Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir (RO1 GM079351 D.K. için). Dorothea Godt onun orijinal protokolüne dayanan pupa yumurtalık diseksiyonu yararlı onun tavsiye için teşekkür ediyoruz. Biz ayrıca Amy Reilein ona yardım ve el yazması üzerine yorum için teşekkür ederiz.

1. EggLaying
<ol><li>Yaklaşık on erkek ve on beş kadın yetişkin Drosophila sinekler istenen genotip normal zengin sinek yemek Maya ile desteklenmiş bir şişe içinde birleştirir. Şişeyi aşırı kalabalık önlemek için 2-4 h14saatten uzun için yumurtlamak şeklindeki kadın izin.</li>
	<li>Yetişkinler şişeyi uçmak gıda ile farklı bir şişe karşı açılış şişe dokunarak yeni bir şişe aktarın. Larvalar, oda sıcaklığında içine 3-4 gün için geliştirmek yumurta izin.</li>
</ol>2. kadın larva seçme
<ol><li>Nemli bir ince fırça ile yumuşak kıllar kullanarak, göçebe üçüncü-biçim larva de 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile ağzına kadar dolu bir cam şişe aktarmak için şişe duvar boyunca fırça ile çalışırken bir hareketi yapmak. Gıda artıkları larvalar kapalı onların 1 x PBS ile dolu iyi diğerine transfer ederek yıkayın.</li>
	<li>Erkek ve dişi larva forseps kullanarak ayırın. Büyük, yuvarlak ve yarı saydam testis yağ vücutta yaklaşık üçte vücut yan tarafındaki aşağı onun ön uç15gömülü bir çift tarafından erkek larva tanımlayın. Kadın larva ortalama olarak daha büyük, daha az erkeklerden daha saydam ve daha tespit etmek zordur çok daha küçük gonads var.</li>
	<li>Erkek larva karşı kadın larva toplamak için seçin. En az 10 kadın kuyudan toplamak. Kadın larva de 1 x PBS ile dolu ayrı bir yerleştirin.</li>
	<li>Kadın larva yavaşça taze uçmak yiyecek yeni bir şişe aktarmak için kullanmak forseps Maya ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Şişeyi kadın larvaları ile pupariation16kolaylaştırmak için karanlık bir konuma yerleştirin. Gün boyunca, larva pupariation için izleyin. Her larva immobilizes ve bir prepupa geliştirir, şişeyi karşı prepupa daire ve ne zaman o ilk oluşturur bir prepupa yaklaşık süreyi kaydetmek. Prepupae anterior vızıltısı çıkıntı ve zamanlama puparium oluşumu17belirleyebilir. Prepupae (puparium oluşumu, APF sonra saat cinsinden) istenen saat noktasına geliştirmeye olanak sağlar. Not: bir prepupa puparium formasyonu içerisinde yaklaşık 10 s aralığı tabi herhangi bir hayvan olarak kabul edilebilir. Dahili bir tüy dökme yerini almıştır sonra pupa aşamada yaklaşık 12 h puparium oluşumu sonra başlar.</li>
</ol>3. pupa antikor boyama için hazırlanması
<ol><li>
Sonraki adımda pupa yağ cesedi temizlenmesi için kullanılmak üzere bir ince cam damlalıklı oluştururlar.
	<ol>
<li>Pasteur damlalıklı cam ucu Bunsen brülör üzerinde kavrulur. Cam erir gibi pens ucunu yatay olarak daha ince bir ipucu oluşturmak üzere damlalıklı kalan uzak çekmek için kullanın.</li>
		<li>Soğutma sonra temiz bir dairesel açılış kurmaya damlalıklı ipucu küçük bir bölümünü kır. Bir ampul damlalıklı diğer ucunu takın.</li>
		<li>1 x PBS ile damlalıklı yükleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Şişeyi duvara yapıştırılmış, Pupa, hasat için küçük bir damla su pupa ve flakon arasında temas bölgesi boyunca geçerlidir. Protein bildirmek için 1-2 dakika bekleyin tutkal dağıtılması hafifçe nemli bir ince fırça ile duvarından pupa kaldırma önce. 1 x PBS ile dolu pupa bir cama iyi transfer. Tek bir kuyu kuyu aşırı kalabalık önlemek için pupa başına adamak.</li>
	<li>Pupa başkanı görünene kadar pupa arka sonu forseps bir çift ile açgözlü iken, başka bir çifti pupa modelinde ön kısmını dikkatlice gözyaşı.</li>
	<li>Pupa başından en ön ucu Forseps ile kavrama ve yavaşça pupa pupa kendi halinde dışarı çekin. Not: Yağ vücudun bir kısmı dışarı bu süreçte dökülme.</li>
	<li>Ayrı ve pupa posterior yarım üzerinden ön yarısı kadar sadece karın çuval kalır atın.</li>
	<li>
Yağ vücut hücrelerinin karın çuval ayıklayın.
	<ol>
<li>1 x PBS başka bir el ile dolu ince cam damlalıklı tutarken bir yandan Forseps ile karın çuval kuyunun karşı kavramak.</li>
