Biz el yazması üzerine yardım ve yorumlar için M. Bouchecareilh E. Tétaud S. Duvezin-CAUBET, ve A. Devin şükranlarımızı sunuyoruz. Biz görüntüleri alındı ​​Bordo Görüntüleme Merkezi&#39;nin elektronik görüntüleme kutbuna müteşekkiriz. Bu çalışma Centre National de la Recherche Scientifique tarafından desteklendi.

Formvar Izgara Film hazırlanması 1. NOT: Kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük) kullanılarak davlumbaz altında kloroform manipülasyon gerçekleştirin. 400 göz elektron mikroskopisi bakır ızgaralar kullanın. Diğer grid türleri (diğer örgü boyutları, altın, nikel ızgaraları) ile, dondurma işleminin kalitesi kötüdür. <ol><li> kloroform içinde% 0.3 formvar 100 mL&#39;lik bir çözelti hazırlayın. o ajitasyon olmadan gecede çözülmeye bırakın. </li><li> 400 mesh elektron microscopycopper ızgaraları (çap 3.05 mm) bir cam şişede (yüksekliği 3 cm ve çapı 2 cm) aseton içeren (inç kare başına delik sayısı) koyun. elin dairesel bir hareketi ile bir cam şişe karıştırın. Plastik bir transfer pipet yardımıyla aseton çıkarın. Çözücü, 5 dakika için buharlaşmasına izin verin. bir filtre kağıdı üzerine onları dökülerek ızgaraları transferi ve bunları 5 dakika boyunca kurumaya bırakılır. </li><li> Kaygan / parlak kadar tüysüz bir bez ile silerek bir 76 x 26 mm2 bir cam slayt parlatmak.</li><li> Bir kristalleştirici (çap 15 cm, yükseklik: 7 cm kapasitesi 1200 mL) almak ve damıtılmış su ile ağzına kadar doldurun. tozu gidermek için iki kez yüzeyi üzerinde bir cam çubuk geçirerek su yüzeyini temizleyin. </li><li> iki parmak arasındaki cam slayt tutun ve birkaç saniye formvar çözeltide daldırın. o dik 5 dakika boyunca baş aşağı beher altında kurumaya tutun. </li><li> Şerit, kuru bir olduğunda, filmin sınırları slayt yerinden oynamasına tanımlamak için keskin bir tıraş bıçağı ile bir cam slayt kenarlarını skoru. </li><li> Derin bir nefes alın ve üzerine ve biraz opak filmi işlemek ve görünürlüğünü artırmak için filmin altında su buharı bir katman almak için slayt üzerine ağır nefes verin. <ol><li> Hemen yaklaşık 30 ° &#39;lik bir açı ile sürgünün alt dokunarak kristalleştirici su yüzeyi üzerine filmin yüzer. slayt filmin serbest olsun ve kristalleştirici su yüzeyi üzerine soyulabilir. Yavaşça ile filmi çekipcımbız, gerekirse. </li></ol></li><li> Yavaşça ızgaraları uygun kalınlıkta (yaklaşık 10 nm) ve kırışıklık olmadan vardır bölgelerde su yüzeyinde yüzen film üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin. </li><li> Bunlar kristalleştirici su yüzeyinde yüzecek Joseph kağıt ızgaraları kaplayarak filmi al. <ol><li> tek elle Yusuf kağıdı tutarak, filmin bir ucuna Yusuf kağıdın bir ucunu dokunun. Joseph kağıt tamamen ıslak kadar bekleyin. takılıp ızgaraları ile Yusuf kağıdı çıkarın. </li></ol></li><li> son kurutma ve oda sıcaklığında kullanılmadan önce depolama için kapalı bir Petri tabağına 24 saat ızgaraları yerleştirin. </li></ol> Donma-ikame Orta 2. Hazırlık Not: Osmiyum tetroksit (OsO 4) ve uranil asetat tehlikeli kimyasal maddelerdir. Bir laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyerek çeker ocakta bunları işleyin. follkullanım için güvenlik önleminin (OsO 4) ve uranil