Name: fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus
Uploaded: 2017-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
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Diese Forschung wurde von NIH Grant #SC1AI109055, unterstützt die 2014 NMSU HHMI Grant #52008103 und NSF PGR gewähren #1238731. Wir danken die Teilnehmern der Klasse NMSU Frühjahr 2015 BIOL302 molekulare Methoden und Lavesh Bhatia für ihre technische Unterstützung mit den fetten Körper-Kultur-Experimenten.

1. Vorbereitung der Lösungen und Reagenzien <ol><li>Aminosäure-Stammlösung <ol><li>Prepare a 4 X Aminosäure-Stammlösung 23 , 24 durch Wiegen und ein Erlenmeyerkolben gemäß den in Tabelle 1 angegebenen Konzentrationen 20 verschiedene Aminosäuren hinzugefügt. 
		Hinweis: In einigen Fällen Amino acid(s) kann die Lösung ausgeschlossen und durch ersetzt werden gleiche molare Mengen von Mannit, einen gleichen Konzentration von Osmolyten beizubehalten.</li>
		<li>Fügen Sie die entsprechende Menge an DdH 2 O, das gewünschte Volumen der Lösung zu produzieren.</li>
		<li>Um sicherzustellen, dass die Aminosäuren vollständig aufgelöst haben, erhitzen schonend und ständig rühren, bis die Flüssigkeit vollständig klar ist, es wird auf einen leichten gelben Farbton nehmen. 
		Hinweis: Es möglicherweise erforderlich, den pH-Wert auf 6 zu reduzieren, durch Zugabe von HCl um einige der mehr hydrophobe Aminosäuren auflösen können.</li>
		<li>Aliquot der Lösung und Sterilfilter mit einer Spritze-Filter mit einer 0,2 µm Porengröße.</li>
		<li>Store in einem verschlossenen Behälter bei-20 ° C bis zu 6 Monate.</li>
	</ol></li> <li>APS Hinweis: 25 zu sehen.
	<ol><li>Für die 20 X Salz-Stammlösung, kombinieren die Salze in 50 mL Wasser in Tabelle 2 aufgeführt. Rühren, bis aufgelöst. 
		Hinweis: Es möglicherweise erforderlich, die Lösung, um vollständig die Salze lösen sich leicht erwärmen.</li>
		<li>Steril-Filter mit einer Spritze-Filter mit einer 0,2 µm Porengröße und speichern Sie die Lösung in einen 50-mL-Tube bei-20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Kalzium-Stammlösung <ol><li>für die 50 X Kalzium-Stammlösung, 100 mL Wasser (Tabelle 3) 0,90 g Calciumchlorid hinzufügen; rühren vollständig aufgelöst.</li>
		<li>Steril-Filter mit einer Spritze mit einer 0,2 µm Porengröße, aliquoten die Lösung in 50 mL Röhrchen zu filtern und Lagerung bei-20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Tris-Puffer (pH 7,4) <ol><li>der Tris Puffer, das Salz und die in Tabelle 4 aufgeführten Lösungen zu kombinieren und fügen DdH 2 O bis 100 mL.</li>
		<li>Mit einer Spritze steril-Filter Filtern mit 0,2 µm Porengröße und aliquoten die Lösung in 50 mL Röhrchen; bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol></li> <li>Fetten Körper Kulturmedium <ol><li>um das Kulturmedium fetten Körper vorzubereiten, bereiten Sie alle oben aufgeführten Lösungen.</li>
		<li>Kombinieren sie nach Volumen in Tabelle 5 bis 200 mL Kulturmedium fetten Körper machen.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert auf 7.2 mit NaOH oder HCl.</li>
		<li>Steril-Filter die Lösung unter Verwendung eines Spritze-Filters mit einer Porengröße von 0,2 µm.</li>
		<li>Die Lösung in 15-mL-aliquoten teilen und bei-20 ° C bis zu 6 Monate zu speichern.</li>
	</ol></li></ol> 2. Vorbereiten der Dissektion <ol><li>bereiten ein Stereomikroskop (10-20 X Vergrößerung) mit Beleuchtung und legen Sie zwei ultra-feine Pinzette und Schere Mikro Dissektion.</li>
	<li>Bereiten Sie alle Lösungen für das Experiment notwendig. Die fetten Körper Nährmedium auf Zimmertemperatur auftauen. 
