Yöntemimiz aksi takdirde hipokampus gibi Vivo görüntü zor olurdu yapılarda bulunan kan damarlarının çalışma sağlar. Kan damarları beyin dokusundan çıkarıldığı için, kılcal damarlar ve arteriyol arasındaki sinyal, çevredeki doku üzerinde hedef dışı etkisi olmadan incelenebilir. Hipokampus izole etmek için, fare başının üst kısmında orta hat boyunca deri kesmek ve yanlara deri taşımak için küçük diseksiyon makası kullanın.
Kafatasının kaudal tarafında başlayarak, koku ampuller ulaşıncaya kadar orta hat boyunca kafatası kesilmiş ve beyin maruz kalana kadar kafatasının bölümlerini çıkarın. Farenin burun yakın başlayarak, yavaş yavaş koku ampuller, kranial sinirler ve omurilik kesmek için makas kullanarak, beyin kaldırın. Beyni batırın, Ventral tarafı MOPS Tamponlu Tuzlu'da, bir diseksiyon plakasının ortasına, ve plakayı bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
Çanak alt paralel keskin kenar tutarak, tek bir vuruşta uzunlamasına çatlak boyunca beyni ikiye kesmek için jilet kullanın. Orta çizgi aşağı bakacak şekilde plakanın ortasına bir yarımküre yerleştirin ve beyincik ve beyin sapını çıkarmak için enine çatlak boyunca dokuyu düz itin. Medial tarafı yukarı bakacak şekilde yarımküreyi döndürün ve beyni yerinde tutmak için bir spatula kullanın.
Corpus callosum altında ikinci bir spatula ucunu yerleştirin, hipokampus talamus kaldırmak için doku altında kepçe, septum, ve hipotalamus. Hipokampus artık serebrumun arka tarafına yakın kavisli bir yapı olarak görülmelidir. Serebrum yerinde tutmak için bir spatula kullanarak, serebrum hipokampus kepçe için ikinci spatula kullanın.
Sonra yeni bir diseksiyon plaka sıyrık hippocampi aktarın, taze MOP çözeltisi ile yaklaşık yarım dolu. Hipokampal arter izolasyonu için, örnek hipokampal arter tarafını sabitlemek için bir hipokampusun her iki ucuna küçük iğneler yerleştirin. Çok keskin forceps kullanarak, yavaşça arteriyolçevreleyen doku gevşetmek için hipokampi küçük bölümleri germek.
Ve dış enine arterleri tanımlamak için dorsal hipokampal dokuları arayın. Arter bulunduğunda, hipokampus dış enine arter kapmak ve yavaş yavaş arteriyol ve kılcal damarlar toplamak için doku dan çekin. Her hipokampus arter ayrı ayrı kaldırılır.
Çıkarılacak başka damar olmadığında, örnekleri buza yerleştirin ve kalan hipokampal dokuyu atın. Arteriollerin kanülasyonu için, kapiller ile biten bir dal ile bulmak ve arteriol ve bir organ odasına arteriol yerleştirin. Kan damarını monte etmek için kanül ucunu hedef alanın altındaki arteriyol duvarından dikkatlice itin.
Daha sonra, dikkatle kravat yerleştirmek için yeterli doku olana kadar kanül üzerine damar kaydırın. Kan damarı ve kanül üzerinde uyacak gevşek bir düğüm yapmak için 12-0 naylon dikişler kullanın ve bağları güvenli bir yarım aksaklık düğüm kullanın, kanül arteriol güvenli hale getirmek için düğüm sıkmak için uçları çekin. Kapatmak için arteriyol'un diğer ucuna bir kravat daha bağlayın.
Odanın karşı tarafında, kanül noktası arteriol sonunda kravat aşağı pins kadar ikinci bir kanül düşürün. Daha sonra kılcal damarların uçlarını açıkta bırakarak ucu şubenin sonuna yakın bir yere yerleştirerek kılcal damar ı coverslip'e sabitlemek için üçüncü bir kanül kullanın. Beyin mikrosirkülasyonu zarif kırılgan olduğu gibi, arteriyollerin hayatta kalmasını sağlamak için kanülasyon işlemi sırasında damarların germe ve işleme en aza indirmek için emin olun.
