이 연구는 2014 NMSU HHMI 부여 #52008103, 및 NSF PGR 부여 #1238731 NIH 그랜트 #SC1AI109055에 의해 지원 되었다. 우리는 NMSU 봄 2015 BIOL302 분자 방법 클래스와 Lavesh Bhatia 참가자를 뚱뚱한 몸 문화 실험 그들의 기술 지원에 대 한 감사합니다.

1. 솔루션 및 시 약 준비 <ol><li>아미노산 재고 솔루션 <ol><li>준비 4 X 아미노산 재고 솔루션 23 , 24 무게와 표 1에 주어진 농도 따라 삼각 플라스 크에 20 다른 아미노산을 추가. 
		참고: 경우에 따라 amino acid(s) 솔루션에서 제외 하 고 수 어 금 니 같은 양의 osmolytes의 동등한 농도 유지 하기 위해 마 니 톨에 의해 대체.</li>
		<li>DdH 2 O 생산 솔루션의 원하는 볼륨의 적절 한 금액을 추가.</li>
		<li>아미노산 완전히 해산 할 수 있도록 부드럽게 액체 완전히 취소 될 때까지 지속적으로 교 반 하면서가 열, 그것은 약간의 노란 색상에 걸릴 것입니다. 
		참고: 그것은 해산 더 소수 성 아미노산의 일부 있도록 HCl를 추가 하 여 6 pH를 감소 해야 할 수도 있습니다.</li>
		<li>약 수는 솔루션 및 살 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m로 기 공 크기.</li>
		<li>최대 6 개월 동안-20 ° C에서 밀봉된 한 콘테이너에서 매장.</li>
	</ol></li> <li>APS 참고: 25 참조.
	<ol><li>X 20에 대 한 재고 솔루션을 소금, 물 50 mL에 표 2에 나열 된 염 결합. 완전히 녹아 때까지 저 어. 
		참고: 그것은 약간을 완전히 해산 소금 솔루션을 열 필요가 있을 수 있습니다.</li>
		<li>멸 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m로 기 공 크기 및 솔루션-20에서 50 mL 튜브에 저장 ° c.</li>
	</ol></li> <li>칼슘 재고 솔루션 <ol><li>칼슘 재고 솔루션 X 50 물 (표 3) 100 mL를 염화 칼슘의 0.90 g 추가; 완전히 녹아 때까지 저 어.</li>
		<li>멸 균 필터 주사기를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기, aliquot 솔루션 50 mL 튜브, 필터링 및-20에서 저장 ° c.</li>
	</ol></li> <li>Tris 버퍼 (pH 7.4) <ol><li>는 Tris 버퍼, 소금 및 표 4에 나열 된 솔루션을 결합 하 여 고 추가 ddH 2 O 최대 100 mL.</li>
		<li>멸 균 필터 주사기를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기와 약 수 솔루션 50 mL 튜브 필터, 실내 온도에 저장.</li>
	</ol></li> <li>뚱뚱한 몸 문화 매체 <ol><li>뚱뚱한 몸 문화 매체를 준비 하려면 위에 나열 된 모든 솔루션을 준비.</li>
		<li>뚱뚱한 몸 문화 매체의 200 mL을 표 5에서 볼륨에 의하여 그들을 결합 하는 것.</li>
		<li>7.2 NaOH 또는 HCl에 산도 조정.</li>
		<li>멸 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기와 솔루션.</li>
		<li>15 mL aliquots로 솔루션을 분할 하 고-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. 해 부에 대 한 준비 <ol><li>조명 stereomicroscope (10-20 배 확대)을 준비 하 고 2 초 정밀 핀셋과 마이크로 해 부가 위 레이아웃.</li>
	<li>실험에 필요한 모든 솔루션을 준비합니다. 실내 온도에 뚱뚱한 몸을 배양 해 동. 