	Hinweis: Fällungsmitteln können aufgelöst werden, durch sanft Erhitzen der Lösung nicht höher als 30 ° c</li>
	<li>Mit einer Absauganlage, Erwachsene weibliche Stechmücken (3-7 Tage nach dem Aufgang) zu sammeln und sie zu betäuben mit Kohlendioxid oder Ice 
	Hinweis: Einmal betäubt, die Mücken sollten ständig CO 2 für die kürzeste Zeit möglich, nicht länger als 20 min. Alternativ, die Mücken können auf dem Eis betäubt und hielt für ca. 30 min.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 6-Well-Platte mit 3 mL APS pro Bohrloch.</li>
</ol> 3. Fetten Körper Dissektion <ol><li>sezierenden Stereomikroskop zu konzentrieren und stellen Sie den Stuhl auf eine komfortable Höhe.</li>
	<li>Stellen einen konkaven Objektträger auf die Mikroskop-Oberfläche und zwei Tropfen des APS ins Zentrum.</li>
	<li>Heben Sie eine Mücke, indem ein Bein mit einer Pinzette und überträgt es auf das APS-Oberfläche auf dem Objektträger.</li>
	<li>Sorgfältig die Mücke durch den Brustkorb mit der Zange in der linken Hand greifen und die Mücke zu drehen, so dass der Bauchseite nach oben ist.</li>
	<li>Halten den Körper stetig durch den Brustkorb, die letzten zwei Abdominalsegmente mit der Zange in der rechten Hand greifen und ziehen. 
	Hinweis: Die letzten zwei Abdominalsegmente werden von den Bauch und den angeschlossenen Eierstöcke Malpighian Tubuli, Enddarm und Mitteldarm zu trennen; Manchmal wird die Ernte aus dem Bauch gleiten. Wenn sie nicht entfernt wurden, legen Sie die geschlossenen Spitzen der Zange in das kleine Loch erstellt und das übrige Gewebe zu entfernen.</li>
	<li>Die richtige Zange beiseite und holen den Frühling-Schere. Schieben Sie eine Klinge in das Loch in den Bauch bis zu Segment unter den Brustkorb. Sanft und schnell schneiden Sie den Bauch längs. 
	Hinweis: Sobald der Schnitt gemacht hat, der Bauch sollten anfangen, nach außen erweitern obwohl dies nicht sofort auftreten kann.</li>
	<li>Fahren Sie mit den zweiten Schnitt machen einen seitlichen Schnitt unter der Brust und leicht unter dem erste Schnitt beendet werden. 
	Hinweis: Der Bauch sollte dann eröffnen und distanziert sich ausdrücklich von den Brustkorb mit der Kutikula, und das Fett stellen Seite inmitten der APS. Dieser Körper Bauchdecke ist die fetten Körper Vorbereitung für in-vitro- Kultur.</li>
	<li>Heben die Fett-Körper aus der APS-Lösung, mit der Spitze eines Paares von Zangen und übertragen Sie sie von der Lösung auf die 6-Well-Platte mit APS bei Raumtemperatur. Das Gewebe ca. 0,5 h ruhen bevor voran, um die fetten Körperkultur ermöglichen.</li>
</ol> 4. Fett-Body Culture <ol><li>brüten die Fett Körper auf APS bei Raumtemperatur mindestens 0,5 h zu ihnen equilibrate.</li>
	<li>Übertragen die Fett stellen mit der Spitze der Zange und heben Sie sie vorsichtig aus der APS-Lösung. Senken Sie die Spitze in das Fett des Körpers Kulturmedium. 
	Hinweis: Sollte der Körper Fett auf der Oberfläche des Mediums öffnen und frei schweben. Die fetten Körperkultur erfolgt in der Regel in 96-Well-Platten, mit 150-200 µL Medium in jede Vertiefung. Man kann gut passen bis zu drei einzelnen Fett Körper, und sie sind für mehr als 12 h (unveröffentlichte persönliche Ergebnisse).</li>
	<li>Nach der Inkubationszeit der Körper Fett aus dem Medium in 1,5 mL Zentrifuge Röhrchen mit den entsprechenden Reagenzien für downstream-Processing übertragen. 
	Hinweis: Typische Analysen umfassen qPCR 16 , 17 , 18 , 19, Western Blot- 18 , 20, Transkriptom 26, Proteomics 21 oder Metabolomik 22.</li>
</ol>

