DNA onarım mekanizmaları, tüm canlı organizmalarda genom bütünlüğünün korunması için çok önemlidir. Urasil-DNA glikozilaz, temel doku onarım yolunda çok önemli bir DNA onarım proteinidir. MALDI-TOF kütle spektrometrisini kullanarak, enzim aktivitesi testi için AP ürününü doğrudan tespit edebiliriz.
Geleneksel glikozilaz testi, substrat emeği gerektirir. Bu yöntem etiketsizdir ve urasil substratından AP ürününe kütle değişimini doğrudan tespit eder. Diğer avantajlar arasında yüksek özgüllük, çok yönlülük, ölçeklenebilirlik, hız ve gerçekleştirilmesi kolay bulunur.
Örnek olarak E.coli urasil-DNA glikozilaz kullandık. Bu yöntem diğer DNA glikozilaz testleri için kolayca değiştirilebilir. Doğru pipetleme ve seyreltme becerilerine sahip iyi eğitimli laboratuvar personeli çok önemlidir.
Daha iyi sinyaller ve daha az arka plan gürültüsü için taze hazırlanmış reaktifler ve düşük tuz tamponları kullanılmalıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Hui-Lan Chang olacak. T1 U+9 dubleksin guanin-urasil baz taşıyan substratını kullanan bir DNA glikozilaz testi için, 1,5 mililitrelik steril mikrosantrifüj tüpüne 70 mikrolitre su, 10 mikrolitre 10X urasil-DNA glikozilaz veya UDG reaksiyon tamponu, beş mikrolitre T1 stoğu ve beş mikrolitre U+9 stoğu ekleyin.
Tüpü 65 santigrat derecede 30 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe etmeden önce, ardından 37 santigrat derecede 30 dakika ve son olarak substrat şablonu dubleksin uygun şekilde tavlanmasını sağlamak için üç dakika boyunca buz üzerinde kapatın. Daha sonra, yeni bir 1,5 mililitrelik tüpte, 49 mikrolitre buz gibi soğuk UDG reaksiyon tamponu ve bir mikrolitre seyreltilmiş UDG ekleyin, ardından istenen enzim konsantrasyonları için UDG tamponu ile seri seyreltmeler hazırlayın ve seyreltilmiş UDG'yi buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, başka bir 1.5 mililitrelik tüpte, hazırlanan substrat karışımının dokuz mikrolitresini ekleyin ve 37 santigrat derecede önceden ısıtın, ardından seyreltilmiş UDG'nin bir mikrolitresini ekleyin ve içeriği karıştırmak için tüpü hareket ettirin.
Reaksiyon karışımını kısaca santrifüj edin ve tüpü inkübasyon için hemen 37 santigrat dereceye yerleştirin. Reaksiyonu zamanlamak için zamanlayıcıyı kullanın. Reaksiyon sonlandırma için, 0.25 molar hidroklorik asit ve 0.23 molar tris baz çözeltisi hazırlayın.
Reaktifi hazırlarken pH'ı doğrulamak için pH metre kullanın ve reaksiyon sonlandırma adımını çalıştırmadan önce pH şeridi ile test edin, ardından bir mikrolitre 0.25 molar hidroklorik asit ile 10 mikrolitre tris-EDTA'yı asitleştirin ve pH'ın yaklaşık iki artı veya eksi 0.5 olduğundan emin olun. Çözeltiyi bir mikrolitre tris baz ile nötralize edin ve nihai pH'ın yaklaşık 6.5 artı veya eksi 0.5 olduğundan emin olun. Daha sonra, enzimi inaktive etmek için reaksiyon karışımına bir mikrolitre 0.25 molar hidroklorik asit ekleyin ve tüpü altı dakika boyunca buz üzerine yerleştirin, ardından DNA ürünlerini nötralize etmek ve aside uzun süre maruz kalarak AP bölgesi kırılmasını önlemek için bir mikrolitre tris baz ekleyin.
Matris çip transferi için ürün karışımının hacmini artırmak için 13 mikrolitre tris-EDTA ekledikten sonra, tüpü buzun üzerine yerleştirin. Son olarak, 25 mikrolitrelik UDG reaksiyon ürünlerinin tümünü mikrosantrifüj tüplerinden 384 delikli bir mikrotitre plakasına aktarın. Nanolitre dağıtıcının kapısını açın ve 384 delikli mikrotitre plakasını güvertenin plaka tutucusuna yükleyin, ardından matris çip dizisini ilgili keşif plakası konumuna yerleştirin.
Yüklü izci plakasını nanolitre dağıtıcının işleme güvertesine yerleştirin ve kapıyı kapatın. Aktarım ekranındaki çalıştır düğmesine dokunun ve cihazın mikrotitre plakasından matris çipine numune dağıtmaya başlamasını bekleyin. Ardından, vizyon sekmesi seçeneğini kullanarak, dağıtım sırasında her nokta için çipin görüntüsünü ve dağıtım hacimlerini gösterin.
Çip üzerindeki lekeli hacmin beş ila 10 nanolitre aralığında olduğundan emin olun. Uygun uygulama programını kullanarak, içe aktarma için tahmin edilen M by Z değerini içeren bir xlsx dosyası hazırlayın. Ardından, tahlil grubunu tasarımcı biçiminde içe aktar seçeneğine sağ tıklayıp açılır listeden Excel dosyasını seçerek yeni bir UDG testi oluşturmak ve tanımlamak için uygulama programını kullanın.
Ardından, müşteri proje plakası düğmesine sağ tıklayın ve yeni bir tahlil plakası oluşturmak için açılır seçenek ağacının üst kısmına tıklayın. Ardından iletişim kutusuna bir dosya adı yazın. Plaka tipi açılır menüsünde, 384 delikli plaka tipini seçin.
