Name: fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus
Uploaded: 2017-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da grant NIH #SC1AI109055, il 2014 NMSU HHMI grant #52008103 e NSF PGR concedere #1238731. Ringraziamo i partecipanti della classe NMSU primavera 2015 BIOL302 molecolare metodi e Lavesh Bhatia, per il loro supporto tecnico con gli esperimenti di cultura del grasso corporeo.

1. preparazione delle soluzioni e dei reagenti <ol><li>soluzione di riserva dell'amminoacido <ol><li>preparare un 4 X amminoacido soluzione stock 23 , 24 di pesatura e l'aggiunta di 20 aminoacidi differenti per un matraccio di Erlenmeyer secondo le concentrazioni riportati nella tabella 1. 
		Nota: In alcuni casi, amino acid(s) possono essere esclusi dalla soluzione e sostituito da uguali quantità molare di mannitolo per mantenere una concentrazione uguale di osmolytes.</li>
		<li>Aggiungere la quantità appropriata di ddH 2 O per produrre il volume desiderato della soluzione.</li>
		<li>Per garantire che gli aminoacidi hanno completamente dissolto, scaldare leggermente, mescolando continuamente fino a quando il liquido è completamente chiaro; ci vorrà da una leggera tonalità gialla. 
		Nota: Potrebbe essere necessario ridurre il pH a 6 con l'aggiunta di HCl per consentire alcuni degli aminoacidi più idrofobi per dissolvere.</li>
		<li>Dimensione del poro aliquotare la soluzione e filtro sterile utilizzando un siringa filtro con un-0,2 µm.</li>
		<li>Store in un contenitore sigillato a-20 ° C fino a 6 mesi.</li>
	</ol></li> <li>APS Nota: vedere 25.
	<ol><li>Per 20 X soluzione stock di sale, unire i sali elencati nella tabella 2 in 50 mL di acqua. Mescolare fino a completa dissoluzione. 
		Nota: Potrebbe essere necessario riscaldare leggermente la soluzione per sciogliere completamente i sali.</li>
		<li>Filtro Sterile utilizzando un siringa filtro con un-0,2 µm dimensione dei pori e conservare la soluzione in un tubo da 50 mL a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Soluzione di riserva di calcio <ol><li>per i 50 X soluzione di riserva di calcio, aggiungere 0,90 g di cloruro di calcio per 100 mL di acqua (tabella 3); mescolare fino a completa dissoluzione.</li>
		<li>Utilizzando una siringa Sterile-filtro del filtro con un diametro dei pori da 0,2 µm, aliquota la soluzione nelle provette da 50 mL e conservare a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Tampone Tris (pH 7,4) <ol><li>per il Tris buffer, unire il sale e le soluzioni elencate in tabella 4 e aggiungere ddH 2 O fino a 100 mL.</li>
		<li>Utilizzando una siringa Sterile-filtro del filtro con un diametro dei pori da 0,2 µm e aliquota la soluzione nelle provette da 50 mL; conservare a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li> <li>Terreno di coltura di corpo grasso <ol><li>per preparare il terreno di coltura del grasso corporeo, preparare tutte le soluzioni elencate in precedenza.</li>
		<li>Combinarli secondo i volumi in tabella 5 per fare 200 mL di terreno di coltura del grasso corporeo.</li>
		<li>Aggiustare il pH a 7,2 con NaOH o HCl.</li>
		<li>Filtro Sterile la soluzione utilizzando un siringa filtro con un diametro dei pori da 0,2 µm.</li>
		<li>Dividere la soluzione in 15 mL aliquote e conservare a-20 ° C fino a 6 mesi.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparazione per la dissezione <ol><li>preparare uno stereomicroscopio (ingrandimento x 10-20) con illuminazione e stendere due pinzette ultra-sottili e un paio di forbici micro dissezione.</li>
	<li>Preparare tutte le soluzioni necessarie per l'esperimento. Scongelare il terreno di coltura di corpo grasso a temperatura ambiente. 
	Nota: Precipitanti possono essere dissolto riscaldando delicatamente la soluzione per non superiore ai 30 ° C.</li>
	<li>Con un aspiratore, raccogliere le zanzare femmina adulte (3-7 giorni dopo l'emersione) e anestetizzare li utilizzando anidride carbonica o Ice. 
	Nota: Una volta anestetizzato, le zanzare devono essere tenute sotto CO 2 per il minor tempo possibile, non superiore a 20 min. in alternativa, le zanzare possono essere anestetizzate sul ghiaccio e tenute per circa 30 min.</li>
	<li>Preparare una piastra a 6 pozzetti con 3 mL di APS per pozzetto.</li>
</ol> 3. Dissezione del corpo grasso <ol><li>lo stereomicroscopio per dissezione a fuoco e regolare la sedia ad un'altezza confortevole.</li>
	<li>Mettere un vetrino concavo sulla superficie del microscopio e aggiungere due gocce di APS al centro.</li>
	<li>Pick up una zanzara di una gamba per mezzo di un forcipe e trasferirlo sulla superficie di APS sul vetrino da microscopio.</li>
	<li>Attentamente afferrare la zanzara per il torace, con la pinza nella mano sinistra e ruotare la zanzara, in modo che il lato ventrale è verso l'alto.</li>
	<li>Tenendo il corpo costante di torace, afferrare i due ultimi segmenti addominali, con la pinza nella mano destra e tirare delicatamente. 
	Nota: Gli ultimi due segmenti addominali separerà dall'addome e l'annesso ovaie, Malpighian tubuli, del hindgut e del midgut; a volte il raccolto scivolerà fuori l'addome. Se non sono state rimosse, inserire le punte chiuse delle pinze nel piccolo foro creato e rimuovere i restanti tessuti.</li>
	<li>Accantonare la pinza destra e prendere le forbici di primavera. Infilare una lama nel foro nell'addome fino al segmento sotto il torace. Delicatamente e rapidamente tagliare longitudinalmente l'addome. 
