Yüzeye bağlı problar kullanılarak yapılan tek moleküllü FRET deneyleri, geçmişte neredeyse sadece hareketsiz moleküller üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, birçok biyomolekül yayılır ve yöntemimizle analiz edilebilir. Tek moleküllü FRET'i izleme ile birleştirmek, hareketli probların sadece FRET eksiklik zaman izlerini analiz etmeyi değil, aynı zamanda difüzyon davranışı gibi mekansal yönleri de araştırmayı mümkün kılar.
Yöntemimiz çeşitli FRET tabanlı problarla uyumludur. Örneğin, canlı hücre deneylerinde moleküler kuvvetler, konformasyonsal dinamikler ve bağlayıcı kinetikler hakkında içgörüler sağlayabilir. Yüksek kaliteli tek moleküllü FRET deneylerinin gerçekleştirilmesi oldukça zordur.
Güvenilir niceleme için, verilerin iyi bir sinyal-gürültü oranında ve yeterli uzunlukta tek moleküllü parçalarda kaydedilmesi önemlidir. Örnek ölçümüne başlamak için, kamerayı tetiklerken uygun bir aydınlatma süresi için donör ve alıcı floroforlarını heyecanlandırın ve kamera okuması etkinleştirilene kadar bekleyin. Donör ve kabul eden floroforların ekscitasyonunu alternatif olarak tekrarlayın.
Tek moleküllü sinyalleri agregalardan ayırt etmek için adım adım fotobleaching analizine izin veren görüş alanında prob başına en az bir floroforun fotobleachingini sağlayacak kadar büyük olacak tekrar sayısını seçin. Donör ve alıcı heyecanlandırma karelerinin yanı sıra kaydedilen görüntü dizilerinden görüntü segmentasyonu için çerçevelerin seçilmesine izin vermek için aydınlatma sırasını belirtin. Aynı zamanda, aynı aydınlatma ayarlarını kullanarak kaydedilen veri kümelerini analiz edin.
Bu amaçla, her veri kümesine ilgili görüntü sırası dosya adlarıyla eşleşen bir tanımlayıcı ve desen atayın. Ayrıca, görüntü kaydı için fiducial işaretleyicilerin kayıtları, düz alan düzeltmesi için heyecan ışığı profilleri ve düzeltme faktörlerini belirlemek için isteğe bağlı olarak yalnızca donör ve yalnızca alıcı örnekleri gibi özel amaçlar için belirli veri kümeleri tanımlayın. Ardından, her iki kanal da tek bir kamera kullanılarak kaydedilmişse emisyon kanallarını ve ham görüntüleri seçin.
Bunun için, donör ve kabul eden emisyon için uygun bölgeleri seçmek için uygun grafik widget'ını kullanın, ardından her iki emisyon kanalında da fiducial işaretleyicileri yerelleştirin ve görüntü kaydı gerçekleştirin. Hem donör hem de kabul eden emisyon kanalları için yerelleştirme algoritması için uygun parametreleri bulmak üzere sağlanan kullanıcı arabirimini kullanın. Daha sonra, donör ve alıcı emisyonlarından elde edilen görüntülerin toplamında donör ekscitasyonu üzerine FRET probları için tek moleküllü lokalizasyon parametrelerini ayarlayın, ardından alıcı emisyon kanalında alıcı çıkarma üzerine problar için yerelleştirme parametrelerini ayarlayın.
FRET problarını donör ve alıcı çıkarma üzerine tüm çerçevelerde bağımsız olarak yerelleştirin. Sonuçlar, özgün çerçeve numarasını, iki boyutlu koordinatları ve kaynak görüntü dosyasına başvuran bir tanımlayıcıyı içeren tek bir tabloda birleştirilir. Floresan yoğunluğunu izlemek ve ölçmek için Trackpy algoritmasının FRET prob yerelleştirmelerini yörüngelere bağlaması için uygun seçenekleri belirleyin.
Ardından, analiz yazılımı işlevselliğini kullanarak, görüntü dizilerinden yardımcı görüntü verilerini işleyin. Heyecanlandırma dizisinde S ile işaretlenmiş segmentasyonu kolaylaştırmak için kaydedilen ek görüntüleri ayıklayın. Son olarak, yoğun etiketli bir örnekte kaydedilen görüntülerden görüş alanındaki donör ve alıcı çıkarma ışığı profillerini belirleyin.
