Name: fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus
Uploaded: 2017-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus at JoVE.com

Bu araştırma 2014 NMSU HHMI grant #52008103 ve NSF PGR #1238731 vermek NIH grant #SC1AI109055, tarafından desteklenmiştir. NMSU bahar 2015 BIOL302 moleküler yöntemler sınıf ve Lavesh Bhatia katılımcıların yağ vücut kültür deneyleri ile teknik destek için teşekkür ediyoruz.

1. çözümler ve Kimyasalları hazırlama ağırlığında tarafından <ol><li>hisse senedi çözüm Amino asit <ol><li>hazırla 4 X bir amino asit hisse senedi çözüm 23 , 24 ve Tablo 1 ' de verilen konsantrasyonları göre bir Erlenmeyer şişesi 20 farklı amino asit ekleme. 
		Not: bazı durumlarda, amino acid(s) olabilir eriyik--dan hariç ve mannitol osmolytes eşit bir konsantrasyon korumak için eşit molar miktarda tarafından yerine.</li>
		<li>İstenen birimin çözüm üretmeye GKD 2 O uygun miktarda ekleyin.</li>
		<li>Amino asitler tamamen çözülmüş ki, emin olmak için yavaşça sıvı tamamen temizlenene kadar sürekli karıştırarak ısı; hafif bir sarı renk tonu üzerinde alacak. 
		Not: pH 6-HCl bazı çözülmeye daha hidrofobik amino asitler sağlar ekleyerek azaltmak gerekli olabilir.</li>
		<li>Aliquot çözüm ve 0.2 µm ile bir şırınga filtre kullanarak filtre-steril gözenek boyutu.</li>
		<li>-20 ° c ilâ 6 ay boyunca kapalı bir kapta mağaza.</li>
	</ol></li> <li>APS Not: bkz: 25.
	<ol><li>20 X için hisse senedi çözüm tuz, 50 mL su Tablo 2 ' de listelenen tuzları birleştirmek. Tamamen eriyene kadar karıştırın. 
		Not: Bu çözüm tuz tamamen erimesi için biraz ısıtmak gerekli olabilir.</li>
		<li>Steril-0.2 µm ile bir şırınga filtre kullanarak filtre boyutu gözenek ve çözüm -20, 50 mL tüp depolamak ° C.</li>
	</ol></li> <li>Kalsiyum hisse senedi çözüm <ol><li>50 X kalsiyum hisse senedi çözüm için Kalsiyum klorür 0,90 g 100 mL su (Tablo 3) Ekle; tamamen eriyene kadar karıştırın.</li>
		<li>Steril-filtre kullanarak bir 0.2 µm gözenek boyutu ile aliquot çözüm 50 mL tüpler içine filtre ve depolamak -20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Tris arabellek (pH 7,4) <ol><li>Tris tampon, tuz ve Tablo 4 ' te listelenmiş çözümleri birleştirmek ve GKD 2 O eklemek için ilâ 100 mL.</li>
		<li>Steril-filtre kullanarak bir 0.2 µm gözenek boyutu ve aliquot ile çözüm 50 mL tüpler içine filtre; mağaza oda sıcaklığında.</li>
	</ol></li> <li>Yağ vücut kültür orta <ol><li>yağ vücut kültür ortamı hazırlamak için yukarıda listelenen tüm çözümleri hazırlayın.</li>
		<li>200 mL yağ vücut kültür orta yapmak için Tablo 5 birimlerinde göre onları birleştirmek.</li>
		<li>PH 7.2 NaOH veya HCl kullanarak için ayarlamak.</li>
		<li>Steril-filtre 0.2 µm gözenek boyutu ile bir şırınga filtre kullanarak çözüm.</li>
		<li>Çözüm 15 mL aliquots bölmek ve 6 aya kadar saklamak-20 ° C'de.</li>
	</ol></li></ol> 2. Diseksiyon için hazırlık <ol><li>stereomicroscope (10-20 x büyütme) aydınlatma ile hazırlamak ve iki Ultra-ince cımbız ve mikro diseksiyon makası yatıyordu.</li>
	<li>Tüm çözümler deneme için gerekli hazır olun. Oda sıcaklığında yağ vücut kültür ortamına çözülme. 
	Not: Precipitants yavaşça 30'dan daha yüksek çözüm Isıtma tarafından çözülmüş ° C.</li>
	<li>Bir aspiratör ile yetişkin dişi sivrisinekler (3-7 gün sonra ortaya çıkması) toplamak ve onları anestezi karbon dioksit ya da buz kullanma 
	Not: Bir kez anestezi, sivrisinekler CO 2 altında için en kısa sürede mümkün, 20 dk. alternatif olarak geçmeyen tutulmalıdır, buza anestezi ve yaklaşık 30 dk tutulur sivrisinekler</li>
	<li>6-şey plaka ile APS 3 mL başına iyi hazırlanın.</li>
</ol> 3. Yağ vücut diseksiyon <ol><li>parçalara stereomicroscope odaklanmak ve rahat bir yükseklik için sandalye ayarlamak.</li>
	<li>Bir içbükey mikroskop slayt mikroskop yüzey üzerine yerleştirin ve APS iki damla merkezine ekleyin.</li>
	<li>Bir forseps kullanarak bir bacak tarafından bir sivrisinek kadar almak ve mikroskop slayt üzerinde APS yüzeye transfer.</li>
	<li>Dikkatle sivrisinek tarafından Toraks, sol elinde Forseps ile kavrama ve ventral tarafı yukarı doğru sivrisinek döndürür.</li>
	<li>Vücut tarafından Toraks sabit tutarken, sağ el Forseps ile son iki karın kesimleri tutun ve yavaşça çekin. 
	Not: Son iki karın kesimleri karın ve ekli yumurtalıklar, Malpighi tübüllerin, hindgut ve midgut ayrı; Bazen kırpma karın dışarı slayt. Onlar kaldırılmamış, forseps kapalı ipuçları oluşturulan küçük deliğe yerleştirin ve kalan dokular kaldırırsınız.</li>
	<li>Doğru forseps bir kenara koyun ve bahar makas al. Bir bıçak karın Toraks aşağıda segmenti kadar delik kaydırın. Yavaşça ve hızla karın uzunlamasına kesilmiş. 
	Not: kesim yapıldıktan sonra bu hemen oluşmayabilir rağmen karın dışa, genişletmek başlamalıdır.</li>
	<li>Devam yanal kesiği biraz aşağıda burada ilk kesme sona erdi ve toraks aşağıda olacak ikinci kesim yapmak. 
	Not: Karın sonra Aç ve kütikül yukarı ve yağ cesetleri yan-APS içinde dalmış Toraks dan ayırmak. Karın bu beden duvarı vitro kültür yağ vücut hazırlıktır.</li>