asetat ow. OSO 4 sızmasını önlemek için O-halkası cryovials kullanın. <ol><li> ultrastrüktürel çalışmalar <ol><li> Bir cam şişeye cam OsO 4 ampul koyun. </li><li> şişeyi sallayarak ampulü kırın. </li><li> % 4 nihai konsantrasyon elde etmek üzere aseton uygun bir hacim,% 100&#39;e ekleyin. </li><li> Karıştırın ve 1.8 mL cryovials içine 1.5 ml alikotları akıtın. </li></ol></li><li> Protein ile immün <ol><li> bir cam şişeye uranil asetat 0.05 g yerleştirin. </li><li> % 100 aseton, 50 ml ilave edilir. </li><li> Manyetik bir karıştırıcı ile çözelti ilave edin. Çözelti berraklaştığında, bir 0.2 mikron filtre kullanılarak filtre. </li><li> 1.8 mL cryovials içine 1.5 ml alikotları koyun. Not: dalma dondurma işleminden önce dondurularak ikame ortamı içeren cryovials hazırlayın ve -84 ° C&#39;de derin dondurucuda muhafaza edin. atmak cam şişeyi ters çevirinTehlikeli atık OsO 4 ampul. </li></ol></li></ol> Hücrelerin 3. hazırlanması NOT: Bu adım yönteminin başarısı için kritik öneme sahiptir. tüm hücre türlerinde, hücrelerin belirtilen sayıda elde etmek için hücreleri büyür. Belirtilen zaman ve hızda belirtilen tüp içinde santrifüje. <ol><li> aşağıdaki gibi farklı hücre tipleri ile ilgili topakların uygun bir kıvam elde etmek için, hücreleri büyütmek: <ol><li> Saccharomyces cerevisiae ve Schizosaccharomyces pombe için, en az ya da tam sıvı ortam 5 ml maya inoküle. 28 ° C, döndürme (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültür, 600 nm&#39;de (OD600) &#39;deki optik yoğunluk ölçülür. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 maya hücrelerinin seyreltin. 1 x 10 9 maya hücreleri 7 elde etmek üzere, döndürme, 28 ° C&#39;de inkübe hücreleri devam edin. </li><li> Leishmania kamçıda için, yaşlılık% 7.5 FCS (inek fetus serumu) ile 5 ml AM ortamında culate parazitleri. 24 ° C&#39;de döner (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültüre göre OD 600 ölçün. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 parazit hücreleri seyreltin. 5 x 10 8 parazit hücreleri 12 elde etmek üzere, döndürme, 24 ° C&#39;de hücreler inkübe devam edin. </li><li> Trypanosoma brucei için,% 10 FCS ve 30 | ig / ml higromisin ile SDM-79 ortamı, 5 mL parazitleri inoküle. 27 ° C, döndürme (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültüre göre OD 600 ölçün. 50 ml taze seçici ortam içinde 0.2&#39;lik bir OD600&#39;e parazit hücreleri seyreltin. 5 x 10 8 parazit hücreleri 13 elde etmek üzere, döndürme, 27 ° C&#39;de hücreler inkübe devam edin. </li><li> Escherichia coli, 100 ug / ml ampisilin ile DYT ortamı 5 ml bakteri inoküle. (Dönen, 37 ° C&#39;de gece boyunca 180 inküberpm). Gece boyunca kültüre göre OD 600 ölçün. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 bakteri hücreleri seyreltin. 