Chandran Sabanayagam sistemi, Joshua mikroakışkan cihaz tasarımı ile ilgili öneri ve kurulum işleme parçaları için Harvard Üniversitesi Rowland Enstitüsü personel Edel gelişmekte olan yardımlarından dolayı teşekkür ederiz. UIUC faydalı bilgiler için yararlı Rowland Enstitüsü ve Boston Üniversitesi&#39;nde Meller grup, üyeleri ile tartışmalar, T. Ha &#39;grubu üyeleri ve kabul etmiş sayılırsınız. Son olarak, Ulusal Bilim Vakfı (FİZ-0.701.207) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü (GM075893) mali destek için teşekkür ederiz.

1 - mikroakışkan hücre Montaj Mikroakışkan hücre eritme tarafından yapılan bir desenli, taze temizlenmiş kuvars kapak kayma için 2 mm kalınlığında, polidimetilsiloksan (PDMS) disk. PDMS disk tampon kontrollü akışı için, sırasıyla, bir tampon rezervuar ve bir enjektör pompası bağlı giriş ve çıkış esnek kılcal damarlar tarafından erişilen dört 30 ul dikdörtgen odaları içerir. Akış hücresi arka tarafında bir cam pencere tarafından desteklenen ve ısısını düzenlemek için su soğutmalı bir termoelektrik unsuru içeren bir ölçüye göre hücre sahibi üzerine yerleştirilir. <ol><li> Desenli PDMS diski yapmak için, 1 kısım sertleştirici ile 10 parça silikon elastomer baz karışımı, iyice karıştırın ve 1 saat vakum gaz alma terk. </li><li> Mikroakışkan hücre kalıp üzerine elastomer karışımı yavaşça dökün. Bizim durumumuzda, bu negatif fotorezist yapılan dört şeritler (1x10 4 x 1x10 3 x 300 mm) 1 &quot;silikon gofret 70 sıcak bir plaka üzerinde tedavisi için bırakın ° C iki saat boyunca. </li><li> Bir jilet kullanarak kalıp tedavi PDMS disk dikkatlice soyulur. 30 saniye boyunca iki yüzeyine oksitleyici plazma 1&#39;&#39;cam pencere (kanalların her iki uçta da 8 x 2 mm çaplı ön delikler içeren) üzerine disk Sigorta. Sigorta PDMS disk düz yüzüne cam pencereler (kanalları içermeyen tarafı). </li><li> 2-inç uzunluğunda esnek erimiş silika kapiler boru kanal ulaşıncaya kadar her bir cam pencere delikten takın. Ilk önce bir iğne takma ve sonra aşağıdaki ile kılcal bu süreci kolaylaştırabilir. Kwik-Cast gibi hızlı bir kür silikon döküm bileşik kullanarak cam pencere delikleri Seal. </li><li> Etanol ve su ile durulayın kanallar, ve 30 saniye süreyle taze temizlenmiş, 1-inç dairesel kuvars kapak kayma ile birlikte hücre plazma etkinleştirin. Biz piranha kullanarak bu kapağın kayma temizlik öneririz *. Odaları, sızdırmazlık kanalları içeren hücre yan kapak kayma Sigorta. </li><li> Oda sıcaklığında gece boyunca tedavi etmek için birleştirilmiş hücre bırakın. </li></ol> * Piranha H 2 O 2 ve H 2 SO 4 1:2.5 oranlarda bir çözümdür. Kapak fişleri temizlemek için, 90 piranha onları batırmayın ° C, 20 dk. 2 molekül immobilizasyon için yüzey aktif hale getirme Nükleik asit çalışmalar için, en basit yüzey immobilizasyon şeması ilk kaplama cam veya biotinlenmiş sığır serum albumin ve (BSA) sonra streptavidin kuvars kapak kayma oluşur. Bu biotinlenmiş örnek, gün boyunca oda sıcaklığında yüksek özgüllük ile immobilize olanak sağlar. <ol><li> Esnek borular kolay tampon enjeksiyon için