	Nota: Una volta effettuato il taglio, l'addome dovrebbe cominciare ad espandere verso l'esterno, anche se questo potrebbe non verificarsi immediatamente.</li>
	<li>Procedere per rendere il secondo taglio, che sarà un taglio laterale sotto il torace e leggermente di sotto di dove si è concluso il primo taglio. 
	Nota: L'addome dovrebbe quindi aprire e dissociare dal torace, con la cuticola fino e i corpi di grasso lato-immersi all'interno l'APS. Questa corpo della parete addominale è la preparazione del grasso corporeo per la coltura in vitro.</li>
	<li>Sollevare i corpi grassi dalla soluzione APS con la punta di un paio di pinze e trasferirli dalla soluzione alla piastra 6 pozzetti contenenti APS a temperatura ambiente. Consentire il tessuto a riposare per circa 0,5 h prima di avanzare la cultura del grasso corporeo.</li>
</ol> 4. Cultura del grasso di corpo <ol><li>Incubare i corpi grassi su APS a temperatura ambiente per almeno 0,5 h equilibrare li.</li>
	<li>Trasferire i corpi grassi usando la punta delle pinze e sollevare delicatamente li fuori la soluzione APS. Abbassare la punta nel terreno di coltura del grasso corporeo. 
	Nota: Il grasso corporeo dovrebbe aprire sulla superficie del mezzo e galleggiare liberamente. La cultura del grasso corporeo viene in genere eseguita in piastre da 96 pozzetti, con 150-200 µ l di terreno in ciascun pozzetto. Uno ben può montare fino a tre singoli corpi grassi, e sono valide per più di 12 h (risultati personali non pubblicati).</li>
	<li>Dopo il periodo di incubazione, trasferire i corpi grassi dal mezzo in provette da 1,5 mL Centrifuga contenente i reagenti appropriati per l'elaborazione a valle. 
	Nota: Analisi tipiche includono qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western blotting 18 , 20, 26 di trascrittomica, proteomica 21 o metabolomica 22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Benelli, G., Mehlhorn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+malaria,+rising+of+dengue+and+Zika+virus:+insights+for+mosquito+vector+control.">Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control.</a> Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).</li><li>Newby, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+to+eradication:+a+progress+report+on+the+malaria-eliminating+countries.">The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries.</a> Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).</li><li>Long, C. A., Zavala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+vaccines+and+human+immune+responses.">Malaria vaccines and human immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).</li><li>Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immune+responses+against+sexual+stages+of+malaria+parasites:+considerations+for+malaria+vaccines.">Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines.</a> Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).</li><li>Frings, S., Lindemann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+response+of+isolated+olfactory+receptor+cells+is+blocked+by+amiloride.">Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride.</a> J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).</li><li>Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GABAergic+inhibition+on+odorant+concentration+coding+in+mushroom+body+intrinsic+neurons+of+the+honeybee.">Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).</li><li>Yewhalaw, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance:+an+impediment+to+insecticide-based+malaria+vector+control+program.">Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program.</a> PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).</li><li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+fat+body:+energy,+metabolism,+and+regulation.">Insect fat body: energy, metabolism, and regulation.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).</li><li>Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W., Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. , 507-522 (1997).</li><li>Price, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fat+body+transcriptomes+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti,+pre-+and+post-+blood+meal.">The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal.</a> PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-way+regulation+of+mosquito+yolk+protein+precursor+genes+by+juvenile+hormone-,+ecdysone-,+nutrient-,+and+insulin-like+peptide+signaling+pathways.">Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways.</a> Front Physiol. 5, 103 (2014).</li><li>Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+yolk+proteins+in+insect+oocytes.">Accumulation of yolk proteins in insect oocytes.</a> Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).</li><li>Raikhel, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+mosquito+vitellogenesis:+from+basic+studies+to+genetic+engineering+of+antipathogen+immunity.">Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity.</a> Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Chandrasekar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+6.">Ch. 6.</a> Short Views on Insect Molecular Biology. , (2009).