		<li>İnce damlalıklı ipucu açılması çuval ve yavaş yavaş damlalıklı 1 x PBS pupa yumurtalık çevreleyen yağ vücut hücrelerinin silsin karın içine doğru nişan al. Not: Yumurtalık karın çuval içinde kalması gereken küçük, yarı saydam, çizgili ve dikdörtgen yapıları bir çift vardır.</li>
		<li>Yağ vücut hücreleri en az üçte iki yağ vücudun gitmiş oluncaya veya yumurtalıkların karın çuval açılış yakınındaki görünür hale gelene kadar silsin. Yavaş yavaş bu adımı yürütmek çok önemlidir bu yüzden karın dışında yumurtalıkların kazara yıkamak değil.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yumurtalık dışarı yağ vücut hücre yıkama sırasında dökülen Eğer kontrol etmek için iyi inceleyin. Yumurtalık içinde iyi görünür değilse, karın içinde kalması gereken. Yumurtalık dışarı gelmiş varsa, yeni bir pupa kuyuda yerleştirebilir ve bu adımı yineleyin.</li>
	<li>Fiksasyon arabellek (1 x PBS, %4 paraformaldehyde) ile dolu bir açık coverglass odasına karın aktarmak ve kapağı üzerinde yer. Yumurtalıklar yeterli sayıda dayanacak boyama ve montaj işlemi, emin olmak için gerekenden daha fazla yumurtalıkların incelemek. Uyarı: Toksik olan paraformaldehyde fiksasyon arabellek içeriyor. Lütfen uygun korumaları eldiven, koruyucu gözlük, vbgibi tak.</li>
</ol>4. immünhistokimya
<ol><li>Boyama işlemi süresince, forseps cam kuyunun kayan herhangi bir yumurtalık yumurtalık tamamen antikor çözümde daldırılır emin olmak için yavaşça itin için kullanın.</li>
	<li>Yer çift taraflı bant bir Nutator düz yüzeyine çıkarır ve sonra odacıklı coverglass veya yapışkanlı çekilebilecek.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 15 dk için adım 3.7 fiksasyon arabellekte yumurtalık kuluçkaya.</li>
	<li>Yumurtalık durulama üç 1 x PBS % 1 ile Triton X-100 5, 10 ve 45 dk (toplamda 1 h), sırasıyla, kapsamlı permeabilization izin vermek için kez.</li>
	<li>1 x PBS % 0,5 ile % 10 normal keçi Serumda yumurtalık engellemek Triton X-100 30 dk için.</li>
	<li>Yumurtalık gecede 600 kuluçkaya seçim birincil antikor µL Triton X-100 4 ° C'de % 0,5 ile 1 x PBS uygun konsantrasyonu seyreltilmiş</li>
	<li>1 x PBS % 0.5 ile yumurtalık üç kez 5 min için durulama Triton X-100.</li>
	<li>Triton X-100 oda sıcaklığında 1 x PBS % 0.5 ile uygun konsantrasyon için 2 h seçtiğiniz ikincil antikor 600 µL içinde seyreltilmiş için yumurtalıkların kuluçkaya.</li>
	<li>Yumurtalık iki kez 5 min için 1 x PBS %0.5 Triton X-100 ve 5 dakika içinde 1 x PBS için bir kez ile yıkayın.</li>
</ol>5. anatomi ve pupa yumurtalık montaj
<ol><li>1 x PBS bir mikroskop slayt üzerine küçük bir damla yerleştirin. Kullanım forseps karın çuval odacıklı coverglass bir cam de aktarmak için 1 x PBS ile dolu. Tek bir kuyu kuyu aşırı kalabalık önlemek için pupa başına adamak.</li>
	<li>Dışında kalan herhangi bir yağ vücut ve karın çuval Forseps ile gözyaşı. Not: bir çift küçük, yarı saydam, çizgili ve dikdörtgen yapıları vardır, yumurtalık, kuyunun içinde görünür olması gerekir. Yumurtalık kez sıkıca yağ vücut tarafından çevrili, emin olmak önemlidir bu yüzden tüm yağ vücut iyice parçalanmış ayrı.</li>
	<li>Yumurtalık kuyudan 1 x mikroskop PBS slayt yumurtalık forseps ipuçları arasında merkezi açgözlü tarafından damla içine aktarın. Bir tutuş yumurtalık sıkma olmadan kullanılması şekilde değil kaybetmek veya aktarım sırasında edilebilmek için çok önemlidir. Çözüm zaman içinde kurur 1 x PBS birkaç damla slayda ekleyin.</li>
	<li>Bir kez tüm yumurtalık disseke ve mikroskop slayt, damlalıklı 40 µL, 22 x 22 mm coverslip ve yer coverslip yavaşça yumurtalıklar üzerine montaj ortamına aktarılır. Slayt kuru gecede görüntüleme önce izin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Stem+Cell+Niches:+A+Decade+of+Discovery+Suggests+a+United+View+of+Stem+Cell+Regulation.">Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation.</a> Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li><li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ovary:+an+active+stem+cell+community.">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).</li><li>Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Development+of+Germline+Stem+Cells+in+Drosophila.">The Development of Germline Stem Cells in Drosophila.