוביל נתונים לא מדויקים. כדי ליידע עיצוב ניסיוני, את הרציונל מאחורי צעדים אופציונליים או חלופה בפרוטוקול והיעילות שלהם בחשיפת ממצאים חדשים בתחום הביולוגיה של מערכת נחקרת מכוסית. לבסוף, הוא הציג נתוני נציג כדי להמחיש את תוצאות צפויות מן presente הטכניקותד כאן.

הפרוטוקול המובא כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב במגוון רחב של דגימות תאים בתרבית ראשוניות עם שינויים קלים בלבד. בהתאם לדרישות של הניסוי, זה יכול להתבצע באופן מודולרי כאשר אלמנטים מסוימים, כגון מכתים barcoding או תא שטח, אינם נחוצים. מנוצל במלואו פרוטוקול זה מאפשר הכנת ההמונית מרובבת cytometry הדגימות שכותרתו עבור הדרת תאים מתה, זיהוי אוכלוסיית S-שלב ומוכתם עבור כימות של עד 38 נוגדן מכוון. תוצאות צפויות מיוצרות על ידי השיטות המפורטים בפרוטוקול זה (איור 2) מתוארות באיור 3. לאחר איסוף נתונים, נורמליזציה של עוצמת אות המבוססת על עוצמת חרוז הכיול יכולה להתבצע בתוך תוכנת cytometry ההמונית. בעקבות נורמליזציה, proce נתונים ראשונייםssing להסיר חרוזי כיול, שער על תאים בודדים ולהסיר תאים מתים יכול להתבצע באופן ידני באמצעות כל תוכנה מסוגלת לנתח את זרימת cytometry נתונים. הסרת חרוזים כיול יכול להתבצע באופן ידני על ידי gating על האוכלוסייה Ir191 + Ce140- (איור 3A) או עם אלגוריתם המבוסס MATLAB 20. אירועי תא בודד (קו מתאר שחור, איור 3B) ניתן מגודרים תוך הסרת multiplets פסולת התא, על ידי gating על עלילת biaxial של Ir193 ואת אורך אירוע (איור 3B). תיוג ציספלטין של תאים מתים יכול להיות מנוצל כדי לכמת את כמות המוות של תאים; המוצגים הם דוגמאות של דגימות עם (3D איור) נמוך וגבוה (איור 3E) בכמויות של תאים מתים. תאים מתים ניתן להסיר את הנתונים על ידי gating את האוכלוסייה + Pt198 (איור 3E). ברקודים של דגימות, אם עם ריאגנטים ציספלטין או פלדיום monoisotopic, תוצאות הפרדה ברורה של samples בתוך פרמטרי barcoding (איור 3 ג), אשר מאפשרים לתאים יוקצה זהות המדגם המקורית שלהם. שיטות אופציונליות נוספות, כגון תיוג IdU, לאפשר זיהוי של אוכלוסיות ספציפיות, למשל, תאי S-שלב (איור 3F). בעקבות נורמליזציה, debarcoding ו gating הראשוניות, הנתונים הממדיים הגבוהים ניתן לנתח ניצול מגוון של אלגוריתמים כולל ספייד 17 ועוד כמה מיועדים מונית cytometry ניתוח נתונים להדמיה 18. אלגוריתמים כגון ספייד לקחת את הנתונים ממדיים הגבוהים, אשר יכול להיות קשה לפרש שכן לא ניתן דמיינו ישירות במצבו הגבוה ממדי, וליצור מצג ממדי נמוך של הנתונים, אשר הוא יותר מקובל הפרשנות חזותית (האיור 3G). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54394/54394fig1.jpg"/&gt; איור 1: עקרונות יסוד של המוני cytometry המדידה. הכנת דגימות תאים עבור המוני cytometry ניתוח כרוך תאים מכתימים עם נוגדנים שכותרתו עם איזוטופים מתכת בעיקר מסדרת lanthanide אלמנטים. לפי שיטה זו כל נוגדן העלה כנגד אפיטופ ספציפי מסומן עם איזוטופ בעל מסה אטומית ייחודית, כגון Samarium 154. נוגדנים כנגד אפיטופים כי הם משטח, ציטופלסמית, גרעיני או הכרומטין המקומי יכול לשמש באופן פוטנציאלי. תאי תווית מוזרקים והתפזרו ברחבי המונית cytometry nebulizer כמו טיפות תא בודדות שבו הם מיונן על ידי לפיד פלזמת ארגון. ענן החלקיקים כתוצאה משולל האטומים בעלי מסה נמוכות על ידי מסנן מונית quadrupole בעוד השפע של יוני מסה אטומיים גדולים נמדדים על ידי הגלאי. כמות המדודה של כל יון המוני ייחודי התואמת את שפע הסלולר של אפיטופ המטרה של הנוגדן שלו הקשור. בעוד l תיאורטיimit של מעל 100 פרמטרים שאפשר לכמת ניצול מתודולוגיה זו, ריאגנטים לאפשר זיהוי הנוכחיים הזמינים המסחרי של מעל 40 פרמטרים לכל תא. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54394/54394fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54394/54394fig2.jpg" /> איור 2: דיאגרמת זרימת העבודה של הליך ניסיוני וצעדים אופציונליים. תיאור של השלבים העיקריים המעורבים פרוטוקול הכנת תאים עבור cytometry ההמונית. שלבים אופציונליים מסומנים על ידי קופסאות תפוזים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54394/54394fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54394/54394fig3.jpg" /> איור 3: דוגמא נתונים המופקים מן התחת מ cytometry ניתוח. (א) העלילה Biaxial מראה את הפרדת תאים (גבוה Ir191, נמוך Ce140), חרוזים (נמוך Ir191, גבוה Ce140) ו כפילויות חרוז-תא (גבוה Ir191, גבוה Ce140). (ב) העלילה Biaxial מראה המראה הצפוי של Ir193 vs אורך האירוע. Gating של תאים בודדים אשר מסיר multiplets פסולת התא הסלולרי מוצג. (C) העלילה Biaxial מראה דוגמה לאור שני ערוצי המונית מן barcoding ציספלטין. (D - E) נתוני דוגמא מן cisplatin חי / מכתים מלח עבור דגימות עם אחוז נמוך (D) ואחוז גבוה (E) של תאים מתים. (F) עלילת Biaxial של תאי H9 hESC שכותרתו עם IdU להבחין תאי S-שלב ו נוגדן נגד B1 Cyclin להבחין מחזור תא נוסף. (G </stרונג&gt; העלילה N x N) של נתונים מתוך מסה 35 נוגדנים cytometry הניסוי של hESCs ועץ ספייד נציג בנוי מ סמנים חלבוניים צבעוניים על ידי שפע של אחד הפרמטרים הנמדדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54394/54394fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis at JoVE.com