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-mediated+amino+acid+signaling+in+mosquito+anautogeny.">Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-dependent+activation+of+S6+kinase+is+a+central+step+in+the+transduction+of+nutritional+signals+during+egg+development+in+a+mosquito.">Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+cationic+amino+acid+transporters+required+for+nutritional+signaling+during+mosquito+reproduction.">Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction.</a> J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).</li><li>Carpenter, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC7+amino+acid+transporters+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti+and+their+role+in+fat+body+TOR+signaling+and+reproduction.">SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction.</a> J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).</li><li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).</li><li>Hugo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+biomarkers+for+ageing+the+mosquito+Aedes+aegypti+to+determine+risk+of+pathogen+transmission.">Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission.</a> PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).</li><li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mosquitoes,+large+implications:+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti.">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasit Vectors. 8, 252 (2015).</li><li>Uchida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+oogenesis+in+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+by+infusion+of+the+hemocoel+with+amino+acids.">Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids.</a> J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).</li><li>Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+free+amino+acid+concentration+in+the+hemolymph+of+the+female+Culex+pipiens+pallens+(Diptera:+Culicidae),+after+a+blood+meal.">Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal.</a> J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).</li><li>Hayes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+a+physiological+saline+solution+for+Aedes+aegypti+.(L).">Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L).</a> J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).</li><li>Price, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fat+Body+Transcriptomes+of+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti,+Pre-+and+Post+Blood+Meal.">The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal.</a> Plos One. 6 (7), e22573 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+technical+reports.+Modification+of+the+TRI+reagent+procedure+for+isolation+of+RNA+from+polysaccharide-and+proteoglycan-rich+sources.">Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).</li><li>Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+odorant+concentration+dependent+inhibition+controls+temporal+properties+of+spike+responses+of+projection+neurons+in+the+moth+antennal+lobe.">Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe.</a> PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).</li><li>Larsen, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+an+insect+organ+culture.">Growth in an insect organ culture.</a> J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).</li><li>Judy, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Structure,+and+Absolute+Configuration+of+a+New+Natural+Insect+Juvenile+Hormone+from+Manduca+sexta.">Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).</li><li>Marks, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+hormones+in+insect+cell+and+organ+cultures.">The action of hormones in insect cell and organ cultures.</a> Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).</li><li>Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+Wolbachia+into+Anopheles+and+Other+Insect+Germlines+in+an+Ex+vivo+Organ+Culture+System.">Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System.</a> PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).</li><li>Postlethwait, J. H., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Juvenile-Hormone+and+20-Hydroxy-Ecdysone+during+Vitellogenesis+in+Isolated+Abdomens+of+Drosophila+melanogaster.">Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster.</a> J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).</li><li>Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone-initiated+ovarian+development+in+mosquitoes.">Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes.</a> J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).</li><li>Boudko, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+transport+mechanism+of+amino-acid+transceptor+Slimfast+from+Aedes+aegypti.">Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti.</a> Nat Commun. 6, 8546 (2015).</li><li>Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+odorant+receptor+Olfr78+in+enteroendocrine+cells+of+the+colon.">Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon.</a> Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).</li><li>Jones, K. H., Senft, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+determine+cell+viability+by+simultaneous+staining+with+fluorescein+diacetate-propidium+iodide.">An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide.</a> J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).</li></ol>