	<li>Forseps bir çift ucu kullanarak APS çözüm yağ vücutlarından kaldırın ve oda sıcaklığında APS içeren 6-şey plaka eriyik--dan aktarmak. Doku yağ vücut kültür ilerleyen önce yaklaşık 0,5 h için dinlenmeye izin.</li>
</ol> 4. Yağ vücut kültür <ol><li>onları equilibrate en az 0,5 h için oda sıcaklığında yağ organları APS üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Yağ cesetleri forseps ucu kullanarak transfer ve nazikçe onları dışarı APS çözüm kaldırın. Ucunu yağ vücut kültür orta düşük. 
	Not: Yağ vücut orta yüzeyinde açın ve serbestçe yüzen gerekir. Yağ vücut kültür genellikle 96-şey Kaplamalar, 150-200 µL her iyi orta ile gerçekleştirilir. Bir de en çok üç bireysel yağ organları sığabilecek, ve onlar daha 12 h (yayınlanmamış kişisel sonuçlar) uygun.</li>
	<li>Kuluçka dönemi sonra yağ cesetleri ortamından aşağı akım işleme uygun Kimyasalları içeren 1.5 mL santrifüj tüpleri içine transfer. 
	Not: Tipik analizleri qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western Blot 18 , içerir. 20, transcriptomics 26, proteomik 21 veya metabolomics 22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Benelli, G., Mehlhorn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+malaria,+rising+of+dengue+and+Zika+virus:+insights+for+mosquito+vector+control.">Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control.</a> Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).</li><li>Newby, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+to+eradication:+a+progress+report+on+the+malaria-eliminating+countries.">The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries.</a> Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).</li><li>Long, C. A., Zavala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+vaccines+and+human+immune+responses.">Malaria vaccines and human immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).</li><li>Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immune+responses+against+sexual+stages+of+malaria+parasites:+considerations+for+malaria+vaccines.">Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines.</a> Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).</li><li>Frings, S., Lindemann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+response+of+isolated+olfactory+receptor+cells+is+blocked+by+amiloride.">Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride.</a> J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).</li><li>Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GABAergic+inhibition+on+odorant+concentration+coding+in+mushroom+body+intrinsic+neurons+of+the+honeybee.">Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).</li><li>Yewhalaw, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance:+an+impediment+to+insecticide-based+malaria+vector+control+program.">Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program.</a> PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).</li><li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+fat+body:+energy,+metabolism,+and+regulation.">Insect fat body: energy, metabolism, and regulation.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).</li><li>Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W., Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. , 507-522 (1997).</li><li>Price, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fat+body+transcriptomes+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti,+pre-+and+post-+blood+meal.">The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal.</a> PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-way+regulation+of+mosquito+yolk+protein+precursor+genes+by+juvenile+hormone-,+ecdysone-,+nutrient-,+and+insulin-like+peptide+signaling+pathways.">Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways.</a> Front Physiol. 5, 103 (2014).</li><li>Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+yolk+proteins+in+insect+oocytes.">Accumulation of yolk proteins in insect oocytes.</a> Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).</li><li>Raikhel, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+mosquito+vitellogenesis:+from+basic+studies+to+genetic+engineering+of+antipathogen+immunity.">Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity.</a> Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Chandrasekar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+6.">Ch. 6.</a> Short Views on Insect Molecular Biology. , (2009).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-mediated+amino+acid+signaling+in+mosquito+anautogeny.">Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-dependent+activation+of+S6+kinase+is+a+central+step+in+the+transduction+of+nutritional+signals+during+egg+development+in+a+mosquito.">Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+cationic+amino+acid+transporters+required+for+nutritional+signaling+during+mosquito+reproduction.">Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction.</a> J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).</li><li>Carpenter, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC7+amino+acid+transporters+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti+and+their+role+in+fat+body+TOR+signaling+and+reproduction.">SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction.</a> J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).</li><li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).</li><li>Hugo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+biomarkers+for+ageing+the+mosquito+Aedes+aegypti+to+determine+risk+of+pathogen+transmission.">Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission.</a> PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).</li><li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mosquitoes,+large+implications:+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti.">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasit Vectors. 8, 252 (2015).</li><li>Uchida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+oogenesis+in+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+by+infusion+of+the+hemocoel+with+amino+acids.">Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids.</a> J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).</li><li>Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+free+amino+acid+concentration+in+the+hemolymph+of+the+female+Culex+pipiens+pallens+(Diptera:+Culicidae),+after+a+blood+meal.">Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal.</a> J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).</li><li>Hayes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+a+physiological+saline+solution+for+Aedes+aegypti+.(L).">Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L).</a> J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).</li><li>Price, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fat+Body+Transcriptomes+of+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti,+Pre-+and+Post+Blood+Meal.">The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal.</a> Plos One. 6 (7), e22573 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+technical+reports.+Modification+of+the+TRI+reagent+procedure+for+isolation+of+RNA+from+polysaccharide-and+proteoglycan-rich+sources.">Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).</li><li>Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+odorant+concentration+dependent+inhibition+controls+temporal+properties+of+spike+responses+of+projection+neurons+in+the+moth+antennal+lobe.">Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe.</a> PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).</li><li>Larsen, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+an+insect+organ+culture.">Growth in an insect organ culture.</a> J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).</li><li>Judy, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Structure,+and+Absolute+Configuration+of+a+New+Natural+Insect+Juvenile+Hormone+from+Manduca+sexta.">Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).</li><li>Marks, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+hormones+in+insect+cell+and+organ+cultures.">The action of hormones in insect cell and organ cultures.</a> Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).</li><li>Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+Wolbachia+into+Anopheles+and+Other+Insect+Germlines+in+an+Ex+vivo+Organ+Culture+System.">Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System.</a> PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).</li><li>Postlethwait, J. H., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Juvenile-Hormone+and+20-Hydroxy-Ecdysone+during+Vitellogenesis+in+Isolated+Abdomens+of+Drosophila+melanogaster.">Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster.</a> J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).</li><li>Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone-initiated+ovarian+development+in+mosquitoes.">Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes.</a> J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).</li><li>Boudko, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+transport+mechanism+of+amino-acid+transceptor+Slimfast+from+Aedes+aegypti.">Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti.</a> Nat Commun. 6, 8546 (2015).</li><li>Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+odorant+receptor+Olfr78+in+enteroendocrine+cells+of+the+colon.">Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon.</a> Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).</li><li>Jones, K. H., Senft, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+determine+cell+viability+by+simultaneous+staining+with+fluorescein+diacetate-propidium+iodide.">An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide.</a> J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).</li></ol>