	참고: 침 부드럽게 30 보다 더 높은 솔루션을가 열 하 여 녹 수 있다 ° c.</li>
	<li>는 흡 인기와 성인 여성 모기 (출현 후 3-7 일)를 수집 하 고 그들을 anesthetize 이산화탄소 또는 얼음을 사용 하 여 
	참고: 한 번 취, 모기 지켜져야 한다 CO 2 짧은 시간에 대 한 가능한, 또는 20 분을 초과 하지 않는, 모기 얼음에 취 수 하 고 약 30 분 동안 보관</li>
	<li>잘 당 ap 3 mL와 함께 6-잘 접시 준비.</li>
</ol> 3. 뚱뚱한 몸을 해 부 <ol><li>해 stereomicroscope을 집중 하 고 편안한 높이로 자를 조정.</li>
	<li>현미경 표면에 오목 현미경 슬라이드를 놓고 중앙에 APS의 두 방울을 추가.</li>
	<li>모기 다리는 집게를 사용 하 여 선택 하 고 현미경 슬라이드에 APS 표면에 그것을 전송.</li>
	<li>신중 하 게 모기는 흉부에 의해 왼쪽 손에 집게 그립 하 고 복 부 쪽이 위쪽으로 모기 회전.</li>
	<li>시체 꾸준한 흉부를 잡고 있는 동안, 오른손에 집게와 마지막 2 개의 복 부 세그먼트를 파악 하 고 부드럽게 당겨. 
	참고: 마지막 2 개의 복 부 세그먼트에서 복 부와 연결 된 난소, 말 tubules, hindgut, midgut; 구분 됩니다. 때로는 자르기 복 부 밖으로 슬라이드 합니다. 그들은 제거 되지 않은, 만든 작은 구멍에는 집게의 닫힌된 끝을 삽입 하 고 나머지 조직 제거.</li>
	<li>오른쪽 집게를 따로 설정 하 고 봄이 위를 선택 합니다. 가슴 아래 세그먼트까지 복 부에 있는 구멍에 한 블레이드를 밀어. 부드럽게 하 고 신속 하 게 복 부 세로로 잘라. 
	참고: 컷 했다 일단 복 부를 시작 한다 밖으로, 확장 이것 즉시 발생 하지 않을 수 있습니다 비록.</li>
	<li>두 번째 컷, 가슴 아래와 첫 번째 컷 종료 보다 약간 측면 컷 될 수 있도록 진행. 
	참고: 복 부 해야 다음을 열고 가슴을 표 피와 AP 내 면 몰입 지방 기관에서 해리. 이 복 부 체 벽은 생체 외에서 문화에 대 한 뚱뚱한 몸을 준비.</li>
	<li>집게의 쌍의 팁을 사용 하 여 APS 솔루션에서 지방 시체를 리프트 하 고 AP를 포함 하는 실 온에서 6 잘 플레이트에 솔루션에서 그들을 전송. 뚱뚱한 몸 문화에 전에 대략 0.5 h에 대 한 나머지 조직 허용.</li>
</ol> 4. 뚱뚱한 몸 문화 <ol><li>0.5 h 이상 그들을 equilibrate를 위한 실내 온도에 APS에 지방 시체를 품 어.</li>
	<li>지방 시체는 집게의 팁을 사용 하 여 전송 하 고 부드럽게 APS 솔루션에서 그들을 들어 냅니다. 뚱뚱한 몸 문화 매체에는 팁 낮은. 
	참고: 뚱뚱한 몸 한다 매체의 표면에 열고 자유롭게 떠. 뚱뚱한 몸 문화 각 우물에서 매체의 150-200 µ L 96 잘 접시에서 일반적으로 수행 됩니다. 하나 잘 최대 3 개의 개별 지방 기관, 들어갈 수 있는 그리고 그들은 이상의 12 h (게시 되지 않은 개인 결과)에 대 한 가능한.</li>
	<li>잠복기, 후 지방 시체에서에서 전송 매체 다운스트림 처리에 대 한 적절 한 시 약을 포함 하는 원심 분리기 1.5 mL 튜브에. 
	참고: 일반적인 분석 포함 정량 16 , 17 , 18 , 19, 서양 blotting 18 , 20, transcriptomics 26, proteomics 21 또는 대사체학 22.</li>
</ol>

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공개 하는 것이 없다.

곤충 기관 문화 공부 벌레 내분비학, 개발, 및 물질 대사, 또한 특정 기관과 세균 symbionts29,,3031, 사이 상호 작용을 조사로 광범위 하 게 사용 되었다 32,,3334. 뚱뚱한 몸 기관 문화 체 외에서 아미노산 전송 모기 및 다른 Diptera16,,1735 노 른 자 단백질 생산의 규칙을 공부 하 고 특히 사용 되었다 , 36. vitellogenesis 과정에서 모기 지방 시체를 사용 하 여 높은 특이성 아미노산 운송업 자의 배열을 노 른 자 단백질12 의 대량 합성 hemolymph에서 혈액 식사 파생 된 아미노산을 가져올 19,,3536. 뚱뚱한 몸 문화가 컨텍스트18에 뚱뚱한 몸을 영양 요구의 묘사에 쓸모 있었다.