Non abbiamo nulla di divulgare.

Cultura di organo insetto fu ampiamente utilizzato per lo studio di Endocrinologia dell'insetto, sviluppo e metabolismo, nonché di studiare l'interazione tra organi specifici e batteri simbionti29,30,31, 32,33,34. In vitro coltura di organo di grasso corporeo è stato utilizzato specificamente per studiare il trasporto dell'aminoacido e la regolazione della produzione di proteine di tuorlo in zanzare e altri Ditteri16,17,35 , 36. durante il processo di vitellogenesi, il corpo di grasso di zanzara utilizza una matrice di amminoacidi di alta specificità per importare il pasto di sangue-derivati di aminoacidi da emolinfa di sintetizzare grandi quantità di tuorlo proteine12 ,19,35,36. Cultura del grasso corporeo era strumentale alla delineazione dei requisiti nutrizionali del grasso corporeo in questo contesto18.
La qualità della materia prima, le zanzare femmina, è fondamentale per il successo di questi esperimenti. Larve di zanzara, allevati in condizioni di sotto-affollata e alimentati le diete alto-sostanza nutriente di solito producono i migliori risultati. Ci sono alcune importanti variabili da considerare quando si stabilisce condizioni di coltura del grasso corporeo di zanzara in laboratorio in termini di disegno sperimentale. Abbiamo dimostrato in studi precedenti che l'espressione genica del grasso corporeo varia significativamente a seconda della storia di vita individuale e lo stato nutrizionale di zanzara11,22. Le condizioni della coltura zanzara dovrebbero essere uniforme per ridurre la variabilità delle dimensioni e nutrizionali si riserva delle zanzare sperimentale. Inoltre, personale che esegue le dissezioni dovrebbero essere addestrato per garantire le dissezioni rapide e precise con i risultati costanti. Attuabilità delle cellule in corpi isolati di grasso può essere controllato tramite diverse colorazione metodi37,38.
Il disegno sperimentale di un esperimento di cultura del grasso corporeo dovrebbe prendere in considerazione il numero delle dissezioni possibili in un dato periodo di tempo. Quando sono necessarie grandi quantità di corpi grassi, più sessioni di dissezione o dissettori multipli possono essere necessari. C'è una vasta gamma di applicazioni future in vitro del grasso corporeo cultura in zanzare e altri insetti. Sarà particolarmente utile per testare potenziali farmaci candidati per controllo di insetto. L'uso di tecniche transgeniche negli insetti di esprimere proteine reporter specifici nel corpo grasso trophocytes aprirà nuovi metodi per sviluppare potenti analisi biologiche per lo studio della fisiologia del corpo grasso.