İfşa etmek yok.

Böcek organ kültür kapsamlı olarak böcek Endokrinoloji, geliştirme ve metabolizma, de belirli organ ve bakteriyel simbiont29,30,31arasındaki etkileşimi araştırmak olarak çalışmaya kullanılmıştır, 32,33,34. Vitro yağ vücut organ kültür amino asit taşıma ve düzenleme sarısı protein üretiminde Sivrisinek ve diğer Diptera16,17,35 , özellikle eğitim için kullanılan , 36. vitellogenesis işlemi sırasında sivrisinek yağ vücut yüksek özgüllük amino asit taşıyıcılar dizisi kan yemek derived amino asitler sarısı proteinler12 büyük miktarlarda sentezlemek için hemolymph almak için kullanır ,19,35,36. Yağ vücut kültür yağ vücut besin gereksinimleri bu içerik18tarif için vesile oldu.
Malzeme kalitesi ve başlangıç, dişi sivrisinekler, bu deneyler başarısı için önemlidir. Kalabalık koşullarda büyüdü ve yüksek besin diyetler genellikle beslenen sivrisinek larva en iyi sonuçları üretmek. Sivrisinek yağ vücut kültür deneysel tasarım açısından laboratuvar koşullarında oluştururken göz önünde bulundurulacak bazı önemli değişken vardır. Yağ vücut gen ekspresyonu önemli ölçüde bireysel yaşam öyküsü ve Sivrisinek11,22beslenme durumuna bağlı olarak değişir önceki çalışmalarda gösterdik. Sivrisinek kültür koşulları boyutu değişkenliği azaltmak için tek tip olmalı ve deneysel sivrisinekler beslenme hakkını saklı tutar. Ayrıca, personel diseksiyonlarının gerçekleştirme hızlı ve doğru diseksiyonu ile tutarlı sonuçlar sağlamak için eğitim. Hücre canlılığı izole yağ organlarında farklı boyama yöntemleri37,38kullanarak kontrol edilebilir.
Bir yağ vücut kültür deneme deneysel tasarım diseksiyonlarının sayısı belirli bir sürede mümkün dikkate almalıdır. Bol miktarda yağ organlarının gerekli olduğunda birden çok diseksiyon oturum veya birden fazla dissectors gerekli olabilir. Sivrisinek ve diğer böceklerin vitro yağ vücut kültür için gelecekteki uygulamaları geniş bir yelpazesi vardır. Bu potansiyel ilaç adaylarının böcek kontrolü için test etmek için özellikle faydalı olacaktır. Böceklerde yağ vücut trophocytes özel muhabir proteinlerin hızlı transgenik tekniklerin kullanılması için yağ vücut Fizyoloji çalışmanın güçlü BİYOANALİZLER geliştirmek için yeni yöntemler açılacaktır.