시작 자료, 여성 모기의 품질은이 실험의 성공에 대 한 중요 한. 모기 유 충에서 붐비는 조건에서 제기 하 고 일반적으로 높은 영양소 다이어트를 먹이 최고의 결과 얻을. 실험 설계 측면에서 실험실에서 모기 뚱뚱한 몸 문화 조건을 설정할 때 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 변수가 있다. 우리는 뚱뚱한 몸을 유전자 발현에 따라 크게 개인 생활 역사와 모기11,22의 영양 상태는 이전 학문에서 보였다. 모기 문화 조건이 균일 한 크기의 변화를 줄이기 위해 고 영양 실험 모기의 보유. 또한, 수행 하는 해 인사 일관 된 결과를 신속 하 고 정확한 해를 되도록 훈련 한다. 다른 얼룩 방법37,38을 사용 하 여 격리 된 지방 기관에서 세포 생존 능력을 확인할 수 있습니다.
뚱뚱한 몸 문화 실험의 실험 설계 해 수 주어진된 기간에 가능한 고려 소요 됩니다. 지방 기관의 필요한 경우, 여러 개의 절 개 세션 또는 여러 dissectors 필요할 수 있습니다. 모기와 다른 곤충에 뚱뚱한 몸 문화를 체 외에서 미래의 애플 리 케이 션의 넓은 범위가 있다. 그것은 살충제에 대 한 잠재적인 약 후보자를 테스트 하기 위해 특히 유용할 것 이다. 뚱뚱한 몸 trophocytes에 특정 기자 단백질을 표현 하는 곤충에서 유전자 변형 기술의 사용 뚱뚱한 몸 생리학의 연구에 대 한 강력한 생물 검정을 개발 하는 새로운 방법을 열 것 이다.

모기는 말라리아, 뎅기열, chikungunya, Zika1,2,3등 엄청난 인간 질병의 벡터. 강렬한 국제적인 노력이이 질병을 억제 하 고 질병 전송 모기 인구를 통제 하에 불구 하 고 모기 품 어진 질병의 전염병 발생은 특히 개발 도상국에서에서 여전히 일반적 이다. 이 질병의 많은 대 한 효과적인 백신은 사용할 수 없는 또는 제한 된 효능4,5. 발생을 방지 하는 가장 효과적인 방법은 살충제 처리를 통해 주로 모기 인구를 통제 하는 것입니다. 그러나, 살충제 저항 많은 모기 인구에서 개발 하 고 세계6,,78주변 일반적인 문제. 모기 생리학의 연구 소설 도구와 질병을 제어 하는 전략의 발전에 필수적 이다.
모기 뚱뚱한 몸을 영양소 저장, 대사 항상성, 생식, 그리고 xenobiotic 놓을9,10,,1112에 중심 역할을 한다. 트리 글리세라이드, 글 리 코겐, 아미노산 저장 단백질의 형태로 주요 저장 기관 이다. 그것은 또한 대부분의 hemolymph 단백질 및 대사 산물에 대 한 종합의 위치 역할을 합니다. 모기, 뚱뚱한 몸을 빼앗아 혈액 식사13,14후 여성에서 발생 하는 노 른 자 단백질 생산의 유일한 소스입니다.
주 세포 유형의 뚱뚱한 몸은 큰, 이다 trophocyte 또는 체형3,,910,12. 지방이 신체 조직 돌출부 또는 칼 집으로 구성 하 고 어디 지방 신체의 돌출부가 큰 복 부 체 벽에 붙어있는 복 부에 있는 가장 큰 부분으로 모든 신체 부위는 모기의에서 찾을 수 있습니다.