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Insekt Orgel Kultur wurde ausgiebig verwendet, um Insekten Endokrinologie, Entwicklung und Stoffwechsel sowie die Interaktion zwischen bestimmten Organen und bakteriellen Symbionten29,30,31untersuchen zu studieren, 32,33,34. In-vitro- fetten Körper Orgel Kultur diente speziell auf Aminosäure-Transport und die Regulierung der Dotter Proteinproduktion in Mücken und andere Dipteren16,17,35 studieren , 36. während des Prozesses der Vitellogenesis, der Moskito fetten Körper verwendet ein Array von hoher Spezifität Aminosäure-Transporter Blutmahlzeit stammenden Aminosäuren aus der Hämolymphe, große Mengen von Eigelb Eiweiß12 zu synthetisieren importieren ,19,35,36. Fetten Körperkultur war maßgeblich für die Abgrenzung von den fetten Körper ernährungsphysiologischen Bedarf in diesem Zusammenhang18.
Die Qualität des Ausgangsmaterials, weibliche Stechmücken ist entscheidend für den Erfolg dieser Experimente. Mückenlarven unter-überfüllt Bedingungen aufgewachsen und in der Regel mit hohen Nährstoff Diäten gefüttert produzieren die besten Ergebnisse. Es gibt einige wichtigen Variablen, die bei der Mücke fetten Körper Kulturbedingungen im Labor in Bezug auf die Versuchsanordnung zur Gründung. Wir zeigten in früheren Studien, die fetten Körper Genexpression erheblich je nach der individuellen Lebensgeschichte und Ernährungszustand der Mücke11,22 variiert. Die Moskito-Kulturbedingungen, die Variabilität in der Größe zu reduzieren einheitlich sein und Ernährung behält sich der experimentellen Moskitos. Darüber hinaus sollten Personal, das die Sezierungen geschult werden, um eine schnelle und genaue Sezierungen mit konsistenten Ergebnissen zu gewährleisten. Zellviabilität in isolierten Fett Körper kann mit verschiedenen befleckenden Methoden37,38geprüft werden.
Die experimentelle Gesamtplanung eines fetten Körper-Kultur-Experiments sollte die Anzahl der Sektionen in einem bestimmten Zeitraum möglich berücksichtigen. Wenn große Mengen an Fett Körper erforderlich sind, können mehrere Sitzungen der Dissektion oder mehrere Dissectors nötig sein. Es gibt eine Vielzahl künftiger Anwendungen für in-vitro- Fett Körperkultur in Mücken und andere Insekten. Es werden vor allem nützlich für die Prüfung potenzieller Wirkstoffkandidaten für Schädlingsbekämpfung. Die Verwendung von transgenen Techniken bei Insekten, spezifische Reporter Proteine im Körper Fett Trophocytes auszudrücken öffnet sich neue Methoden, um leistungsstarke Bioassays für das Studium der Physiologie der fetten Körper zu entwickeln.