Le zanzare sono vettori di malattie umane devastanti, tra cui la malaria, la febbre dengue, chikungunya e Zika1,2,3. Nonostante gli sforzi internazionali intensi per frenare queste malattie e per controllare le popolazioni di zanzara trasmette la malattia, scoppi epidemici di malattie trasmesse dalle zanzare sono ancora comuni, soprattutto nei paesi in via di sviluppo. Vaccini efficaci contro molte di queste malattie sono disponibili o di efficacia limitata4,5. Il modo più efficace per prevenire focolai è quello di controllare le popolazioni di zanzare, soprattutto attraverso l'uso di trattamenti insetticidi. Tuttavia, resistenza agli insetticidi ha sviluppato in molte popolazioni di zanzare e diventato un problema comune in tutto il mondo6,7,8. Lo studio della fisiologia di zanzara è essenziale per lo sviluppo di nuovi strumenti e strategie per controllare la malattia.
Il corpo di grasso di zanzara svolge un ruolo centrale nel deposito dei nutrienti, omeostasi metabolica, riproduzione e xenobiotici catabolismo9,10,11,12. È l'organo principale di deposito per i trigliceridi, glicogeno e aminoacidi in forma di proteine di deposito. Funziona inoltre come la posizione di sintesi per la maggior parte delle proteine di emolinfa e metaboliti. Nelle zanzare, il grasso corporeo è l'unica fonte di produzione di proteine di tuorlo che si verifica nelle femmine dopo prendono un pasto di sangue13,14.
Il tipo delle cellule principali del corpo grasso è la trophocyte grande, poliploidi o del adipocyte3,9,10,12. Tessuto grasso corporeo è organizzato in lobi o guaine e può essere trovato in tutte le parti del corpo della zanzara, con la più grande parte situata nell'addome, dove grandi lobi di grasso corporeo sono attaccati alla parete addominale del corpo.
Il sistema di cultura del corpo grasso zanzara presentato qui è stato sviluppato negli anni ' 70 e rimane un potente strumento per lo studio della fisiologia grasso corpo10, specialmente in combinazione con le attuali tecnologie di analisi. La Fondazione di questa tecnica è basata sull'isolamento delle pareti addominali corpo e tessuto grasso associato. La natura idrofobica della cuticola addominale induce a galleggiare sulla superficie del terreno di coltura, con i lobi associati del corpo grasso addominale immersi. La struttura tracheolar e gli spiracoli sono tenute, garantendo l'ossigenazione del tessuto coltivato. D'ora in poi, si farà riferimento a queste preparazioni come "corpi grassi." Corpi di grasso isolati rimangono vitali per più di 12 h quando incubate nel mezzo appropriato (dati non pubblicati). Cultura del grasso corporeo è uno strumento prezioso che ha affrontato una serie di domande per quanto riguarda il corpo grasso endocrinologia e fisiologia9,10,12,15,16, 17.
Corpi grassi coltivati possono essere sottoposti a vari sperimentale e controllo trattamenti, la tempistica di cui può essere decisa dallo sperimentatore. Alla fine del periodo d'incubazione, i corpi di grasso possono essere raccolti ed elaborati per analisi successive, tra cui qPCR16,17,18,19, Western blotting18 ,20, proteomica21o22di metabolomica. Esperimenti possono essere eseguiti su scale diverse, da singoli corpi grassi a gruppi di centinaia che possa essere coltivate insieme.
I risultati rappresentativi inclusi in questa sezione sono stati derivati da corpi grassi coltivati in presenza di aminoacidi e l'ecdisone 20-idrossi ormone steroide per simulare l'attivazione di pasto di sangue di vitellogenesi16,17, 23,24. Abbiamo analizzato e confrontato l'espressione genica differenziale di non-attivato contro corpi grassi attivati attraverso l'analisi di sequenziamento di nuova generazione.

<table><tbody><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fiskars</td><td>83872</td><td></td></tr><tr><td>Fly pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>789060</td><td></td></tr><tr><td>Battery-powered aspirator w/ collection vial</td><td>Hausherrs Machine Works, Inc.</td><td>3740-01-210-2368</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip forceps</td><td>World Precision Instruments, Inc.&amp;nbsp;</td><td>500085</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well plate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CL S3383</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Alanine</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>Arginine</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>Aspartic Acid</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Glutamic Acid</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucine</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Phenylalanine</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Methionine</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH8.0&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus

Il corpo di grasso insetto svolge un ruolo centrale nel metabolismo dell'insetto e deposito dei nutrienti, funzioni del fegato e tessuto adiposo nei vertebrati di mirroring. Insetto grasso corpo tessuto di solito è distribuito in tutto il corpo dell'insetto. Tuttavia, è spesso concentrata nell'addome e collegato alla parete addominale del corpo.
Il corpo di grasso di zanzara è l'unica fonte di proteine di tuorlo, che sono critici per la produzione di uova. Di conseguenza, la cultura in vitro dei tessuti del corpo grasso di zanzara rappresenta un importante sistema per lo studio della fisiologia di zanzara, metabolismo e, in definitiva, la produzione di uova. Il processo di cultura del corpo grasso inizia con la preparazione di soluzioni e reagenti, incluse soluzioni di riserva dell'amminoacido Aedes soluzione fisiologica salina (APS), soluzione di riserva di calcio e terreno di coltura del grasso corporeo. Il processo continua con la dissezione del grasso corporeo, seguita da un trattamento sperimentale. Dopo il trattamento, può essere eseguita una varietà di diverse analisi, tra cui RNA (RNA-Seq) di sequenziamento, qPCR, Western blot, proteomica e metabolomica.
Nel nostro esperimento di esempio, dimostriamo il protocollo tramite l'asportazione e la cultura dei corpi grassi dalla zanzara di febbre gialla, Aedes aegypti, una principale vettore di arbovirus incluse Zika dengue e chikungunya. RNA da corpi grassi coltivate sotto una condizione fisiologica nota alle proteine di tuorlo upregulate contro il controllo sono stati oggetto di analisi di RNA-Seq per dimostrare la potenziale utilità di questa procedura per le indagini dell'espressione genica.