5 x 10 10 bakteri hücreleri 14 elde etmek üzere, döndürme, 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri devam edin. Not: bir gece boyunca inkübe edildikten sonra, kültür içindeki hücreler, ya logaritmik veya sabit büyüme fazında olabilir. deney yoluyla belirlenen şekilde çok yavaş büyüyen hücre suşları, bir gece, veya bir hücre, daha fazla sayıda aşılanması daha inkübasyon kat daha gerektirebilir. </li></ol></li><li> Tüm hücre tipleri için 1.500 x g&#39;de 3 dakika boyunca 50 ml&#39;lik bir polipropilen tüpü ve santrifüj hücreleri ihtiva eden kültür ortamı aktarın. </li><li> Süpernatantı ve ilgili hücre kültürü ortamı, 1 ml tüm hücre tipleri pelletini. </li><li> Santrifüj 3,900 x g, 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüj tüpü içinde, tüm hücre tipleri. Tamamen süpernatant kaldırmak. </li><li> hücreleri buz üzerinde tutun. </li></ol> Not: dikkatle sıvı azot tutun. cryogloves ve googles dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın. Propan potansiyel olarak patlayıcı, yani iyi havalandırılmış bir odada veya davlumbaz altında sıvılaşma gerçekleştirin. Hiçbir açık alevler izin verilir. <ol><li> bir polistiren tepsisine sıvı azot, yaklaşık 150 mL koyun. dondurmadan önce sıvı azot içinde bir pirinç fincan (yükseklik 3.6 cm, çap 2 cm, kalınlığı 1.5 mm) yerleştirin. Sıvı azot pirinç fincan nüfuz etmesine izin vermeyin. </li><li> kabarcıklar pirinç kâse soğuk olduğundan emin olmak için geçene kadar bekleyin. </li><li> pirinç kabı duvarı ile temas halinde propan silindire bağlı hortumu koyun. </li><li> Yavaşça propan silindir valfini açmak. NOT: Bu adımda, propan pirinç fincan sıvılaşır. </li><li> propan silindir valfinin kapatılmasına ve, hızla gaz hortumu kaldırarak sıvılaşma durdurun. </li><li> Sıvı ni polistiren kabınıpirinç fincan üstten 5 mm&#39;ye kadar Trogen. Sıvı azot pirinç fincan nüfuz etmesine izin vermeyin. </li></ol> Örnek 5. Dalma Donma <ol><li> polistiren tepsisine sıvı azot, yaklaşık 200 mL koyun. sıvı nitrojen içinde koyarak çok az pirinç bardak (yükseklik 1.5 cm çapında 2.5 cm; 1 mm kalınlık) dondurun. bir süspansiyon hücre örneği için bir fincan koyun. numuneleri karıştırmak için dikkatli olun. Bu amaçla, vb kap 2, içinde, kap 1 &#39;de örnek 2 örnek 1 koydu. </li><li> sıvı nitrojen içinde kendi uç saplayarak cımbız dondurun. </li><li> 3.5 &#39;de elde edilen pelet bir çift kenar kesme iğne dalma. </li><li> cımbız kullanarak, bölüm 1&#39;de hazırlanan formvar ile kaplanmış bir 400 ağ gözü, bakır mikroskopi ızgara alır. </li><li> diseksiyon iğnesi kullanılarak, ızgara üzerinde 3.5 &#39;de elde edilen pelet bir damla yerleştirin. Farklı damla boyutları (örneğin 2, 5 ve 10 mcL) deneyin. </li><li> Çok hızlı bir şekilde sıvı propan genine cımbız tarafından tutulan kılavuz dalmabölümünde 4 puan ve birkaç saniye süre ile dairesel bir hareket ile kılavuz karıştırın. </li><li> Hızla bölüm 5.1&#39;de dondurulmuş küçük pirinç kabına cımbız ile dondurulmuş ızgara aktarın. NOT: Her numune için, en az 3 ızgara oluşturmak. Her zaman bir bakır ızgara yapmadan önce cımbız dondurun. </li></ol> 6. dondur-ikame Not: Osmiyum tetroksit potansiyel olarak uçucu, yani buhar kartuşları olan bir hava temizleyici solunum cihazı kullanın. Dalma dondurma önce sıvı nitrojen içerisinde fiksatif Donma da bir çözeltidir. <ol><li> ince yapısı çalışmaları için, bölüm 2.1&#39;de hazırlanan dondurma-ikame ortamı içeren 1.8 mL dondurarak saklamaya uygun vialler tüpler açın. immüno çalışmaları için, bölüm 2.2&#39;de hazırlanan dondurma-ikame ortamı içeren 1.8 mL dondurarak