Sivrisinekler sıtma, Dang Humması, chikungunya ve Zika1,2,3gibi yıkıcı insan hastalıkların vektörleridir. Yoğun uluslararası çabalara rağmen bu hastalıkları frenlemek için ve hastalık verici sivrisinek nüfus denetlemek için salgın sivrisinek kaynaklı hastalık salgınları özellikle gelişmekte olan ülkelerde hala sık görülür. Bu hastalıkların birçoğu karşı etkili aşı kullanılamıyor veya sınırlı etkinliği4,5. Salgınları önlemek için en etkili yolu sivrisinek nüfus, böcek ilacı tedaviler çoğunlukla aracılığıyla kontrol etmektir. Ancak, böcek ilacı direnç birçok sivrisinek nüfus geliştirmiş ve dünya6,7,8etrafında ortak bir sorun haline. Sivrisinek Fizyoloji çalışmanın yeni araçları ve stratejileri hastalık kontrol gelişimi için önemlidir.
Sivrisinek yağ vücut besin depolama, metabolik Homeostazı, üreme ve xenobiotic katabolizma9,10,11,12merkezi bir rol oynar. Trigliserid, glikojen ve içinde biçim-in depolama proteinler amino asitler için ana boru depolama organdır. Ayrıca sentezi için en hemolymph proteinler ve metabolitleri konumunu görür. Sivrisinekler, onlar bir kan yemek13,14bin sonra dişi içinde oluşan sarısı protein üretim tek kaynağı yağ organıdır.
Asıl hücre yağ vücut büyük, polyploid trophocyte veya adipocyte3,9,10,12türüdür. Yağ vücut dokusu loblari da kılıf halinde düzenlenmiştir ve Sivrisinek, tüm vücut bölgelerinde nerede büyük yağ vücut lobları karın vücut duvarına bitişik karın, bulunan en büyük kısmı ile bulunabilir.
Burada sunulan sivrisinek yağ vücut kültür sistemi 70 ' li yıllarda geliştirilmiştir ve yağ vücudun fizyolojisi10, özellikle de geçerli analizi teknolojileri ile birlikte çalışmak için güçlü bir araç olarak kalır. Bu tekniğin temeli karın vücut duvar ve ilişkili yağ vücut dokusu üzerinde yalıtım dayanmaktadır. Karın kütikül hidrofobik doğası float kültür orta yüzeyi ile ekli lobları karın yağ vücut dalmış neden olur. Kültürlü doku oksijenasyonu sağlamak vızıltısı ve tracheolar yapısı korunur. Şu andan itibaren bu hazırlıklar için "yağ organları" sevk edecektir İzole yağ organları daha 12 h (yayınlanmamış sonuçları) uygun ortamda inkübe zaman için geçerli kalır. Yağ vücut kültür yağ vücut Endokrinoloji Fizyoloji9,10,12,15,ve16ilgili sorular çeşitli ele almıştır değerli bir araçtır, 17.
Kültürlü yağ organları çeşitli deneysel tabi ve tedaviler, hangi zamanlaması üzerine araştırmacı tarafından karar verilebilir kontrol. Kuluçka dönemi sonunda, yağ organları olabilir toplanan ve qPCR16,17,18,19, Western Blot18 de dahil olmak üzere aşağı akım analizleri için işlenen ,20, proteomik21veya metabolomics22. Deneyler bireysel yağ organları birlikte kültürlü yüzlerce grupları için farklı ölçeklerde gerçekleştirilebilir.
Burada dahil temsilcisi sonuçları yağ amino asitler ve vitellogenesis16,17kan yemek aktivasyonu benzetimini yapmak için steroid hormon 20-hidroksi ecdysone huzurunda kültürlü organları elde edilmiştir, 23,24. Biz analiz ve değil harekete geçirmek yeni nesil sıralama analizi ile aktif yağ organları karşı farklı gen ifade karşılaştırılır.