</a> Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).</li><li>Pearson, J., L&#243;pez-Onieva, L., Rojas-R&#237;os, P., Gonz&#225;les-Reyes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+Drosophila+stem+cell+biology.">Recent advances in Drosophila stem cell biology.</a> Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).</li><li>Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+stem+cells,+wound+healing+and+cancer.">Epithelial stem cells, wound healing and cancer.</a> Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+stem+cells+as+the+cells-of-origin+of+intestinal+cancer.">Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer.</a> Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).</li><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+myeloid+leukemia:+proving+ground+for+cancer+stem+cells.">Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells.</a> Cell. 119 (3), 314-316 (2004).</li><li>Reilein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+direct+stem+cell+derivatives+defined+by+stem+cell+location+and+graded+Wnt+signaling.">Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling.</a> Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).</li><li>Eliazer, S., Buszczack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+niche:+studies+from+the+Drosophila+ovary.">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).</li><li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+&#224;+brac.">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric &#224; brac.</a> Development. 121 (1), 173-187 (1995).</li><li>King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+the+female+Drosophila+reproductive+system.">The development of the female Drosophila reproductive system.</a> J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).</li><li>Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Pak-regulated+cell+intercalation+event+leading+to+a+novel+radial+cell+polarity+is+involved+in+positioning+of+the+follicle+stem+cell+niche+in+the+Drosophila+ovary.">A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary.</a> Development. 142 (1), 82-91 (2015).</li><li>Irizarry, J., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+supports+Drosophila+fertility+by+regulating+development+of+ovarian+muscle+tissues.">FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues.</a> Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).</li><li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Staining+of+Drosophila+Larval+Ovaries.">Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries.</a> J Vis Exp. (51), e2537 (2011).</li><li>Kerkis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Growth+of+the+Gonads+in+DROSOPHILA+MELANOGASTER.">The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER.</a> Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).</li><li>Yamanaka, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroendocrine+Control+of+Drosophila+Larval+Light+Preference.">Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference.</a> Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Courdec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bric+&#224;+brac+locus+consists+of+two+paralagous+genes+encoding+BTB/POZ+domain+proteins+and+acts+as+a+homeotic+and+morphogenetic+regulator+of+imaginal+development+in+Drosophila.">The bric &#224; brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila.</a> Development. 129, 2419-2433 (2002).</li><li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=INSECT+FAT+BODY:+ENERGY,+METABOLISM,+AND+REGULATION.">INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).</li><li>Zhang, Y., Xi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+Body+Development+and+its+Function+in+Energy+Storage+and+Nutrient+Sensing+in+Drosophila+melanogaster.">Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster.</a> J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).</li><li>Wong, L. C., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Drosophila+Ovaries.">Dissection of Drosophila Ovaries.</a> J Vis Exp. (1), e52 (2006).</li></ol>