Ad esempio, abbiamo eseguito un esperimento di cultura del grasso corporeo e stimolato corpi grassi isolati da incubarle in una soluzione contenente una miscela equilibrata di tutti i venti amminoacidi naturali e l'ecdisone 20-idrossi insetto dell'ormone steroide (10 µM) per 6 h . Come controllo, corpi grassi sono stati incubati su APS per un uguale periodo di tempo.
Dopo l'incubazione, il RNA totale è stato isolato mediante un tri-reagente27 seguendo le istruzioni del produttore. La qualità e la quantità di campioni di RNA estratti sono stati valutati utilizzando un spettrofotometro, fluorometrica e l'elettroforesi del gel dell'agarosi. Librerie di sequenziamento di RNA sono state generate utilizzando 4 µ g di RNA totale e sono state quantificate utilizzando due tecniche differenti. Successivamente, le librerie sono state inviate a un provider commerciale per fine-sequenziamento accoppiato.
I risultati di questo esperimento sono riportati nella tabella 6. Geni che mostra la più forte risposta trascrizionale dell'aminoacido e 20-hydroxyecdysone erano principalmente tuorlo geni della proteina, che è in accordo con precedenti risultati11.
La figura 1 Mostra una mappa di calore che indica i livelli di espressione genica di 1.256 differenzialmente espressi geni da corpi grassi coltivati dopo due trattamenti diversi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55508/55508fig1.jpg"> 
Figura 1 . Mappa di calore di geni espressi nella cultura del grasso corporeo. La mappa di calore è stata calcolata in base al numero di specifici trascritti per ogni gene in librerie diverse utilizzando heatmap pacchetto28 che è parte dell'ambiente software R. La tonalità più scura rappresenta la maggiore espressione del gene. 1.256 geni con variazione statisticamente significativa nell'espressione (valori di Q &#60; 0.05) vengono visualizzati. I geni sono ordinati secondo i loro livelli di espressione media, indicati dal dendrogramma sulla sinistra (non secondo il loro relazioni filogenetiche). Si noti l'elevato numero di geni con espressione up - o down-regolati dopo stimolazione con gli aminoacidi (AA) e 20-hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes fisiologica. Per un elenco dei geni e dei loro livelli di espressione relativa, vedere Supplemental File 1 . <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/55508fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminoacido</td>
			<td>Peso molecolare g/mol</td>
			<td>mM concentrazione</td>
			<td>mg per litro</td>
			<td>mg per 300 mL di volume</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanina</td>
			<td>89.1</td>
			<td>26,68</td>
			<td>2377.19</td>
			<td>713.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginina</td>
			<td>174,2</td>
			<td>26,68</td>
			<td>4647.66</td>
			<td>1394.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagina</td>
			<td>150.1</td>
			<td>26,68</td>
			<td>4004.67</td>
			<td>1201.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido aspartico</td>
			<td>133</td>
			<td>26,68</td>
			<td>3548.44</td>
			<td>1064.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisteina</td>
			<td>121,16</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1293.99</td>
			<td>388,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acido glutammico</td>
			<td>147.1</td>
			<td>26,68</td>
			<td>3924.63</td>
			<td>1177.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammina</td>
			<td>146</td>
			<td>26,68</td>
			<td>3895.28</td>
			<td>1168.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glicina</td>
			<td>75</td>
			<td>53.32</td>
			<td>3999</td>
			<td>1199.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Istidina</td>
			<td>155,16</td>
			<td>80</td>
			<td>12412.8</td>
			<td>3723.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucina</td>
			<td>131</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1399.08</td>
			<td>419.72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lisina</td>
			<td>183</td>
			<td>26,68</td>
			<td>4882.44</td>
			<td>1464.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucina</td>
			<td>131</td>
			<td>26,68</td>
			<td>3495.08</td>
			<td>1048.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fenilalanina</td>
			<td>165</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1762.2</td>
			<td>528.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolina</td>
			<td>115</td>
			<td>26,68</td>
			<td>3068.2</td>
			<td>920.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serina</td>
			<td>105</td>
			<td>53.32</td>
			<td>5598.6</td>
			<td>1679.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treonina</td>
			<td>119</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1270.92</td>
			<td>381.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triptofano</td>
			<td>204</td>
			<td>10.68</td>
			<td>2178.72</td>
			<td>653.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tirosina</td>
			<td>181</td>
			<td>5,32</td>
			<td>962.92</td>
			<td>288.88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valina</td>
			<td>117</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1249.56</td>
			<td>374.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metionina</td>
			<td>149</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1591.32</td>
			<td>477.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1. 4 x soluzione stock dell'aminoacido.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Peso in grammi 50 ml ddH2O aggiunti</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>8,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,074 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6 H2O</td>
			<td>0,120 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>0,0250 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 2. 20 X sale soluzione stock.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Peso in grammi aggiunti a 100 ml ddH2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2-2 H2O</td>
			<td>0,90 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<stron></stron>g &gt; tabella 3. 50 x soluzione stock calcio.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Concentrazione della soluzione di riserva</td>
			<td>Stock volume 100 ml di tampone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris pH8.0</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,25 M</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>NA</td>
			<td>0,3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>a 100 mL (~ 93 mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 4. Tampone Tris.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Stock volume 200ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soluzione di riserva dell'amminoacido</td>
			<td>150 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soluzione di riserva di sale</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soluzione di riserva di calcio</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer TES</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>26 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 5. Terreno di coltura del grasso corporeo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annotazione</td>
			<td>Descrizione del gene</td>
			<td>Piegare il cambiamento</td>
			<td>Valore di P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006138</td>
			<td>Vitellogenina-B</td>
			<td>3443</td>
			<td>2.52E-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006126</td>
			<td>Vitellogenina-C</td>
			<td>2795</td>
			<td>8.64E-91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006563</td>
			<td>vitellogeniche carbossipeptidasi</td>
			<td>1002</td>
			<td>2.17E-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010434</td>
			<td>Vitellogenina-A</td>
			<td>220</td>
			<td>1.14E-27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006542</td>
			<td>vitellogeniche carbossipeptidasi</td>
			<td>185</td>
			<td>2.14E-65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL012678</td>
			<td>AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%)</td>
			<td>96</td>
			<td>4.00 E-70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL000080</td>
			<td>proteina ipotetica</td>
			<td>82</td>
			<td>6.69E-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL015312</td>
			<td>Vitellogeniche catepsina B</td>
			<td>77</td>
			<td>1.27E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL009588</td>
			<td>recettore nucleare 3</td>
			<td>75</td>
			<td>4.58E-56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010529</td>
			<td>proteina ipotetica</td>
			<td>66</td>
			<td>1.32E-29</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 6. Risultati sperimentali.
File supplementare 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/Table_of_genes_for_figure_1.xlsx" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus at JoVE.com