bir şırınga ve iğne kullanılarak kılcal bağlayın. </li><li> 0.1 mg / ml tampon biotinlenmiş BSA bir çözüm enjekte A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 0.02 mikron filtre kullanarak filtre) kanal ve en az 30 dakika süreyle inkübe. </li><li> Akış 300-500 ul tampon bir odanın içinde herhangi bir hava kabarcığı yakalamak için dikkatli olmak, kanalın herhangi bir ücretsiz biotinlenmiş BSA kaldırmak için. </li><li> 0.1 bir çözüm enjekte streptavidin buffer mg / ml ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra Adım 3 tekrarlayın. </li><li> 3-5 pM biotinlenmiş örnek bir çözüm akmaya. Floresan moleküllerin kapsama kontrol etmek için bir yüzey taraması yapın. Gerekirse, daha iyi kapsama alanı elde etmek için numune konsantrasyonu artırır. 10 dakika boyunca inkübe ve Adım 3 tekrarlayın. </li></ol> Mikroakışkan hücre optik olarak kodlanmış DC motorları kullanılarak kaba (25 mm) hareket sağlayan bir motorlu xy sahne üzerine monte edilmiş ve iki kapalı döngü piezo aktüatörler kullanılarak ince (1 nm) hareket (Physik Instrumente modeli M-014 veya benzeri). Bu, önce ya da örnek immobilizasyon için yüzey aktive sonra yapılabilir. 3 - Görüntüleme Buffer (IB) hazırlanması IB gibi Trolox gibi bir enzimatik oksijen süpürücü sistemi ve bir üçlü söndürücü oluşur. IB sürekli bir gecede kızarmış olduğundan, en az 10 ml önceden hazırlanmış olmalıdır. <ol><li> 10 ml% 0.8 w / v D-glukoz, en az 35 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 50 mM NaCl deiyonize su hazırlayın. Tampon yüksek konsantrasyonda iki nedenden ötürü önemlidir: Trolox çözme çözüm asitlenir ve enzimatik reaksiyon da zaman içinde çözüm pH değerini düşürecektir. Bu çözüm, uzun bir raf ömrüne sahiptir bu yana bir stok solüsyonu olarak saklanabilir. </li><li> Adım 1 birkaç dakika karıştırın ve daha sonra&gt; 10 dakika için sallayarak tarafından hazırlanan tampon Trolox 5 mg eritin. Trolox pH&gt; 7 suda çok çözünür değildir, bu nedenle bu adımı acele etmiyoruz. Filtre 0.2 mikron filtre ve 10 dakika boyunca vakum gaz alma terk kullanarak çözüm. </li><li> 60 ul Wate karıştırma &quot;gloxy&quot; enzimatik çözüm hazırlayınr, 5X tampon, katalaz 20 ul, 1 mg glukoz oksidaz ve 10 ul 100 mg / ml BSA 20 ul. 0.22 mikron santrifüj filtre kullanarak çözüm Filtre. </li><li> Adım 2 Adım 3 hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek &quot;gloxy&quot; çözümü ile tampon yavaşça karıştırınız. </li><li> 5 ul / dak akış hızı kontrol etmek için mekanik bir şırınga pompası kullanarak sabit bir oranda kanalı ile IB Akış. Tampona yeniden çözünmesi atmosferik oksijenin önlemek için IB rezervuar içine Bubble argon gazı. </li></ol> Yüzey tarama, tek bir molekül yoğunluğu izleri molekül yerelleştirme ve satın alma, otomatik veri toplama 1 izin veren bir LabView programı tarafından kontrol edilir . Program, 0.1 mm / ms oranı ile 0.2 mikron çözünürlüğü 20x20 mikron 2 alanları tarar. Veri yoğunluğu ağırlıklı yerlerde arka plan sayıları her şeyden piksel verim hemen işlenir. Immobilize molekülleri bulundu sonra, konfokal hacmi ve donör ve alıcı fluorofor şiddetleri içine tek tek, hem de fluorophores photobleach kadar zamanın bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir taşınır. Sahne daha sonra 100 mikron uzaklıkta yeni bir kökeni geçmek için programlanmış ve tarama işlemi tekrarlanır. 