Yazarlar hiçbir bildirmek için çıkar çatışması var.

Bu iletişim kuralının en kritik ve zor adım pupa yumurtalık fiksasyon öncesinde hazırlanması içerir. Yumurtalıklar, küçük ve gömülü içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından yeterince antikorlar ile lekeli emin olmak için sadece büyük bir açılış karın yatakta Forseps ile gözyaşı ama aynı zamanda engel yağ vücut hücreleri ayıklamak önemlidir Yumurtalık antikorlar üzerinden. Bu adımın başarılı yürütme gerektirir yağ vücut hücrelerinin karın çuval dışarı yıkama...

Drosophila yumurtalık kullanarak kök hücre araştırma kök hücre niş1,2,3,4ilk belgelenmesi beri yaygın olarak genişletti. Soy izleme genetik araçlarını, Drosophila yumurtalık diseksiyonlarının sık kök hücre soy eğitim için kullanılan gelişimi takip ve kök hücre bakım, yayılmasını önleme ve kök hücre niş kadere düzenleyen yolları sinyal. Bu sinyal yolları bilgisine kanserlerin anormal kök hücre etkinlik5,6,7' den kaynaklanan olası nedenler anlayışlar verim. Ayrıca son zamanlarda folikül kök hücreler (FSCs) bilinen Drosophila yumurtalık somatik kök hücre şiddetle memeli bağırsak kök hücre kendi organizasyon8birçok yönleriyle benzer gösterilmiştir. Bu nedenle, Drosophila yumurtalık kök hücre davranış eğitimi için son derece faydalı model sistemi vardır.
Larva ve yetişkin yumurtalık erken kök hücre gelişimi ve niş içinde son kök hücre organizasyon ipuçları sırasıyla sunarken, Pupa yumurtalık germline ve somatik hücre yeniden düzenlemek ve kimliklerini kurmak bir ara yapıdır 9 , 10. rağmen birçok araştırma yönleri pupa yumurtalık10,11,12,13' te doku gelişimi inceledik, farklılaşma ve mekansal organizasyonu ile ilgili sorular kalır pupa geliştirme sırasında yumurtalık hücre türleri. Özellikle, bu döneminde FSCs tayini oluşur. Bu iletişim kuralı anatomi ve istediğiniz zaman noktalarda pupa yumurtalık boyama yöntemi özetliyor — pupa yumurtalık gelişimi yetişkin sahneye larva üzerinden ayrıntılı olarak analiz zaman ders deneylerde kullanılan bir teknik.
Küçük boyutu, translucence ve pupa karın içinde pupa yumurtalık erişilememesi için hesap için bu iletişim kuralını antikor erişimin engellenmesi karın yağ vücut dokusu kaldırmak için bir ısmarlama ince uçlu Pasteur damlalıklı gibi araçlar kullanır Yumurtalık. Teklifler geniş çaplı bir görünürlük pupa ve yumurtalık "Nutator" üzerinde sallanan nazik bir platform boyama antikor sırasında kullanılan bir açık, odacıklı coverglass Larva yumurtalık gruptakiler için bir protokol Maimon ve beratını14tarafından dayanarak, Triton X-100 nispeten yüksek bir konsantrasyon boyama yordamın ilk adımda hücre zarının permeabilization ve antikor erişimin en üst düzeye çıkarmak için istihdam edilmiştir Yumurtalık hücreleri.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, biology</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ-10A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Zen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9 Depression Glass Spot Plates</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>7220-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet bulb</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 x 22 mm glass coverslips No 1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double-sided tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutator</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brush #0, #3-#5</td>
			<td>Various vendors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Pipetman Starter Kit</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>F167300</td>
			<td>Contains p20, p200, p1000 pipettors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9624</td>
			<td>Dilute to 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>5000121</td>
			<td>Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000)</td>
			<td>Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore)</td>
			<td></td>
			<td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum)</td>
			<td>Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.)</td>
			<td></td>
			<td>Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly vials</td>
			<td>Denville Scientific</td>
			<td>V9406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Balls, For Wide Vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-102W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast, Bakers Dried Active</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>101400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fly food</td>
			<td>Produced in laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Mixture of water, brewer&#39;s yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2)</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and staining of drosophila pupal ovaries

Yetişkin Drosophila yumurtalık, Pupa yumurtalık erişmek ve onların küçük nedeniyle incelemek nispeten zor olan boyut, translucence ve bir pupa dava içinde kapatan. Pupa yumurtalık dissekan meydan aynı zamanda fiziksel konumlarını pupa içinde yatıyor: yumurtalık içinde pupa karın yağ vücut hücreleri tarafından çevrilidir ve bu yağ hücrelerinin doğru antikor boyama için izin vermek için kaldırılması gerekir. Bu zorlukları aşmak için pupa karından yağ vücut hücreleri ayıklamak için özelleştirilmiş Pasteur pipets bu protokolü kullanır. Ayrıca, Pupa görünürlüğünü artırmak için odacıklı bir coverglass yerine microcentrifuge tüp boyama işlemi sırasında kullanılır. Ancak, bu ve diğer avantajları bu protokol için kullanılan araçlar rağmen bu tekniklerin başarılı yürütme hala pratik pupa yumurtalık küçük boyutu nedeniyle birkaç gün içerebilir. Bu protokol için özetlenen teknikleri yumurtalık çeşitli yaşlardaki pupa analiz edilir zaman ders deneyler için uygulanabilir.