saklamaya uygun vialler tüpler açın. cryovials kapağını yerleştirin. </li><li> sıvı nitrojen içinde kendi uç saplayarak cımbız dondurun. </li><li> Hızla kapağı çıkarın ve dondurulmuş ızgaraları i aktarmakcımbız kullanarak cryovials nto. </li><li> geri cryovials başlığını takın. </li><li> Her numunenin her grid için tekrar edin. </li><li> Numuneler dondurularak ikame ortamında sağlamak için el bir dairesel hareket ile cryovials tüm kapaklar kapatın ve karıştırın. </li><li> Dondurarak ikame işlemi sırasında -84 ° C dondurucu içinde 3 gün boyunca hava geçirmez bir kutuya cryovials yerleştirin. </li></ol> 7. Örnek Isınma <ol><li> İnce çalışmaları <ol><li> bir polistiren tepsisine cryovials Taşıma bir -30 ° C dondurucu (ani sıcaklık artışı önlemek için). 1 saat boyunca -30 ° C&#39;de derin dondurucuda yerleştirin. </li><li> 2 saat boyunca -15 ° C dondurucuda cryovials yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile, daha sonra 2 saat boyunca 4 ° C &#39;de numuneler ve. </li><li> Plastik bir transfer pipet yardımıyla donma ikame orta çıkarın. % 100 aseton yaklaşık 500 mcL ekleyin. </li><li> 1.8 mi dondurarak saklamaya uygun vialler karıştırınhızla dairesel el hareketi ile cam bir şişe içinde ızgaraları (yüksekliği 3 cm, çap 2 cm) ihtiva eden aseton (1.5 mL) dökün. </li><li> tüm ızgaraları aktardıktan emin olmak için,% 100 aseton, 1 ml ile aynı cryovial durulayın. elin dairesel bir hareketi ile cryovial ilave edin ve cam şişe içinde dondurarak saklamaya uygun vialler içeriğini dökün. </li><li> 10 dakika% 100 aseton 3 kez 3 mL her bir cam şişe durulayın. </li><li> Referans 15 de tarif edildiği gibi gömme ve dahil prosedürleri takip edin. aseton (% 25,% 50 ve% 75), epoksi reçinesi artan konsantrasyonları ile örnek emprenye ve jelatin kapsüller içinde% 100 epoksi reçinesi ile örnek yerleştirin. </li></ol></li><li> çalışmaları immunolabeling <ol><li> bir polistiren tepsisine 1.8 mL cryovials Taşıma -30 ° C dondurucu (ani sıcaklık artışı önlemek için). </li><li> Bir -30 ° C dondurucu içinde 2 saat boyunca cryovials yerleştirin. </li><li> -30 ° &#39;de<html> Cı dondurucu, elin dairesel bir hareketi ile dondurarak saklamaya uygun vialler karıştırın ve hızlı bir polipropilen şişe (yükseklik 5 cm ve çapı 1.5 cm), dondurularak ikame ortamı dökün. </li><li> Taze dondurularak ikame orta 2 ml dondurma ikame ortamı değiştirin. </li><li> Bir -30 ° C dondurucu içinde 2 saat boyunca polipropilen şişe yerleştirin. </li><li> % 100 aseton ve 2 mL% 100 2 mL etanol ile 1 saat boyunca üç kez 1 saat boyunca polipropilen şişe yıkayın. </li><li> Referans 15 de tarif edildiği gibi gömme ve dahil prosedürleri takip edin. Akrilik reçinenin artan konsantrasyonlarının (% 25,% 50, ve aseton içinde% 75) ile örnek emprenye ve jelatin kapsüller içinde% 100 akrilik reçine ile örnek yerleştirin. </li></ol></li></ol> Numunelerin 8. Görselleştirme <ol><li> gömme sonra, bir ultramikrotom ile numune 80 mil ultra-ince bölümler yapmak. 1 dakika için oda sıcaklığında% 2 kurşun sitrat ile bölümleri Kontrasteşek = &quot;xref&quot;&gt; 15. </li><li> Bölümler 15 gözlemlemek için 80 kV veya 120 kV elektron mikroskobu kullanarak. </li></ol>