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

sample-preparation-for-mass-cytometry-analysis

Universidad Científica del Sur

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center. This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.

Video: Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the issue of spectral overlap of fluorophore emissions has limited the number of simultaneous probes. In contrast, the new CyTOF mass cytometer by DVS Sciences couples a liquid single-cell introduction system to an ICP-MS.1 Rather than fluorophores, chelating polymers containing highly-enriched metal isotopes are coupled to antibodies or other specific probes.2-5 Because of the metal purity and mass resolution of the mass cytometer, there is no "spectral overlap" from neighboring isotopes, and therefore no need for compensation matrices. Additionally, due to the use of lanthanide metals, there is no biological background and therefore no equivalent of autofluorescence. With a mass window spanning atomic mass 103-203, theoretically up to 100 labels could be distinguished simultaneously. Currently, more than 35 channels are available using the chelating reagents available from DVS Sciences, allowing unprecedented dissection of the immunological profile of samples.6-7
Disadvantages to mass cytometry include the strict requirement for a separate metal isotope per probe (no equivalent of forward or side scatter), and the fact that it is a destructive technique (no possibility of sorting recovery). The current configuration of the mass cytometer also has a cell transmission rate of only ~25%, thus requiring a higher input number of cells.
Optimal daily performance of the mass cytometer requires several steps. The basic goal of the optimization is to maximize the measured signal intensity of the desired metal isotopes (M) while minimizing the formation of oxides (M+16) that will decrease the M signal intensity and interfere with any desired signal at M+16. The first step is to warm up the machine so a hot, stable ICP plasma has been established. Second, the settings for current and make-up gas flow rate must be optimized on a daily basis. During sample collection, the maximum cell event rate is limited by detector efficiency and processing speed to 1000 cells/sec. However, depending on the sample quality, a slower cell event rate (300-500 cells/sec) is usually desirable to allow better resolution between cells events and thus maximize intact singlets over doublets and debris. Finally, adequate cleaning of the machine at the end of the day helps minimize background signal due to free metal.

The steps necessary for daily tuning and optimization of the performance of a CyTOF mass cytometer are described. Comments on optimal sample preparation and flow rate are discussed

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

Bioengineering

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Developmental Biology

Collection, Isolation, and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Samples

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female genital tract (FGT). Because heterosexual transmission now represents the dominant mechanism of HIV transmission, and given the continual spread of sexually transmitted infections (STIs), it is critical to understand the interplay between host and pathogen at the genital mucosa. The substantial gaps in knowledge around FGT immunity are partially due to the difficulty in successfully collecting and processing mucosal samples. In order to facilitate studies with sufficient sample size, collection techniques must be minimally invasive and efficient. To this end, a protocol for the collection of cervical cytobrush samples and subsequent isolation of cervical mononuclear cells (CMC) has been optimized. Using ex vivo flow cytometry-based immunophenotyping, it is possible to accurately and reliably quantify CMC lymphocyte/monocyte population frequencies and phenotypes. This technique can be coupled with the collection of cervical-vaginal lavage (CVL), which contains soluble immune mediators including cytokines, chemokines and anti-proteases, all of which can be used to determine the anti- or pro-inflammatory environment in the vagina.