Basınç miyografi analizi için, odayı kayıt yazılımı ile hafif bir mikroskop aşamasına aktarın ve giriş ve çıkış borularını profüzyon için hazneye bağlayın. Dakikada dört mililitre akış hızında 37 santigrat derece Yapay beyin omurilik sıvısı ile profüzyon başlayın ve bir basınç transdüser ile eşleştirilmiş peristaltik pompa ya basınçlı kanül takın. İç basıncı 20 milimetre Merkür'e getirin ve kayıt yazılımını başlatın.
Mümkün olan en net görüntüyü elde etmek için mikroskobu ve görüntü ayarlarını ayarlayın. Ve arteriyol çapı yaklaşık 15-30 mikrometre olup olmadığını kontrol etmek için Kenar Algılama yazılımı kullanın tam olarak genişlemiş olduğunda. Ayarlar optimize edildikten sonra, kayda başlayın ve damardaki damar içi basıncı 40 milimetreci Merkür'e kadar artırın ve edge detection yazılımı ile arteriyol çapını kaydedin.
Sonra MOP çözeltisi yıkamak için 15 ila 20 dakika boyunca oda bol. Geminin canlılığını test etmek için, banyo profüzyonu için bir mikromolar NS309 çözeltisi uygulamak, arterioler segment iliklenmeli, gösteren 30-40%myojenik sesi. Arteriyol için temel sesi kurulduktan sonra, bir ucunda ince bir nokta ile kanüller yapmak için bir cam çekmece kullanın, ve her kanül ucu kırmak için forseps kullanın, böylece ilgi ilaç inç kare başına basınç beş kilo ucundan sorunsuz akabilir.
Kanülleri ilgi çekici ilaçla doldurun. Ve kanülü mikroskoba bağlı üç eksenli bir mikromanipülatöre yükleyin. Basınç fırlatma sisteminden kanüle boru bağlayın ve yavaşça kapiller yakınındaki banyoiçine kanül aşağı, geminin veya odanın herhangi bir parçası vurmak için dikkat.
Kılcal damarları uyarmak için, kapillerin hemen yanındaki kasayı kapağına indirin ve istenilen fırlatma süresiyle basınç çıkarma sistemini etkinleştirin. Uyarım sonunda, daha fazla uyarılma önlemek için biraz kanül yükseltmek. Sadece kılcal damarların uyarıldığını doğrulamak için, yeni kanülü bir mikromolar NS309 çözeltisi ile doldurun ve gösterildiği gibi kılcal damarları uyarın.
Daha sonra kalsiyumsuz çözelti ile preparat yıkanarak maksimal vazodilatasyon elde edin. Bir mikromolar NS309 banyo uygulaması endotel kalsiyum duyarlı Potasyum kanalları nedeniyle arteriol yakın maksimal dilatasyon neden olur. Kapiller endotel hücreleri ancak, orta ve küçük iletkenlik kanalları eksikliği ve agonist yanıt olarak hiperpolarize yok, sonuç olarak, uyarıcı kapiller NS309 ile biter, upstream arterioler dilatasyona neden olmaz, Bu NS309 arteriole ulaşmadı gösterir, ve basınç ejeksiyon üzerine uygulanan bileşik sipac kısıtlama erişmek için bir kontrol olarak kullanılabilir.
Gösterildiği gibi hipokampal kapiller parenkim parenkar arteriyol preparatının kullanılması, kılcal uçlara 10 milimolar Potasyum ile desteklenen yapay beyin-omurilik sıvısı uygulaması, erkek ve dişi farelerin preparatları arasında farklılık göstermeyen upstream arteriolar genişleme ile sonuçlanır. Ayrıca, Kir2 inhibitörü ML 133 eklenmesi, neredeyse kılcal damar genişlemesi ile ortadan kaldırır, yanıt olarak 10 milimolar Potasyum hem erkek hem de dişi farelerin preparatları. Kan vesssel montaj, zarar en aza indirmek için kan damarı ile doğrudan etkileşimleri sınırlamak, ve damarın canlılığını artırmak.
Bir kez kan damarı izole edilmiştir, farklı ilaç bileşikleri test edilebilir veya kan damarı daha fazla oleküler biyoloji, immünkimya, veya elektrofizyoloji çalışmaları için işlenebilir.