<ol>
	<li>Palade, G. E., Porter, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Its+identification+in+cells+in+situ.">Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ.</a> J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).</li><li>Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+and+morphological+changes+during+chemical+fixation.">Artefacts and morphological changes during chemical fixation.</a> J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).</li><li>Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+high+pressure+frozen+samples:+bridging+the+gap+between+cellular+ultrastructure+and+atomic+resolution.">Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution.</a> Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).</li><li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Out+with+the+old+and+in+with+the+new:+rapid+specimen+preparation+procedures+for+electron+microscopy+of+sectioned+biological+material.">Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material.</a> Protoplasma. 251, 429-448 (2014).</li><li>Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+cryofixation+by+high-pressure+freezing.">A new approach for cryofixation by high-pressure freezing.</a> J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).</li><li>Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+counterbalances+endoplasmic+reticulum+expansion+during+the+unfolded+protein+response.">Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response.</a> PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).</li><li>Kissov&#225;, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+and+non-selective+autophagic+degradation+of+mitochondria+in+yeast.">Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast.</a> Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).</li><li>Gilkey, J. C., Staehling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+ultrarapid+freezing+for+the+preservation+of+cellular+ultrastructure.">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).</li><li>Nogales, E., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM:+A+Unique+Tool+for+the+Visualization+of+Macromolecular+Complexity.">Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity.</a> Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).</li><li>Baba, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+in+yeast.">Electron microscopy in yeast.</a> Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).</li><li>Leunissen, J. L. M., Yi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-pressurized+rapid+freezing+(SPRF):+a+novel+cryofixation+method+for+specimen+preparation+in+electron+microscopy.">Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy.</a> J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).</li><li>Lefebvre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LdFlabarin+a+new+BAR+domain+membrane+protein+of+Leishmania+flagellum.">LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum.</a> PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).</li><li>Tetaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TbFlabarin,+a+flagellar+protein+of+Trypanosoma+brucei,+highlights+differences+between+Leishmania+and+Trypanosoma+flagellar-targeting+signals.">TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals.</a> Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).</li><li>Wasmer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+NMR+spectroscopy+reveals+that+E+coli+inclusion+bodies+of+HET-s(218-289)+are+amyloids.">Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).</li><li>Lefebvre-Legendre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+assemble+the+alpha+3+beta+3+subcomplex+of+the+ATP+synthase+leads+to+accumulation+of+the+alpha+and+beta+subunits+within+inclusion+bodies+and+the+loss+of+mitochondrial+cristae+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).</li><li>Paumard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATP+synthase+is+involved+in+generating+mitochondrial+cristae+morphology.">The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology.</a> EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).</li><li>Gabriel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Fox2-dependent+fatty+acid+&#223;-oxidation+pathway+coexists+both+in+peroxisomes+and+mitochondria+of+the+ascomycete+yeast+Candida+lusitaniae.">A Fox2-dependent fatty acid &#223;-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae.</a> PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).</li><li>Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+rapid+cooling+and+its+implications+for+cryoimmobilization+of+cells.">The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells.</a> Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).</li><li>Meryman, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+living+cells:+principles+and+practice.">Cryopreservation of living cells: principles and practice.</a> Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).</li><li>Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close-to-native+ultrastructural+preservation+by+high+pressure+freezing.">Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing.</a> Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).</li><li>Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+high-pressure+freezing+and+quick+freeze+substitution+of+plant+tissues+for+transmission+electron+microscopy.">Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51844 (2014).</li><li>Pinan-Lucarr&#233;, B., Clav&#233;, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+autophagy+in+the+filamentous+fungus+Podospora+anserina.">Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina.</a> Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).</li><li>Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chemical+fixation+method+suitable+for+immunogold+localization+of+green+fluorescent+protein+in+the+Golgi+apparatus+of+tobacco+Bright+Yellow+(BY-2)+cells.">An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells.</a> J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).</li><li>Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+high+pressure+freezing+and+freeze+substitution+method+to+preserve+the+labile+vaccinia+virus+nucleocapsid.">An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid.</a> J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışmaları olduğunu beyan ederim.