Mücken sind Überträger von verheerenden menschlichen Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika1,2,3. Trotz intensiver internationaler Bemühungen zur Eindämmung dieser Krankheiten und Krankheit-übertragende Mücke Bevölkerung zu kontrollieren sind epidemische Ausbrüche von Moskitos übertragenen Krankheiten immer noch üblich, vor allem in den Entwicklungsländern. Wirksame Impfstoffe gegen viele dieser Krankheiten sind entweder nicht verfügbar oder der begrenzten Wirksamkeit4,5. Der effektivste Weg, um Ausbrüche zu verhindern ist, Moskito-Bevölkerung, vor allem durch den Einsatz von Insektizid-Behandlungen zu kontrollieren. Jedoch Insektizid Widerstand in vielen Moskito-Populationen entwickelt und zu einem gemeinsamen Problem rund um die Welt6,7,8geworden. Die Studie der Moskito Physiologie ist wesentlich für die Entwicklung neuartiger Werkzeuge und Strategien zur Seuchenbekämpfung.
Die Mücke fetten Körper spielt eine zentrale Rolle in der Nährstoffspeicherung, metabolische Homöostase, Reproduktion und Xenobiotika Katabolismus9,10,11,12. Es ist der Hauptspeicher Organ für Triglyceride, Glykogen und Aminosäuren in Form von Speicherproteinen. Es dient auch als Ort der Synthese für die meisten Hämolymphe Proteinen und Metaboliten. In Mücken ist die fetten Körper die einzige Quelle der Eigelb-Protein-Produktion, die bei Frauen auftritt, nachdem sie eine Blutmahlzeit13,14statt.
Die wichtigsten Zelltyp des Körpers Fett ist die große, polyploid Trophocyte oder Adipocyte3,9,10,12. Fett Körpergewebe gliedert sich in Lappen oder Hüllen und finden Sie in alle Körperteile der Mücke, wobei der größte Teil befindet sich in der Bauchhöhle, wo große Lappen der fetten Körper an der Bauchwand Körper befestigt sind.
Die Mücke fetten Körper Kultursystem hier vorgestellten entstand in den 70er und bleibt ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung von fetten Körper Physiologie10, insbesondere in Kombination mit aktuellen Technologien. Die Grundlage dieser Technik basiert auf der Isolierung der Bauch Körper Wände und die damit verbundenen Fett Körpergewebe. Des hydrophoben Charakters der Abdominal-Nagelhaut verursacht es zu schweben auf der Oberfläche des Kulturmediums, mit den beigefügten Lappen der Abdominal-Fett Körper eingetaucht. Die Luftlöcher und tracheolar Struktur sind gepflegt, Sauerstoffversorgung des kultivierten Gewebes zu gewährleisten. Fortan verweisen wir auf diese Präparate als"Fett". Isolierte Fett Körper bleiben für mehr als 12 h wenn in das entsprechende Medium (unveröffentlichte Ergebnisse) inkubiert. Fetten Körperkultur ist ein wertvolles Werkzeug, das eine Vielzahl von Fragen zu fetten Körper Endokrinologie und Physiologie9,10,12,15,16gerichtet hat, 17.
Kultivierte Fett Körper können verschiedene experimentelle unterworfen werden und Steuern Behandlungen, durch den Prüfer das, die Timing von denen entschieden werden kann. Am Ende der Inkubationszeit die Fett Körper gesammelt und verarbeitet für nachgelagerte Analysen, einschließlich qPCR16,17,18,19, Western Blot-18 ,20, Proteomics21oder Metabolomik22. Experimente können auf verschiedenen Ebenen, von einzelnen Fett stellen Gruppen von Hunderten durchgeführt werden, die zusammen kultiviert werden können.
Die repräsentativen Ergebnisse hier stammen aus Fett Körper kultiviert im Beisein von Aminosäuren und das Steroidhormon 20-hydroxy Ecdyson die Blutmahlzeit Aktivierung des Vitellogenesis16,17zu simulieren, 23,24. Wir haben analysiert und verglichen die differenzielle Genexpression versus aktivierte Fett Körper über Next Generation Sequencing Analyse nicht aktiviert.

<table><tbody><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fiskars</td><td>83872</td><td></td></tr><tr><td>Fly pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>789060</td><td></td></tr><tr><td>Battery-powered aspirator w/ collection vial</td><td>Hausherrs Machine Works, Inc.</td><td>3740-01-210-2368</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip forceps</td><td>World Precision Instruments, Inc.&amp;nbsp;</td><td>500085</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well plate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CL S3383</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Alanine</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>Arginine</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>Aspartic Acid</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Glutamic Acid</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucine</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Phenylalanine</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Methionine</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH8.0&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus

Das Insekt fetten Körper spielt eine zentrale Rolle im Insekt Stoffwechsel und Nährstoffspeicherung, Spiegelung Funktionen der Leber und Fettgewebe bei Wirbeltieren. Insekt Fett Körpergewebe wird in der Regel das Insekt Körper verteilt. Es ist jedoch oft in den Bauch konzentriert und an der Bauchdecke Körper befestigt.
Der Moskito-Fett-Körper ist die einzige Quelle von Proteinen, Eigelb, die entscheidend für die Eierproduktion. Die in-vitro- Kultur von Moskito Fett Körpergewebe stellt daher, ein wichtiges System für das Studium der Moskito Physiologie, Stoffwechsel und letztlich, Ei-Produktion. Der fetten Körper-Kultur-Prozess beginnt mit der Vorbereitung der Lösungen und Reagenzien, einschließlich Aminosäure Stammlösungen, Aedes physiologischer Kochsalzlösung Salz-Stammlösung (APS), Kalzium-Stammlösung und fetten Körper Kulturmedium. Der Prozess wird fortgesetzt mit fetten Körper Dissektion, gefolgt von einer experimentellen Behandlung. Nach der Behandlung kann eine Vielzahl von verschiedenen Analysen durchgeführt werden, einschließlich RNA Sequenzierung (RNA-Seq), qPCR, Western Blots, Proteomik und Metabolomik.
In unserem Beispiel Experiment zeigen wir das Protokoll durch die Exzision und Kultur der Körper Fett vom Gelbfieber Moskito, Aedes Aegypti, wichtigsten Überträger von Arboviren einschließlich Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika. RNA aus Fett Körper kultiviert unter einer physiologischen Zustand bekannt, Upregulate Eigelb Proteine im Vergleich zu der Kontrolle unterstanden RNA-Seq-Analyse zu den potenziellen Nutzen dieses Verfahrens für Untersuchungen der Genexpression zu demonstrieren.