Tamam'a basın ve ekranın sağında boş bir plaka görünmesini bekleyin. Ardından, tahlil seçeneğini tıklayın ve açılır listeden tahlili seçin. Seçilen tahlili plaka üzerindeki her numune nokta konumuna atamak için, imleci boş plakanın her bir konumuna getirin, kuyuyu vurgulamak için tıklatın ve plak ekle'yi seçmek için sağ tıklatın.
Bir masaüstü veya dizüstü bilgisayar kullanarak, çipteki tüm örnekler için üstbilgi içermeyen xlsx biçiminde bir çalışma listesi hazırlayın, ardından yeni örnek proje ekle düğmesine tıklayın ve çalışma listesini içe aktarmak için açılır listeden dosyayı seçin. Ekranın solundaki çalışma listesinde tüm test numune kodlarını arayın, ardından çalışma listesinde bir örnek kodu tıklayın ve testleri her bir konuma bağlamak için plakanın ilgili konumuna sağ tıklayın. Güverteyi uzatmak ve talaş tutucuyu çıkarmak için kütle spektrometresinin giriş/çıkış düğmesine basın.
Numune çipini talaş tutucuya yerleştirin, yüklü talaş tutucuyu genişletilmiş güverteye yerleştirin ve numune çipinin cihaza girmesi için giriş/çıkış düğmesine tekrar basın. Kütle spektrometresi kontrol programında, al simgesine çift tıklayın. Al penceresinde, cihazı başlatmak ve çip üzerindeki örneklerden kütle spektrumları elde etmek için otomatik çalıştırma sekmesine tıklayın.
Veri analizi için, veri analizi programını çalıştırın, ardından veritabanı ağacına göz atın ve çip ID'sini seçin.Çip üzerinde bir hedef kuyusunu vurgulamak için tıklayın ve kütle spektrumunu göstermek için spektrum simgesine tıklayın. Özelleştirme iletişim kutusunu seçmek için sağ tıklayın ve yeni bir pencerede belirli bir spektrum aralığını kırpın, ardından M x üst sınırlarını Z'nin üst ve alt sınırlarını yazın ve ilgilenilen sinyaller de dahil olmak üzere belirtilen aralık spektrumunu göstermek için Tamam'a basın. Urasil substratına, AP ürününe ve şablonuna karşılık gelen M sinyallerinin tepe yüksekliğini Z değerleriyle ölçmek için, tepe noktasına tıklayın ve ekranın sol üst köşesindeki tepe yüksekliğini görüntüleyin.
Son olarak, kayıt tutma spektrumunu kaydetmek için, dışa aktarmaya sağ tıklayın ve açılır listeden dosya türünü JPEG olarak seçin. Hedefe tıklayın ve açılır listeden depolama cihazını seçmek için diske göz atın, ardından dosya adını yazın ve dışa aktar'ı tıklayın. DNA glikozilaz testi için model sistem burada gösterilmiştir.
19 nükleotid şablon DNA'sı glikozilaz hidrolizinden sonra değişmeden kaldı. Bu nedenle, sinyal AP ürününün niceliği için bir referans görevi görebilir. Substrat ve ilgili şablon arasındaki bir nükleotidin farkı, her ikisi için de iyi ayrılmış bir sinyal profili üretti.
AP ürününün sinyali de urasil içeren substratınkinden iyi bir şekilde ayrılmıştı. MS veri analizi için tepe yükseklikleri ölçüldü. UDG aktivitesi için 0.01, 0.02, 0.05 ve 0.1'deki zaman kursu analizi hem doz hem de zaman bağımlılığını göstermiştir.
Nanomolar konsantrasyonlarda ürünün ve substratın göreceli MS sinyal yoğunlukları ile reaksiyon hızı grafiğine bir örnek burada gösterilmiştir. UDG reaksiyon hızı, saniyede üretilen AP bölgesinin nanomolleri olarak sunulur. KM ve VMAX, Lineweaver Burk arsasından hesaplandı.
MALDI-TOF kütle spektrometresi ölçülen birimi, 0.001 birimden 0.02 birime kadar tanımlanan birimle orantılıydı ve kayda değer bir belirleme katsayısı vardı. UDG aktivitesinin bir urasil glikozilaz inhibitörü tarafından inhibisyonu burada gösterilmiştir. İnhibitörün 100 pikomol varlığında, 0.05 ünite UDG'nin aktivitesi saptanamayan bir seviyeye inhibe edildi ve IC50'nin 7.6 pikomol olduğu bulundu.
AP boyutu kararsız olduğundan ve aşırı pH ve yüksek sıcaklıkta bir beta eliminasyon reaksiyonu ile hidrolize edilebildiğinden, tanımlanan süre boyunca buz üzerinde tahlil söndürme yapılmalıdır. Ayrıca, HCL'nin reaksiyon tamponunu istenen pH'a asitleştirdiğinden ve tris bazının ürün karışımını uygun şekilde nötralize ettiğinden emin olmak için bir pH metre kullanın. Bu yöntem aynı zamanda iki fonksiyonlu DNA glikozilazını analiz etmek için de değiştirilebilir.
Örneğin, U + 2 T3, formamidopirimidin DNA glikozilaz testi için uygun bir substrattır. FPG AP ligaz aktivitesinin bölünme ürünleri MALDI-TOF kütlesi ile kolayca tespit edilebilir. Bu yöntem, monofonksiyonel glikozilaz ölçümü için referans yöntem olma potansiyeline sahiptir ve farmasötik gelişim için glikozilaz inhibitörü taraması için bir araç olarak da kullanılabilir.