여기에 제시 된 모기 뚱뚱한 몸 문화 시스템 70 년대에 개발 되었다 고 지방 신체 생리학10, 특히 현재 분석 기술 함께 공부를 위한 강력한 도구를 남아 있다. 이 기법의 기초 복 부 몸 벽과 연결 된 지방 신체 조직의 격리를 기반으로 합니다. 복 부 표 피의 소수 성 특성 포장 되어 복 부 지방이 신체의 연결 된 돌출부와 문화 매체의 표면에 떠 그것을 발생 합니다. Tracheolar 구조와 spiracles 교양된 조직에의 산소를 보장 유지 됩니다. 이제부터, 우리 "지방 시체." 이러한 준비를 참조 한다 고립 된 지방 시체 가능한 적절 한 매체 (게시 되지 않은 결과)에서 알을 품을 때 12 h 이상 유지. 지방이 신체 문화는 뚱뚱한 몸을 내분비학 및 생리학9,10,12,,1516에 관한 질문의 다양 한 해결은 귀중 한 도구 17.
교양된 지방 시체 다양 한 실험 대상이 될 수 있는 고 제어 치료의 타이밍은 조사자에 의해 따라 결정 될 수 있다. 잠복기의 끝에, 지방 기관 수 수집 및 정량16,,1718,19,18 를 더럽혀 서 포함 한 다운스트림 분석에 대 한 처리 20, proteomics21또는 대사체학22. 함께 배양 수 수백의 그룹에 개별 지방 시체에서 다양 한 스케일에서 실험을 수행할 수 있습니다.
여기에 포함 된 대표적인 결과 지방 시체 아미노산 및 vitellogenesis16,17의 혈액 식사 활성화를 시뮬레이션 하기 위해 스테로이드 호르몬 20-hydroxy ecdysone 존재 양식에서 파생 했다 23,24. 우리와 다음 세대 시퀀싱 분석을 통해 활성화 된 지방 기관 대 하지 활성화의 차동 유전자 발현을 비교 분석.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="508">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Fiskars</td>
			<td style="width:143px;">83872</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Fly pad</td>
			<td style="width:192px;">Genesee Scientific</td>
			<td style="width:143px;">789060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:64px;">Battery-powered aspirator w/ collection vial</td>
			<td style="width:192px;">Hausherrs Machine Works, Inc.</td>
			<td style="width:143px;">3740-01-210-2368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">Fine tip forceps</td>
			<td style="width:192px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:143px;">500085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:64px;">Light microscope&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Leica Microsystems</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:64px;">96 well plate&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">CL S3383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">Sucrose</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td style="width:143px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Alanine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Arginine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Asparagine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Aspartic Acid</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>A9256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Cysteine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>W326305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamic Acid</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glutamine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Glycine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>G2879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Histidine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>H6034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Isoleucine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Lysine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Leucine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Phenylalanine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Proline</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Serine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Threonine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tryptophan</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Tyrosine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Valine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Methionine</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">NaCl</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">KCl</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:64px;">MgCl2-6H2O</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:64px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:64px;">CaCl2-2H2O</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>C8106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:64px;">Tris pH8.0&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:64px;">EDTA</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:64px;">ddH2O</td>
			<td style="width:192px;">Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus

곤충 뚱뚱한 몸을 곤충 신진 대사 영양소 저장, 간 및 지방 조직 척추 동물에서의 기능을 미러링에 중심 역할을 한다. 곤충 지방 신체 조직 일반적으로 곤충 시체를 통해 배포 됩니다. 그러나, 그것은 종종 복 부에 집중 이며 복 부 체 벽에 부착 된.
모기 지방 몸은 달걀 생산을 위한 중요 한 노 른 자 단백질의 유일한 소스 이다. 모기 지방 신체 조직의 생체 외에서 문화 모기 생리학의 연구에 대 한 중요 한 시스템을 대표 하는 따라서, 신진 대사, 그리고, 궁극적으로, 계란 생산. 뚱뚱한 몸 문화 프로세스 솔루션 및 시 약, 아미노산 재고 솔루션, Aedes 생리 염 분 소금 재고 솔루션 (AP), 칼슘 재고 솔루션 및 뚱뚱한 몸 문화 매체를 포함 하 여의 준비로 시작 합니다. 프로세스 지방 시체 해 부, 실험 치료 다음 계속 합니다. 치료 후, 다른 분석의 다양 한 수행할 수 있습니다, RNA 시퀀싱 (RNA-Seq), 정량, 서쪽 오 점, proteomics, metabolomics 등.