İlk filtreleme adımları için, floresan yoğunluklarını güvenilir bir şekilde belirlemek zor olduğundan, çakışan nokta yayılma işlevlerine sahip sinyalleri atın. Ev dışı aydınlatma durumunda, iyi sinyal-gürültü oranı sağlamak için yalnızca görüş alanındaki iyi aydınlatılmış bölgelerde bulunan sinyalleri kabul edin. Intramoleküler FRET'i inceliyorsanız, analizi görüntü dizisinin başlangıcından itibaren mevcut olan yörüngelerle sınırlayın.
Daha sonra, inhomojen aydınlatmanın neden olduğu konuma bağlı floresan yoğunluğu varyasyonlarını tersine çevirmek için daha önce elde edilen heyecan verici ışık kaynağı profillerini kullanan düz alan düzeltmesini yürütün, ardından görünür FRET verimliliğini ve görünür stoichiometry'yi hesaplanın. Tek moleküler problar ve agregalar arasında ayrım yapmak için fotobleachingin adım adım analizini yapmak için, donör ve alıcı ekscitasyonu üzerine değişiklik noktası algılama algoritması için uygun parametreleri bağımsız olarak bulun. Ardından değişiklik noktası algılama algoritmasını çalıştırın.
Belirsiz fotobleaching davranışını gösteren parçayı kaldırmak için, aşağıda bir floroforun ağartılmış olarak kabul edildiği yoğunluk eşiklerini tanımlayın ve aşağıdaki seçeneklerden birini seçin. Birinci seçenek, alıcı floroforun tek bir adımda ağarttığı ve donörün kısmi ağartma gösterdiği yerdir. İkinci seçenek, donörün tek bir adımda ağarttığı, kısmi kabul edici ağartma olmadığı yer.
Üçüncü seçenek, floroforun tek bir adımda ağarttığı, diğerinin ise kısmen ağarttığı yerdir. Ve dördüncü seçenek, donör ve kabul eden floroforların tek adımlı fotobleaching gösterdiği veya hiç fotobleaching göstermediği yer. Daha sonra bağışçı emisyonu sızıntısı için düzeltme faktörlerini alıcı kanala, doğrudan kabul edenin çıkarılması, algılama verimlilikleri ve heyecan verici verimlilikleri hesaplayın.
Daha sonra, FRET verimliliğini belirgin verimlilikten ve stoichiometry'den belirgin stoichiometry'den hesaplamak için düzeltme faktörlerini kullanın. Daha fazla filtreleme için, her yörüngedeki ilk ağartma olayından önce yalnızca veri noktalarını seçin. Ayrıca, analizi tek moleküllü problarla sınırlamak için, yalnızca uygun stoichiometry sınırları içinde veri noktalarının en az% 75'ine sahip yörüngeleri kabul edin.
Ardından, analizi görünüm alanındaki farklı bölgelerle sınırlamak için uygun yardımcı görüntülerde genel veya uyarlanabilir eşikleme yöntemleriyle görüntü segmentasyonu gerçekleştirin. Yanlış stoichiometry sinyallerinin doğru şekilde tanımlandığını ve kaldırıldığını doğrulamak için stoichiometry çizimlerine karşı verimlilik oluşturun. Daha sonra FRET verimlilik dağılımlarına iyi bir genel bakış sağlamak için FRET verimlilik histogramlarını çizin ve farklı deneylerden elde edilen sonuçların uygun karşılaştırması için histogramları gruplandırın.
Bilimsel Python kitaplıklarından yararlanarak, not defteri içindeki verileri daha fazla değerlendirmek, örneğin difüzyon analizi yapmak mümkündür. Tek moleküllü FRET olayının görselleştirilmesi ve izlenmesi burada gösterilmiştir. Filtrelenmiş FRET olayları, FRET verimlilik histogramındaki stoichiometry arazilerine karşı verimlilikle temsil edilir.
Ayrıca, hareketlilik parametreleri bir XY arsasında veya ortalama bir kare yer değiştirme grafiğinde tek bir yörünge yolu çizilerek araştırılabilir. Platformumuzun çıktısı, mobil probların FRET verimlilik süresi izlemelerindeki geçişleri daha fazla tanımlamamızı sağlar. Örneğin, biyomoleküllerin konformasyonel değişikliklerini değerlendirmek için.
FRET tabanlı bir kuvvet sensörü kullanarak, analiz platformu erken T hücre sinyali sırasında immünolojik sinaps içindeki tek moleküllü kuvvet olaylarını ölçmemize izin verdi.