Als Beispiel wir eine fetten Körper-Kultur-Experiment durchgeführt und isolierten Fett Körper durch sie auf eine Lösung mit einer ausgewogenen Mischung aus allen 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren und das Insekt Steroidhormon 20-hydroxy Ecdyson (10 µM) für 6 h Inkubation stimuliert . Als Kontrolle wurden Fett Körper auf APS für eine gleich lange Zeit inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die gesamte-RNS isoliert mit einem Tri-Reagenz27 nach den Anweisungen des Herstellers. Die Qualität und Quantität der extrahierten RNA-Proben wurden mit einem Spektralfotometer, fluorometrisch Quantifizierung und Agarose-Gelelektrophorese bewertet. RNA Sequenzierung Bibliotheken erzeugt wurden, mit 4 µg Gesamt-RNS und wurden mit zwei verschiedenen Techniken quantifiziert. Anschließend wurden die Bibliotheken für die gekoppelten Ende-Sequenzierung kommerzieller Anbieter geschickt.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 6dargestellt. Gene zeigt die stärkste transcriptional Antwort auf Aminosäure und 20-Hydroxyecdysone waren in erster Linie Eigelb Protein Gene, die in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen11ist.
Abbildung 1 zeigt, dass eine Heatmap zeigt gen Ausdruck Niveaus von 1.256 differentiell Gene aus kultivierten Fett Körper nach zwei unterschiedlichen Behandlungen zum Ausdruck gebracht.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55508/55508fig1.jpg"> 
Abbildung 1 . Heatmap der Gene in der fetten Körperkultur. Die Heatmap wurde basierend auf der Anzahl der spezifische Protokolle für jedes Gen in den verschiedenen Bibliotheken mit der Heatmap Paket28 , die Teil der R-Software-Umgebung ist berechnet. Dunkler Schatten stellt höhere Genexpression. 1.256 Gene mit statistisch signifikante Variation im Ausdruck (Q-Werte &#60; 0,05) werden angezeigt. Die Gene sind entsprechend ihrer gemittelten Ausdruck, angezeigt durch das Dendrogramm auf der linken Seite (nicht nach ihrer phylogenetischen Beziehungen) bestellt. Beachten Sie die hohe Zahl von Genen mit Up - oder Down-regulierte Expression nach Stimulation mit Aminosäuren (AA) und 20-Hydroxyecdysone (20E). APS = Aedes physiologischer Kochsalzlösung. Finden Sie eine Liste der Gene und ihrer relativen Ausdruck Niveaus ergänzende Datei 1 . <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/55508fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aminosäure</td>
			<td>Molekulargewicht g/mol</td>
			<td>mM Konzentration</td>
			<td>mg / l</td>
			<td>mg für 300 mL Volumen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alanin</td>
			<td>89,1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>2377.19</td>
			<td>713.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginin</td>
			<td>174,2</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4647.66</td>
			<td>1394.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparagin</td>
			<td>150.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4004.67</td>
			<td>1201.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asparaginsäure</td>
			<td>133</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3548.44</td>
			<td>1064.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cystein</td>
			<td>121.16</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1293.99</td>
			<td>388,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaminsäure</td>
			<td>147,1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3924.63</td>
			<td>1177.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamin</td>
			<td>146</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3895.28</td>
			<td>1168.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycin</td>
			<td>75</td>
			<td>53.32</td>
			<td>3999</td>
			<td>1199.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histidin</td>
			<td>155.16</td>
			<td>80</td>
			<td>12412.8</td>
			<td>3723.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoleucin</td>
			<td>131</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1399.08</td>
			<td>419.72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycine</td>
			<td>183</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4882.44</td>
			<td>1464.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucin</td>
			<td>131</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3495.08</td>
			<td>1048.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylalanin</td>
			<td>165</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1762.2</td>
			<td>528.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLine</td>
			<td>115</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3068.2</td>
			<td>920.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serin</td>
			<td>105</td>
			<td>53.32</td>
			<td>5598.6</td>
			<td>1679.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threonin</td>
			<td>119</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1270.92</td>
			<td>381.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptophan</td>
			<td>204</td>
			<td>10,68</td>
			<td>2178.72</td>
			<td>653.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrosin</td>
			<td>181</td>
			<td>5.32</td>
			<td>962.92</td>
			<td>288.88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valin</td>