4 - Temsilci Sonuçlar Aşağıda yüzey aktivasyonu öncesi ve molekül immobilizasyon için hazır mikroskop üzerine monte sonra monte mikroakışkan hücre gösteren bazı görüntülerin. Kanal başarıyla aktifse, yüzey taramaları doğrudan bağış uyarma sonra donör boya (yeşil) ve alıcı (kırmızı) gösteren emisyon aşağıda tasvir taramaları benzer olmalıdır. Bu moleküller tek tek problama hacmi içine taşınır ve floresan hem boyalar photobleach kadar zaman içinde kaydedilir, tek bir molekülün izleri görüldüğü gibi. Bu gibi izlerini, biyolojik ilgi moleküllerin yapısı ve dinamiği keşfetmek için kullanılan anlık donör-alıcı ayırma hakkında bilgi FRET verimliliği elde edebilirsiniz. <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig1tmb.jpg" alt="Şekil 1" border="0" /> Şekil 1: Dört kanal ile mikroakışkan hücre, her giriş / çıkış kılcal damarlar ile. Lütfen Şekil 1&#39;de bir büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig1.jpg">buraya tıklayınız</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig2tmb.jpg" alt="Şekil 2" border="0" /> Şekil 2: Hücre ölçümler için hazır mikroskop üzerine monte. Lütfen Şekil 2&#39;de büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig2.jpg">buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig3tmb.jpg" alt="Şekil 3" border="0" /> Şekil 3: sm-FRET ölçümler için Kurulum. Lütfen Şekil 3 büyük halini görmek için <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig3.jpg">buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig4tmb.jpg" alt="Şekil 4" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig5tmb.jpg" alt="Şekil 5" border="0" /> Şekil 4 ve 5: Kırmızı ve yeşil kanal hareketsiz bir yüzey taraması yeşil lazer ile heyecan molekülleri FRET. Daha büyük bir sürümünü görmek için tıklayınız <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig4.jpg">Şekil 4</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig5.jpg">Şekil 5</a> . <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig6tmb.jpg" alt="Şekil 6" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig7tmb.jpg" alt="Şekil 7" border="0" /> <img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig8tmb.jpg" alt="Şekil 8" border="0" /><img src="/files/ftp_upload/1542/1542fig9tmb.jpg" alt="Şekil 9" border="0" /> Şekil 6, 7, 8 ve 9: Yoğunluk yörüngeleri donör (yeşil) ve bir DNA molekülünün 8, 10, 16 ve 18 basepairs ayrı etiketli alıcı (kırmızı) fluorophores. Daha büyük halini görmek için tıklayınız <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig6.jpg">Şekil 6</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig7.jpg">Şekil 7</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig8.jpg">Şekil 8</a> , <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1542/1542fig9.jpg">Şekil 9</a> .