<table><tbody><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fiskars</td><td>83872</td><td></td></tr><tr><td>Fly pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>789060</td><td></td></tr><tr><td>Battery-powered aspirator w/ collection vial</td><td>Hausherrs Machine Works, Inc.</td><td>3740-01-210-2368</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip forceps</td><td>World Precision Instruments, Inc.&amp;nbsp;</td><td>500085</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well plate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CL S3383</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Alanine</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>Arginine</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>Aspartic Acid</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Glutamic Acid</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucine</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Phenylalanine</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Methionine</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH8.0&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus

Böcek yağ vücut böcek metabolizma ve besin depolama, karaciğer ve yağ dokusu omurgalılar fonksiyonları yansıtma içinde merkezi bir rol oynar. Böcek yağ vücut dokusu genellikle böcek vücut boyunca dağıtılır. Ancak, genellikle karın içinde konsantre ve karın vücut duvarına bitişik.
Sivrisinek yağ yumurta üretimi için kritik olan sarısı proteinler tek kaynağı organıdır. Bu nedenle, sivrisinek fizyolojisi, çalışma için önemli bir sistem sivrisinek yağ vücut dokuları vitro kültürü temsil eden metabolizma ve sonuçta, yumurta üretimi. Yağ vücut kültür işlem çözümleri ve Kimyasalları, amino asit hisse senedi çözümleri, Aedes fizyolojik serum tuz stok solüsyonu (APS), kalsiyum hisse senedi çözüm ve yağ vücut kültür orta gibi hazırlanması ile başlar. İşlem yağ vücut diseksiyon, deneysel bir tedavi tarafından takip ile devam eder. Kullanımdan sonra farklı analizler çeşitli, RNA (RNA-Seq) sıralama, qPCR, Batı lekesi, proteomik ve metabolomics gibi gerçekleştirilir.
Örnek deneyimimizi, sarı humma Sivrisinek, Aedes aegypti, Dang, chikungunya ve Zika gibi arboviruses asıl bir vektör eksizyon ve kültür yağ organlarının protokolüyle göstermektedir. RNA yağ upregulate sarısı proteinlere karşı denetim bilinen fizyolojik durum altında kültürlü organları vardı bu yordamı gen ekspresyonu araştırmalar için potansiyel yarar göstermek için RNA-Seq analizi tabidir.