TEM organeller, hücreler ve dokuların ultrastrüktürel gözlem için güçlü bir yöntemdir. Cryofixation / dondurularak ikame anda hem ince yapısı ve protein antijenisite korunması için en iyi yöntemdir. Kimyasal fiksatifler nüfuz ve ultrastrüktürün 2 tam istikrarlı önce yapısal yeniden düzenlemeleri sağlayan çok yavaş bir şekilde hareket ederler. Tersine, cryofixation / dondurularak ikamesi anında hücresel yapılar 4 dengeler. Bununla birlikte, cry...

Örnek hazırlama herhangi elektron mikroskopisi çalışmanın başarısı için kritik öneme sahiptir. Geleneksel EM sabitleme transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) 1 için doku veya hücrelerin sabitlenmesi için birincil yöntem oldu. İlk olarak, aldehit ve ozmiyum tetroksit kimyasal olarak oda sıcaklığında malzeme sabitlemek için kullanılır. Daha sonra, malzeme, organik çözücüler ile dehidre infiltre ve epoksi reçine içine gömülü olan. Bu yöntem, hücre içine fiksatif nüfuz hızına bağlıdır. Sonuç olarak, hücre içerikleri eserler ve ekstraksiyon, genellikle 2 görülmektedir. Cryofixation açık hücresel yapıların 3 korunması için daha iyi bir alternatif, onları etkilemeden onlara tutuyor. Ince bir reçine bölümlerde TEM görüntüleri 4 yüksek kalitede cryofixation / dondurma ikame yöntem kullanılarak elde edilebilir. Bu tekniğin amacı vitrifiye bi elde etmektirBuz kristallerinin oluşumu ya da hücrelerin ultrastrüktürel zarar vermemek için yeterince küçük içeren buz kristalleri olmadan ological örnekleri. Yüksek basınçlı dondurma (HPF) ve aynı zamanda (PF) dondurma dalma denir ultra hızlı cryofixation, numune cryofix için iki yöntem bulunmaktadır. HPF anlık hücrede molekülleri immobilize eden ve geleneksel EM tespit neden olduğu zarar görmesini engeller. Donma makineleri ve otomatik ikame cihazlarının çeşitli tipleri 5 geliştirilmiştir. Dondurma makinesi ve malzemeler (sıvı azot, vb taşıyıcılar, numune) pahalıdır, ancak yüksek kaliteli bir elektron mikrograflannı 6, 7 üretmek için izin verir. PF 1950&#39;lerin başında kullanılan ve basit ve PF prosedürü sırasında bu şirketin 8 ucuz, hazırlanan numune, buz kristallerinin en az 3 mil 5 için boyutu elde etmek için hızla dondurulur olarak literatürde tarif edilen bir tekniktir. Bu amaçla, örnekörneğin, etan, propan, ya da etan-propan karışımı gibi bir sıvı cryojen daldırıldı. 1950 yılından bu yana, PF iyileştirmeler kullanıcıların daha fazla sayıda bu teknik kullanılabilir hale getirmek için yapılmıştır. PF yaygın (görüntü küçük nesneleri için kullanılır ise yüksek basınç dondurma, şu anda daha kalın 50 5 um (disk şeklindeki numuneler için 200 um bir kalınlığa kadar) Numunelerin büyük bir çeşitlilik dondurmak için tek uygun bir şekilde &lt;100 nm ), şekilsiz bir buz 9&#39;un ince bir film içerisinde süspanse makromoleküler kompleksler gibi. Büyük örnekler, örneğin, ökaryotik hücreler için, PF cryofixed, ancak bu tür kılcal boru veya sandviç sistemleri 8, 10, 11 ya da numune tutucu, gerektirir. Burada, hızlı, kolay kullanımlı ve çeşitli süspansiyon hücre kültürleri için kullanılabilir düşük maliyetli dalma donma / dondurularak ikame teknolojisi sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>T400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>Formvar</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15800</td><td></td></tr><tr><td>Propane N35</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double edge dissecting needle</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72947</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>61802-02</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19130</td><td></td></tr><tr><td>Glass vial 8.5 mL</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>64252</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl acetate</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>48851</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Sigma</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>VWR international</td><td>631-9439</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrylic resin</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin M</td><td>Sigma</td><td>10951</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin M hardener</td><td>Sigma</td><td>10953</td><td></td></tr><tr><td>Dibutyl phtalate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy resin M accelerateur</td><td>Sigma</td><td>10952</td><td></td></tr><tr><td>Crystallizer</td><td>Fischer scientific</td><td>08-762-9</td><td></td></tr><tr><td>Joseph paper</td><td>VWR international</td><td>111-5009</td><td></td></tr><tr><td>Brass cups</td><td></td><td></td><td>do it yourself shop or made by yourself</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Saccharomyces cerevisiae&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shizosacharomyces cerevisiae&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Trypanosoma brucei&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Leishmania amazonensis&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&amp;nbsp;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airtight box</td><td>Fischer scientific</td><td>7135-0001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Air purifying respirator</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 7502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cartridge for respirator</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 6001</td><td></td></tr><tr><td>Particulate filter</td><td>Fischer scientific</td><td>3M 5N11&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