<ol>
	<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Molecule+Techniques,+a+Laboratory+Manual.">Single-Molecule Techniques, a Laboratory Manual.</a> CSHL Press. , (2008).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scanning+confocal+microscope+for+single+molecule+analysis.">High-throughput scanning confocal microscope for single molecule analysis.</a> Applied Pys. Letters. , 84-87 (2004).</li><li>Sabanayagam, C. R., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Fluorescence+resonance+energy+transfer+to+measure+distances+along+individual+DNA+molecules:+Corrections+due+to+nonideal+transfer.">Using Fluorescence resonance energy transfer to measure distances along individual DNA molecules: Corrections due to nonideal transfer.</a> J. Chem. Phys. 122, 61103-61105 (2004).</li><li>Echeverra, A., Aitken, C., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single+molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immobilization+in+Surface-Tethered+Lipid+Vesicles+as+a+New+Tool+for+Single+Biomolecule+Spectroscopy.">Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy.</a> J. Phys. Chem. 105, 12165-12170 (2001).</li><li>Di Fiori, N., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Article in preparation. , .</li></ol>

Yukarıdaki protokol ve boyalar (TMR ve ATTO647N) belirli bir seçim sistemi için optimize edilmiş olmasına rağmen, sadece ispat yöntemi anlamına gelir. Son zamanlarda, protocatechuic asit (PCA) / ​​protocatechuate-3 ,4-dioxygenase (PSD) oluşan alternatif bir oksijen temizleyici sistem belirli boyalar 4 fotostabilite artırdığı gösterilmiştir. Aynı şekilde, bu, özellikle Cy5 5, bazı boyaların uzun süreli yanıp sönen bastırmak olmasa da, β-mercaptoethanol (BME) gibi diğer üçlü-devlet quenchers yerine Trolox olabilir. (BSA), biotin streptavidin biotinlenmiş sığır serum albümini ile immobilizasyon nükleik asitlerin çalışmalar için tercih ediliyor olsa da, non-spesifik yapışma 1 önler, polietilen glikol (PEG) kaplı yüzey proteinlerin çalışmalar için daha uygundur. Ayrıca, alt-kırınım sınırlı boyutu veziküller yüzey etkileşimleri 6 etkilenebilir durumda faiz biyomolekülün kapsülleyen kullanılabilir. Bu yazıda, floresan izlerini elde etmek için silikon çığ fotodiyotlar ile donatılmış bir konfokal kurulum kullandık. Bu protokol, CCD kamera ile donatılmıştır Toplam İç Yansıma Floresan mikroskoplar (TIRF) ile eşit derecede iyi çalışır. Mikroskopi ne olursa olsun, donör ve alıcı sinyali düzgün 7 düzeltilir angström yaklaşan mekansal çözünürlüklerde bilgilendirmek sm- FRET.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>TSP150375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fused silica cover slip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Esco Products</td>
<td>R425000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Diba Industries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A8549</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A9085</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>0021122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 Elastomer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DowCorning</td>
<td>3097366-1004</td>
<td>Silicone Elastomer Kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aldrich</td>
<td>238813</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catalase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C3155</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glucose Oxidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G2133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7528</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kwik-Cast Sealant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>Kwik-Cast</td>
<td>Silicone Casting Compound</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules

Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) mikroskobu yaygın nükleik asitler ve proteinler gibi biyolojik ilgi moleküllerin yapısı ve dinamiği incelemek için kullanılır olmuştur. (Sm-FRET) immobilize molekülleri ölçümleri tek bir molekül FRET uzun gözlemler izin sisteminin etkin bir şekilde hem boyalar zaman izleri photobleach sonuçlanan kadar milisaniyeden zaman ölçekleri dakikaya kadar geniş bir yelpazede ile biyomoleküler dinamikleri üzerinde rapor. Istatistiksel analizler için izleri çok sayıda satın alma kolaylaştırmak için, süreci otomatik olmalıdır ve örnek ortamında tüm ölçüm süresi (~ 12 saat) üzerinden sıkıca kontrol edilmelidir. Bu sorgulama gecede binlerce tek moleküllerin sağlayan bir otomatik tarama konfokal mikroskop ve sınırlı oksijen içeriği ile tampon kontrollü döviz izin verir ve tüm ölçüm süresi boyunca sabit bir sıcaklıkta korur mikroakışkan hücre kullanılarak yapılır. Burada mikroakışkan cihaz monte etmek için nasıl ve DNA immobilizasyon için yüzey aktif hale getirmek için nasıl göstermektedir. Sonra biz bir tampon fluorophores fotostabilite ve ömrünü en üst düzeye çıkarmak için nasıl hazırlanacağını açıklar. Son olarak, zamana bağımlı tek bir molekülün otomatik edinimi için kurulum hazırlanmasında yer alan adımları DNA moleküllerinin izlerini FRET göstermektedir.

Watch this Scientific Journal Video about Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules at JoVE.com

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

automated-system-for-single-molecule-fluorescence-measurements

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Görüntüleme.  Boston University. Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Video: Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Biyoloji

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the last decade. The investigation of molecular interactions with high temporal and spatial resolutions deep within cells has remained challenging due to the inherently weak signals arising from individual molecules. Recent works by Yang et al. demonstrated that narrow-field epifluorescence microscopy allows visualization of nucleocytoplasmic transport at the single molecule level. By the single molecule approach, important kinetics, such as nuclear transport time and efficiency, for signal-dependent and independent cargo molecules have been obtained. Here we described a protocol for the methodological approach with an improved spatiotemporal resolution of 0.4 ms and 12 nm. The improved resolution enabled us to capture transient active transport and passive diffusion events through the nuclear pore complexes (NPC) in semi-intact cells. We expect this method to be used in elucidating other binding and trafficking events within cells.