Örnek olarak, bir yağ vücut kültür deneme gerçekleştirilen ve onları tüm yirmi doğal olarak meydana gelen amino asitler ve 6 h için böcek steroid hormon 20-hidroksi ecdysone (10 µM) dengeli karışımı içeren bir çözüm üzerinde kuluçka izole yağ organları teşvik . Bir denetim olarak yağ organları zaman eşit miktarda için APS üzerinde inkübe.
Kuluçka sonra toplam RNA üreticinin yönergelerini izleyerek bir tri-reaktif27 kullanarak izole edildi. Kalite ve ayıklanan RNA örnekleri miktarı Spektrofotometre, Fluorometrik Nefelometri ve özel Jel Elektroforez kullanarak değerlendirildi. RNA sıralama kütüphaneleri toplam RNA'ın 4 µg kullanarak oluşturulan ve iki farklı teknikleri kullanarak sayılabilir. Daha sonra kütüphaneler için ticari bir sağlayıcı eşleştirilmiş sonu-sıralama için gönderildik.
Bu denemenin sonuçları Tablo 6' da gösterilen. En güçlü transkripsiyon yanıt amino asit ve 20-hydroxyecdysone gösterilen genler önceki sonuçları11ile anlaşma olduğunu öncelikle sarısı protein gen olduğunu.
Şekil 1 differentially 1.256 gen ifade düzeyini gösteren bir ısı haritası genler kültürlü yağ organları iki farklı Seanslarınızdan sonra birimiyle gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55508/55508fig1.jpg"> 
Resim 1 . Isı haritası yağ vücut kültüründe ifade edilen genlerin. Isı haritası her gen R yazılım ortamın parçası olan heatmap paket28 kullanarak farklı kitaplıklarındaki için belirli transkript sayısına göre hesaplanmıştır. Koyu gölge daha yüksek gen ekspresyonu temsil eder. istatistiksel olarak anlamlı değişim ifade ile 1,256 gen (Q-değerleri &#60; 0,05) gösterilir. Genlerin dendrogram (filogenetik ilişkilerinin göre) solda gösterilen ortalama ifade seviyelerine göre sıralanır. Genlerin Uyarım amino asitler (AA) ve 20-hydroxyecdysone (20E) sonra yukarı veya aşağı düzenlenmiş ifade ile yüksek sayısını not edin. APS Aedes fizyolojik serum =. Ek dosya 1 genlerin ve onların göreceli ifade düzeyleri listesi için bkz:. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/55508fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amino asit</td>
			<td>Molekül ağırlığı g/mol</td>
			<td>mM konsantrasyonu</td>
			<td>Litre başına mg</td>
			<td>MG 300 mL cilt için</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanin</td>
			<td>89.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>2377.19</td>
			<td>713.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginin</td>
			<td>174.2</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4647.66</td>
			<td>1394.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagine</td>
			<td>150.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4004.67</td>
			<td>1201.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartik asit</td>
			<td>133</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3548.44</td>
			<td>1064.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sistein</td>
			<td>121.16</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1293.99</td>
			<td>388.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamik asit</td>
			<td>147.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3924.63</td>
			<td>1177.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin</td>
			<td>146</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3895.28</td>
			<td>1168.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glisin</td>
			<td>75</td>
			<td>53.32</td>
			<td>3999</td>
			<td>1199.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidin</td>
			<td>155.16</td>
			<td>80</td>
			<td>12412.8</td>
			<td>3723.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>İsoleucine</td>
			<td>131</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1399.08</td>
			<td>419.72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycine</td>
			<td>183</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4882.44</td>
			<td>1464.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lösin</td>
			<td>131</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3495.08</td>
			<td>1048.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenilalanin</td>
			<td>165</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1762.2</td>
			<td>528.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolin</td>
			<td>115</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3068.2</td>
			<td>920.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serin</td>
			<td>105</td>
			<td>53.32</td>
			<td>5598.6</td>
			<td>1679.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treonin</td>
			<td>119</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1270.92</td>
			<td>381.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptofan</td>
			<td>204</td>
			<td>10.68</td>
			<td>2178.72</td>
			<td>653.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tirozin</td>
			<td>181</td>
			<td>5.32</td>
			<td>962.92</td>
			<td>288.88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valin</td>
			<td>117</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1249.56</td>
			<td>374.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metiyonin</td>
			<td>149</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1591.32</td>
			<td>477.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. 4 x hisse senedi çözüm Amino asit.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>50 ml GKD2için O eklendi gram ağırlık</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>8.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,074 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6 H2O</td>
			<td>0.120 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>0.0250 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2. 20 X tuz stok çözüm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>100 ml ddH2O eklendi gram ağırlık</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2-2 H2O</td>
			<td>0,90 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<stron></stron>g > Tablo 3. 50 x kalsiyum hisse senedi çözüm.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>Hisse senedi çözüm konsantrasyonu</td>
			<td>100 ml arabellek için birim stok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris pH8.0</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,25 M</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GKD2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>100 mL (~ 93 mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 4. Tris arabellek.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>200 ml için birim stok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino asit hisse senedi çözüm</td>
			<td>150 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hisse senedi tuz solüsyonu</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalsiyum hisse senedi çözüm</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES arabellek</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>26 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 5. Yağ vücut kültür orta.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ek açıklama</td>
			<td>Gene açıklama</td>
			<td>Kat değiştirme</td>
			<td>P-değeri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006138</td>
			<td>Vitellogenin-B</td>
			<td>3443</td>
			<td>2.52E-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006126</td>
			<td>Vitellogenin-C</td>
			<td>2795</td>
			<td>8.64E-91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006563</td>
			<td>vitellogenic Karboksipeptidaz</td>
			<td>1002</td>
			<td>2.17E-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010434</td>
			<td>Vitellogenin-A</td>
			<td>220</td>
			<td>1.14E-27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006542</td>
			<td>vitellogenic Karboksipeptidaz</td>
			<td>185</td>
			<td>2.14E-65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL012678</td>
			<td>AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%)</td>
			<td>96</td>
			<td>4.00E-70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL000080</td>
			<td>örnek protein</td>
			<td>82</td>
			<td>6.69E-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL015312</td>
			<td>Vitellogenic cathepsin B</td>
			<td>77</td>
			<td>1.27E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL009588</td>
			<td>Nükleer reseptör 3</td>
			<td>75</td>
			<td>4.58E-56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010529</td>
			<td>örnek protein</td>
			<td>66</td>
			<td>1.32E-29</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 6. Deneysel sonuçlar.
Ek dosya 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/Table_of_genes_for_figure_1.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus at JoVE.com