plunge freezing: a tool for the ultrastructural and immunolocalization studies of suspension cells in transmission electron microscopy

İletim Elektron Mikroskobu (TEM), proteinleri lokalize etmek ve macromoleküler kompleksleri çok yüksek çözünürlükte görselleştirmek için hücre altyapısını incelemek için olağanüstü bir araçtır. Bununla birlikte, doğa devletine olabildiğince yakın olabilmek için, mükemmel örnek muhafaza edilmesi gerekiyor. Örneğin, aldehitlerle konvansiyonel elektron mikroskopisi (EM) fiksasyonu, iyi bir ultrastrüktürel koruma sağlamaz. Sabitleştiricilerin yavaş nüfuz etmesi hücrenin yeniden düzenlenmesini ve çeşitli hücre bileşenlerini kaybetmesini sağlar. Bu nedenle, klasik EM fiksasyonu yapıların anlık statikleşmesini ve korunmasını ve antijenikliğine izin vermez. Hücre içi olayları incelemek için en iyi seçim, hücreleri kendi doğal hallerinde tutan dondurma-ikame sabitleme yönteminin ardından kriyofizasyonu kullanmaktır. Hücresel altyapı bütünlüğünü koruyan yüksek basınçlı dondurma / dondurma ikamesi, en sık kullanılan yöntemdir, ancak maliyeti gerektirirekipmanı ettik. Burada, süspansiyon hücre kültürleri için dondurularak ikamesi ile devam kullanımlı kolay ve düşük maliyetli dondurarak sabitleme yöntemi sunulmuştur.

Bu makalede, ultrastrüktürel (Şekil 1 ve Şekil 2) ve immunolabeling (Şekil 3) çalışmaları için, kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir dalma dondurma yöntemi sunulmuştur. Biz dondurularak değişikliği işlemleri için ve ısınma prosedürü yerine özel bir sistem kullanarak 24 saat 6&#39;dan az saat sürer o özel ekipmanlara sahip olmak gerekli olmadığını göstermektedir. <...

Watch this Scientific Journal Video about Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy at JoVE.com

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

plunge-freezing-tool-for-ultrastructural-immunolocalization-studies

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Görüntüleme.  Université de Bordeaux.  Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir. 

Video: Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions and their disturbed homeostasis is involved in various diseases. State-of-the-art synchrotron X-ray fluorescence nanoprobes provide the required sensitivity and spatial resolution to elucidate the two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) distribution and concentration of metals inside entire cells at the organelle level. This opens new exciting scientific fields of investigation on the role of metals in the physiopathology of the cell. The cellular preparation is a key and often complex procedure, particularly for basic analysis. Although X-ray fluorescence techniques are now widespread and various preparation methods have been used, very few studies have investigated the preservation of the elemental content of cells at best, and no stepwise detailed protocol for the cryopreparation of adherent cells for X-ray fluorescence nanoprobes has been released so far. This is a description of a protocol that provides the stepwise cellular preparation for fast cryofixation to enable synchrotron X-ray fluorescence nano-analysis of cells in a frozen hydrated state when a cryogenic environment and transfer is available. In case nano-analysis has to be performed at room temperature, an additional procedure for freeze-drying the cryofixed adherent cellular preparation is provided. The proposed protocols have been successfully used in previous works, most recently in studying the 2D and 3D intracellular distribution of an organometallic compound in breast cancer cells.

Presented here is a protocol for cell culture on silicon nitride membranes and plunge-freezing prior to X-ray fluorescence imaging with a synchrotron cryogenic X-ray nanoprobe. When only room temperature nano-analysis is provided, the frozen samples can be further freeze-dried. These are critical steps to obtain information on the intracellular elemental composition.

Silikon Nitrür Membranları ve Synchrotron X-ışını Floresan Nano-Analizi için Kriyopreyeüzerine Hücre Kültürü

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

Biyokimya

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the structure of neurites is critical to understanding how these processes move materials and signals that support synaptic communication. Electron microscopy (EM) has been traditionally used to assess the ultrastructural features within neurites; however, the exposure to organic solvent during dehydration and resin embedding can distort structures. An important unmet goal is the formulation of procedures that allow for structural evaluations not impacted by such artifacts.
Here, we have established a detailed and reproducible protocol for growing and flash-freezing whole neurites of different primary neurons on electron microscopy grids followed by their examination with cryo-electron tomography (cryo-ET). This technique allows for 3-D visualization of frozen, hydrated neurites at nanometer resolution, facilitating assessment of their morphological differences. Our protocol yields an unprecedented view of dorsal root ganglion (DRG) neurites, and a visualization of hippocampal neurites in their near-native state. As such, these methods create a foundation for future studies on neurites of both normal neurons and those impacted by neurological disorders.