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Il grasso corporeo è l'organo metabolico centrale negli insetti. Vi presentiamo un sistema di cultura dal vivo organo che consente all'utente di studiare le risposte del corpo grasso isolato tessuto ai vari stimoli.

Sistema di coltura di organo del grasso corporeo in Aedes Aegypti, vettore di Virus di Zika

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

fat-body-organ-culture-system-in-aedes-aegypti-a-vector-of-zika-virus

Research

JoVE Journal

Biology

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

9.4K Views.  New Mexico State University. Il grasso corporeo è l'organo metabolico centrale negli insetti. Vi presentiamo un sistema di cultura dal vivo organo che consente all'utente di studiare le risposte del corpo grasso isolato tessuto ai vari stimoli.

Video: Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Sistema alfavirus trasduzione: Strumenti per la visualizzazione di infezione in Vettori Mosquito

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocollo per la dengue in Zanzare (A. aegypti) e Fenotipo Determinazione infezione

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Biologia

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la<em&gt; In Vitro</em&gt; Effetto profilattico di interferoni

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Propagazione del parassita microsporidiano Edhazardia aedis nelle zanzare Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Alimentazione e quantificazione del sangue di origine animale e dei pasti artificiali nelle zanzare Aedes aegypti

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Infezione virale sperimentale nelle zanzare adulte mediante alimentazione orale e microiniezione

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

Costretto la salivazione come un metodo per analizzare la competenza vettoriale delle zanzare

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Test migliorato di fecondità e fertilità per Aedes aegypti utilizzando 24 piastre di coltura dei tessuti dei pozzi (piastre EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...