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Yağ vücut böceklerde Merkezi metabolik organdır. Biz izole yağ vücut dokusu yanıt çeşitli uyaranlara karşı eğitim kullanıcı sağlayan bir canlı organ kültür sistemi mevcut.

Yağ vücut Organ kültür sistemi içinde Aedes Aegypti, bir vektör Zika virüs

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

fat-body-organ-culture-system-in-aedes-aegypti-a-vector-of-zika-virus

Research

JoVE Journal

Biology

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

9.4K Görüntüleme.  New Mexico State University. Yağ vücut böceklerde Merkezi metabolik organdır. Biz izole yağ vücut dokusu yanıt çeşitli uyaranlara karşı eğitim kullanıcı sağlayan bir canlı organ kültür sistemi mevcut.

Video: Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus uyum Sistemi: Sivrisinek Vektörler Enfeksiyon görselleştirme için Araçlar

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Dang Enfeksiyonlar Sivrisinekler (A. aegypti) ve Enfeksiyon Fenotip belirlenmesi için protokol

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Biyoloji

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virüs Bulaşıcı hücre kültürü sistemine ve<em&gt; İn Vitro</emİnterferonların&gt; profilaktik etkisi

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Zika Virüsü Kullanan Aedes aegypti Sivrisineklerinde Vektör Yetkinlik Analizleri

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Aedes aegypti Sivrisinekmikrosporidian Parazit Edhazardia aedis yayılması

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Aedes aegypti Sivrisineklerinde Hayvansal Türevli Kan ve Yapay Yemeklerin Beslenmesi ve Ölçülmesi

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Yetişkin Sivrisineklerde Oral Beslenme ve Mikroenjeksiyon ile Deneysel Viral Enfeksiyon

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Aedes aegypti sivrisinek enfekte Wolbachia ile bakımını yapma

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

Salya vektör yetkinlik sivrisinek analiz etmek için bir yöntem olarak zorla

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

24 Kuyu Doku Kültürü Plakası (EAgaL Plakaları) kullanılarak Aedes aegypti için Geliştirilmiş Doğurganlık ve Doğurganlık Tahlilleri

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...