Single molecule microscopy approch provided novel insights into nuclear transport.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

The utility of single molecule fluorescence microscopy approaches has been proven to be of a great avail in understanding biological reactions over the ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in &#181;Manager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

We present an open source high content analysis (HCA) instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) based readouts. Data acquisition for this openFLIM-HCA instrument is controlled by software written in &#181;Manager and data analysis is undertaken in FLIMfit.

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell motility, or cell signaling. The green algae Chlamydomonas reinhardtii has proven to be an insightful model in the study of centriole architecture, function, and protein composition. Despite great advances toward understanding centriolar architecture, one of the current challenges is to determine the precise localization of centriolar components within structural regions of the centriole in order to better understand their role in centriole biogenesis. A major limitation lies in the resolution of fluorescence microscopy, which complicates the interpretation of protein localization in this organelle with dimensions close to the diffraction limit. To tackle this question, we are providing a method to purify and image a large number of C. reinhardtii centrioles with different orientations using super-resolution microscopy. This technique allows further processing of data through fluorescent single-particle averaging (Fluo-SPA) owing to the large number of centrioles acquired. Fluo-SPA generates averages of stained C. reinhardtii centrioles in different orientations, thus facilitating the localization of distinct proteins in centriolar sub-regions. Importantly, this method can be applied to image centrioles from other species or other large macromolecular assemblies.

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

We have developed a strategy to purify and image a large number of centrioles in different orientations amenable for super-resolution microscopy and single-particle averaging.

Yalıtım ve floresan görüntüleme Chlamydomonas Centrioles tek-parçacık yeniden inşası için

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing the innate cellular fluorescence signature from each individual live cell in a population distributed in a three-dimensional (3D) space. The innate fluorescence signature of a cell is a collection of fluorescence signals emitted by various biomolecules within the cell. Previous studies established that innate fluorescence signatures reflect various cellular properties and differences in physiological status and are a rich source of information for cell characterization and identification. Innate fluorescence signatures have been traditionally analyzed at the population level, necessitating a clonal culture, but not at the single-cell level. CRIF is particularly suitable for studies that require 3D resolution and/or selective extraction of fluorescence signals from individual cells. Because the fluorescence signature is an innate property of a cell, CRIF is also suitable for tag-free prediction of the type and/or physiological status of intact and single cells. This method may be a powerful tool for streamlined cell analysis, where the phenotype of each single cell in a heterogenous population can be directly assessed by its autofluorescence signature under a microscope without cell tagging.

Here, a protocol is presented for optically extracting and cataloging innate cellular fluorescence signatures (i.e., cellular autofluorescence) from every individual live cell distributed in a three-dimensional space. This method is suitable for studying the innate fluorescence signature of diverse biological systems at a single-cell resolution, including cells from bacteria, fungi, yeasts, plants, and animals.

Tek Hücreli Doğuştan Gelen Floresan İmzalarının Konfokal Mikroskopi ile Yeniden Yapılandırılması

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable of measuring SSDC in many single DNA molecules simultaneously. Bead-tethered substrate DNAs, each containing a single copy of the target sequence, are prepared in a microfluidic flow channel. An external magnet applies a weak force to the paramagnetic beads. The integrity of up to 1,000 individual DNAs can be monitored by visualizing the microbeads under darkfield imaging using a wide-field, low magnification objective. Injecting of a restriction endonuclease, NdeI, initiates the cleavage reaction. Video microscopy is used to record the exact moment of each DNA cleavage by observing the frame in which the associated bead moves up and out of the focal plane of the objective. Frame-by-frame bead counting quantifies the reaction, and an exponential fit determines the reaction rate. This method allows collection of quantitative and statistically significant data on single molecule SSDC reactions in a single experiment.

A highly parallel method for measuring the site-specific cleavage of DNA at the single molecule level is described. This protocol demonstrates the technique using the restriction endonuclease NdeI. The method can easily be modified to study any process that results in site-specific DNA cleavage.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...