Bu yordamın başarılı yürütme Drosophila pupa yumurtalık hücresel organizasyonu ve yapısını ortaya açık antikor boyama sonuçlanmalıdır. Bu protokol için özetlenen immünhistokimya genellikle larva ve yetişkin yumurtalıklarda lekeli hücre tipleri tanımlamak için kullanılabilir. Türetilen pupa SAP hücrelerinin hücre (beyaz Fasciclin III tarafından özetlenen)18 şekil 3' te gösterilen sürüsü. Pupa ...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries at JoVE.com

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Drosophila yumurtalık kök hücre niş geliştirme eğitim için mükemmel model bir sistemdir. Larva ve yetişkin yumurtalık dissekan için yöntemleri yayımlanmış olsa, Pupa yumurtalık diseksiyonlarının ayrıntılı olarak yayınlanmamıştır farklı teknikler gerektirir. Burada diseksiyon, boyama ve pupa yumurtalık montaj için bir protokol anahat.

Diseksiyon ve Drosophila pupa yumurtalık boyama

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

dissection-and-staining-of-drosophila-pupal-ovaries

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

9.3K Görüntüleme.  Columbia University. Drosophila yumurtalık kök hücre niş geliştirme eğitim için mükemmel model bir sistemdir. Larva ve yetişkin yumurtalık dissekan için yöntemleri yayımlanmış olsa, Pupa yumurtalık diseksiyonlarının ayrıntılı olarak yayınlanmamıştır farklı teknikler gerektirir. Burada diseksiyon, boyama ve pupa yumurtalık montaj için bir protokol anahat.

Video: Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex determination system, where several genes distributed throughout the genome collectively determine the sex identities of individual fish. Currently, the genes involved in regulating gonad development and how they work remain elusive. Normally, isolating gonadal tissue is the first step to examine the sex developmental processes. Here, we present a procedure to isolate gonadal tissue from 17 dpf (days post fertilization) and 25 dpf zebrafish larvae. The isolated gonadal tissue may be subsequently examined by morphology and gene expression profiling.

Here, we present a protocol for isolating gonadal tissue of larval zebrafish, which will facilitate investigations of zebrafish sex differentiation and maintenance.

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

Fare Embriyonik Böbreklerinin Diseksiyonu ve Kültürü

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells named wing imaginal discs formed during embryonic development. In the larval stages the imaginal discs grow, increasing its number of cells and forming monolayered epithelial&#160;structures. Inside the pupal case, the imaginal discs bud out and fold into bilayers along a line that becomes the future margin of the wing. During this process, the longitudinal primodia veins originate vein cells on the prospective dorsal and ventral surfaces of the wing. During the pupal stage the stripes of vein cells of each surface communicate in order to generate tight tubes; at the same time, the cross-veins begin their formation.
With the help of appropriate molecular markers, it is possible to identify the major elements composing the wing during its development. For this reason, the ability to accurately detect transcripts or proteins in this structure is critical for studying their abundance and localization related to the development process of the wing.
The procedure described here focuses on manipulating pupal wings, providing detailed instructions on how to dissect the wing during the pupal stage. The dissection of pupal tissue is more difficult to perform than their counterparts in third instar larvae. This is why this approach was developed, to obtain rapid and efficient high quality samples. Details of how to immunostain and mount these wing samples, to allow the visualization of proteins or cell components, are provided in the protocol. With little expertise it is possible to collect 8-10 high quality pupal wings in a short amount of time.

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

The ability to accurately detect transcripts or proteins in Drosophila tissues is critical for studying their abundance and localization related to the development process. Here is the description of a straightforward procedure to dissect pupal wings. These wings can be used as samples in several techniques (immunohistochemistry, PCR assay, etc.).

Drosophila Immunodetections veya PCR deneyleri için uygun pupa Wings incelemek için hızlı ve etkili bir yöntem

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Bütün Dağı ayirt ve kültürlü fare yumurtalıklarda folikül miktar

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

Drosophila pupa Retina diseksiyon immünhistokimya, Batı analiz ve RNA izolasyon için

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.