The use of cytobrush sampling to collect lymphocytes and monocytes from the endocervix is a minimally invasive technique that provides samples for analysis of female genital tract immunity. In this protocol, we describe the collection of cytobrush samples and immune cell isolation for flow cytometry assays.

אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

Despite the public health importance of mucosal pathogens (including HIV), relatively little is known about mucosal immunity, particularly at the female ...

Medicine

Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming &#34;units&#34; known as BFU-e and CFU-e. Until recently, methods for the direct prospective and complete isolation of pure BFU-e and CFU-e progenitors from freshly isolated adult mouse bone marrow were not available. To address this gap, a single-cell RNA-seq (scRNAseq) dataset of mouse bone marrow was analyzed for the expression of genes coding for cell surface markers. This analysis was combined with cell fate assays, allowing the development of a novel flow cytometric approach that identifies and allows the isolation of complete and pure subsets of BFU-e and CFU-e progenitors in mouse bone marrow or spleen. This approach also identifies other progenitor subsets, including subsets enriched for basophil/mast cell and megakaryocytic potentials. The method consists of labeling fresh bone marrow or spleen cells with antibodies directed at Kit and CD55. Progenitors that express both these markers are then subdivided into five principal populations. Population 1 (P1 or CFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71med/high) contains all of the CFU-e progenitors and may be further subdivided into P1-low (CD71med CD150high) and P1-hi (CD71high CD150low), corresponding to early and late CFU-e, respectively; Population 2 (P2 or BFU-e, Kit+ CD55+ CD49fmed/low CD105med/high CD71low CD150high) contains all of the BFU-e progenitors; Population P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150low CD41low) is enriched for basophil/mast cell progenitors; Population 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41+) is enriched for megakaryocytic progenitors; and Population 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49fmed/high CD105med/low CD150high CD41-) contains progenitors with erythroid, basophil/mast cell, and megakaryocytic potential (EBMP) and erythroid/ megakaryocytic/ basophil-biased multipotential progenitors (MPPs). This novel approach allows greater precision when analyzing erythroid and other hematopoietic progenitors and also allows for reference to transcriptome information for each flow cytometrically defined population.

Here, we describe a novel flow cytometric method for prospective isolation of early burst-forming unit erythroid (BFU-e) and colony-forming unit erythroid (CFU-e) progenitors directly from fresh mouse bone marrow and spleen. This protocol, developed based on single-cell transcriptomic data, is the first to isolate all the tissue's erythroid progenitors with high purity.

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

Early erythroid progenitors were originally defined by their colony-forming potential in vitro and classified into burst-forming and colony-forming ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Immunology and Infection

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

מחקרים מטבוליים בעלי קלט נמוך בסוגי תאים של עכברים

Targeted Metabolomics on Rare Primary Cells

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule intermediates. However, obtaining accurate and reliable measurements of cellular metabolism, particularly in rare cell types like hematopoietic stem cells, has traditionally required pooling cells from multiple animals. A protocol now enables researchers to measure metabolites in rare cell types using only one mouse per sample while generating multiple replicates for more abundant cell types. This reduces the number of animals that are required for a given project. The protocol presented here involves several key differences over traditional metabolomics protocols, such as using 5 g/L NaCl as a sheath fluid, sorting directly into acetonitrile, and utilizing targeted quantification with rigorous use of internal standards, allowing for more accurate and comprehensive measurements of cellular metabolism. Despite the time required for the isolation of single cells, fluorescent staining, and sorting, the protocol can preserve differences among cell types and drug treatments to a large extent.

מחבר זרקור: קידום ניתוח מטבולומיקה של תאי גזע המטופויטיים נדירים 

Here, we present a protocol to accurately and reliably measure metabolites in rare cell types. Technical improvements, including a modified sheath fluid for cell sorting and the generation of relevant blank samples, enable a comprehensive quantification of metabolites with an input of only 5000 cells per sample.

מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

Cellular function critically depends on metabolism, and the function of the underlying metabolic networks can be studied by measuring small molecule ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

Summary

Explore More Videos

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

אוסף, בידוד, וניתוח תזרים cytometric של דוגמאות האנדוצרוויקאלית אדם

זיהוי ובידוד של יחידה יוצרת פרץ ויחידה יוצרת מושבה אבות אריתרואידים מרקמת עכבר על ידי ציטומטריה של זרימה

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

מטבולומיקה ממוקדת על תאים ראשוניים נדירים

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,