To preserve neuronal processes for ultrastructural analysis, we describe a protocol for plating of primary neurons on electron microscopy grids followed by flash freezing, yielding samples suspended in a layer of vitreous ice. These samples can be examined with a cryo-electron microscope to visualize structures at the nanometer scale.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Nörobilim

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could easily be adapted for other biological samples. The basic principles for preparing samples, milling, and viewing lamellae are common to all instruments and the protocol can be followed as a general guide to on-grid cryo-lamella preparation for cryo-electron microscopy (cryoEM) and cryo-electron tomography (cryoET). Electron microscopy grids supporting the cells are plunge-frozen into liquid nitrogen-cooled liquid ethane using a manual or automated plunge freezer, then screened on a light microscope equipped with a cryo-stage. Frozen grids are transferred into a cryo-scanning electron microscope equipped with a focused ion beam (cryoFIB-SEM). Grids are routinely sputter coated prior to milling, which aids dispersal of charge build-up during milling. Alternatively, an e-beam rotary coater can be used to apply a layer of carbon-platinum to the grids, the exact thickness of which can be more precisely controlled. Once inside the cryoFIB-SEM an additional coating of an organoplatinum compound is applied to the surface of the grid via a gas injection system (GIS). This layer protects the front edge of the lamella as it is milled, the integrity of which is critical for achieving uniformly thin lamellae. Regions of interest are identified via SEM and milling is carried out in a step-wise fashion, reducing the current of the ion beam as the lamella reaches electron transparency, in order to avoid excessive heat generation. A grid with multiple lamellae is then transferred to a transmission electron microscope (TEM) under cryogenic conditions for tilt-series acquisition. A robust and contamination-free workflow for lamella preparation is an essential step for downstream techniques, including cellular cryoEM, cryoET, and sub-tomogram averaging. Development of these techniques, especially for lift-out and milling of high-pressure frozen samples, is of high-priority in the field.

Using focused ion beam milling to produce vitreous on-grid lamellae from plunge frozen biological samples for cryo-electron tomography.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires a thin layer of vitreous ice containing the biomolecules of interest. Despite numerous technological advances in recent years that have propelled single-particle cryoEM to the forefront of structural biology, the methods by which specimens are vitrified for high-resolution imaging often remain the rate-limiting step. Although numerous recent efforts have provided means to overcome hurdles frequently encountered during specimen vitrification, including the development of novel sample supports and innovative vitrification instrumentation, the traditional manually operated plunger remains a staple in the cryoEM community due to the low cost to purchase and ease of operation. Here, we provide detailed methods for using a standard, guillotine-style manually operated blot-and-plunge device for the vitrification of biological specimens for high-resolution imaging by single-particle cryoEM. Additionally, commonly encountered issues and troubleshooting recommendations for when a standard preparation fails to yield a suitable specimen are also described.

This manuscript outlines the blot-and-plunge method to manually freeze biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Biyoloji

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, because of laborious and time-consuming protocols that also demand experience in preparation of artifact-free samples, TEM is not considered a user-friendly technique. Traditional sample preparation for TEM used chemical fixatives to preserve cellular structures. High-pressure freezing is the cryofixation of biological samples under high pressures to produce very fast cooling rates, thereby restricting ice formation, which is detrimental to the integrity of cellular ultrastructure. High-pressure freezing and freeze substitution are currently the methods of choice for producing the highest quality morphology in resin sections for TEM. These methods minimize the artifacts normally associated with conventional processing for TEM of thin sections. After cryofixation the frozen water in the sample is replaced with liquid organic solvent at low temperatures, a process called freeze substitution. Freeze substitution is typically carried out over several days in dedicated, costly equipment. A recent innovation allows the process to be completed in three hours, instead of the usual two days. This is typically followed by several more days of sample preparation that includes infiltration and embedding in epoxy resins before sectioning. Here we present a protocol combining high-pressure freezing and quick freeze substitution that enables plant sample fixation to be accomplished within hours. The protocol can readily be adapted for working with other tissues or organisms. Plant tissues are of special concern because of the presence of aerated spaces and water-filled vacuoles that impede ice-free freezing of water. In addition, the process of chemical fixation is especially long in plants due to cell walls impeding the penetration of the chemicals to deep within the tissues. Plant tissues are therefore particularly challenging, but this protocol is reliable and produces samples of the highest quality.

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

Tandem Yüksek basınçlı Donma ve Transmisyon Elektron Mikroskobu için Bitki Doku Hızlı Dondurma Değişiklik

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

Flaş-ve-Freeze: Elektron Mikroskobu ile Membran Dinamikler Yakalama Yeni Bir Tekniği

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.