			<td>117</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1249.56</td>
			<td>374.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionin</td>
			<td>149</td>
			<td>10,68</td>
			<td>1591.32</td>
			<td>477,4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. 4 x Aminosäure-Stammlösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Gewicht in Gramm, 50 ml DdH2O hinzugefügt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>8,0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0,074 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6 H2O</td>
			<td>0,120 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nahco33</td>
			<td>0,0250 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2. 20 X Salz-Stammlösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Gewicht in Gramm, 100 ml ddH2O hinzugefügt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2-2 H2O</td>
			<td>0,90 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<stron></stron>g > Tabelle 3. 50 x Kalzium-Stammlösung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Konzentration der Stammlösung</td>
			<td>Volumen-Lager für 100 ml Puffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-pH8.0</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,25 M</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>NA</td>
			<td>0,3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DdH2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>100 ml (~ 93 mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 4. Tris-Puffer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>Volumen-Lager für 200 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminosäure-Stammlösung</td>
			<td>150 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salz-Stammlösung</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalzium-Stammlösung</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES Puffer</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>26 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 5. Fetten Körper Kulturmedium.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Annotation</td>
			<td>Gen-Beschreibung</td>
			<td>Falten Sie ändern</td>
			<td>P-Wert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006138</td>
			<td>Vitellogenin-B</td>
			<td>3443</td>
			<td>2.52E-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006126</td>
			<td>Vitellogenin-C</td>
			<td>2795</td>
			<td>8.64E-91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006563</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>1002</td>
			<td>2.17E-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010434</td>
			<td>Vitellogenin-A</td>
			<td>220</td>
			<td>1.14E-27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006542</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>185</td>
			<td>2.14E-65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL012678</td>
			<td>AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%)</td>
			<td>96</td>
			<td>4.00E-70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL000080</td>
			<td>hypothetische protein</td>
			<td>82</td>
			<td>6.69E-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL015312</td>
			<td>Vitellogenic Cathepsin B</td>
			<td>77</td>
			<td>1.27E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL009588</td>
			<td>nukleare Rezeptor 3</td>
			<td>75</td>
			<td>4.58E-56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010529</td>
			<td>hypothetische protein</td>
			<td>66</td>
			<td>1.32E-29</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 6. Experimentelle Ergebnisse.
Ergänzende Datei 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/Table_of_genes_for_figure_1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Das Fett des Körpers ist das zentrale Stoffwechselorgan bei Insekten. Wir präsentieren Ihnen eine live Kultur Organsystem, das dem Benutzer ermöglicht, die Antworten der isolierten Fett Körpergewebe auf verschiedene Reize zu studieren.

Fetten Körper Kultur Organsystem in Aedes Aegypti, Überträger von Zika-Virus

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

9.4K Aufrufe.  New Mexico State University. Das Fett des Körpers ist das zentrale Stoffwechselorgan bei Insekten. Wir präsentieren Ihnen eine live Kultur Organsystem, das dem Benutzer ermöglicht, die Antworten der isolierten Fett Körpergewebe auf verschiedene Reize zu studieren.

Serie: Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protokoll für Dengue-Infektionen in Mücken (Aedes aegypti) und Infektionsbiologie Phänotyp Bestimmung

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

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Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

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The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Ausbreitung des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Fütterung und Quantifizierung von Tierblut und künstlichen Mahlzeiten in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Pflege, Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infizierte

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

Verbesserte Fecundity und Fruchtbarkeit Assay für Aedes aegypti mit 24 Well Tissue Culture Platten (EAgaL Platten)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...