우리의 예제에서는 실험 황열병 모기, Aedes aegypti, 뎅기열, Zika, chikungunya, 등 arboviruses의 주요 벡터에서에서 절단 및 지방 시체의 문화를 통해 프로토콜 보여 줍니다. 컨트롤 대 upregulate 노 른 자 단백질으로 알려진 생리 적인 조건 하에서 경작 하는 지방 시체에서 RNA 유전자 발현의 조사에 대 한이 절차의 잠재적인 유틸리티를 보여 주기 위해 RNA-Seq 분석 대상이 됐다.

예를 들어, 우리는 뚱뚱한 몸을 문화 실험을 수행 하 고 모든 20 자연적 사건 아미노산 및 6 h에 대 한 곤충 스테로이드 호르몬 20-hydroxy ecdysone (10 µ M)의 균형 잡힌된 혼합물을 포함 하는 솔루션에 그들을 배양 하 여 고립 된 지방 시체를 자극 . 컨트롤, 지방 시체는 시간의 동일한 금액에 대 한 APS에 incubated 했다.
부 화, 후 총 RNA 격리 된 제조업체의 지침에 따라 트라이 시 약27 을 사용 하 여 했다. 품질 추출 된 RNA 샘플의 수량 및 분 광 광도 계, fluorometric 정량 및 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 평가 됐다. RNA 시퀀싱 라이브러리 총 RNA의 4 µ g를 사용 하 여 생성 된 및 두 개의 서로 다른 기술을 사용 하 여 계량 했다. 그 후, 도서관 짝된 끝-시퀀싱에 대 한 상업적인 공급자에 게 보내졌다.
이 실험의 결과 표 6에 표시 됩니다. 유전자 아미노산 및 20-hydroxyecdysone 강한 transcriptional 반응을 보이고 했다 주로 노 른 자 단백질 유전자, 이전 결과11합의입니다.
그림 1 에서는 차동 1,256의 유전자 표현 레벨을 나타내는 열 지도 2 개의 다른 처리 후 교양된 지방 기관에서 유전자 표현.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55508/55508fig1.jpg"> 
그림 1 . 뚱뚱한 몸 문화에 표현 하는 유전자의 열 지도. 열 지도 heatmap 패키지28 R 소프트웨어 환경의 일부를 사용 하 여 다른 라이브러리에 있는 각 유전자에 대 한 특정 사본 수에 따라 계산 했다. 어두운 그늘 높은 유전자 발현을 나타냅니다. 1256 유전자 식에 통계적으로 유의 한 변화를 (Q 값 &#60; 0.05) 표시 됩니다. 유전자 (에 따르면 그들의 계통 발생 관계) 왼쪽에 dendrogram 표시, 그들의 평균된 식 수준에 따라 정렬 됩니다. 아미노산 (AA)와 20-hydroxyecdysone (20E) 자극 후 식 위로 또는 아래로 통제 되는 유전자의 높은 숫자 note APS Aedes 생리 식 염 수를 =. 유전자와 그들의 상대 식 레벨의 목록에 대 한 추가 파일 1 을 참조 하십시오. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/55508fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>아미노산</td>
			<td>분자량 g/mol</td>
			<td>mM 농도</td>
			<td>리터 당 밀리 그램</td>
			<td>300 mL 볼륨에 대 한 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>알라닌</td>
			<td>89.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>2377.19</td>
			<td>713.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아르기닌</td>
			<td>174.2</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4647.66</td>
			<td>1394.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아스파라긴</td>
			<td>150.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4004.67</td>
			<td>1201.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic 산</td>
			<td>133</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3548.44</td>
			<td>1064.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>시스테인</td>
			<td>121.16</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1293.99</td>
			<td>388.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>글루탐산</td>
			<td>147.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3924.63</td>
			<td>1177.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>글루타민</td>
			<td>146</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3895.28</td>
			<td>1168.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>글리신</td>
			<td>75</td>
			<td>53.32</td>
			<td>3999</td>
			<td>1199.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>히스티딘</td>
			<td>155.16</td>
			<td>80</td>
			<td>12412.8</td>
			<td>3723.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>이소류신</td>
			<td>131</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1399.08</td>
			<td>419.72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycine</td>
			<td>183</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4882.44</td>
			<td>1464.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>신</td>
			<td>131</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3495.08</td>
			<td>1048.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>페닐알라닌</td>
			<td>165</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1762.2</td>
			<td>528.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>프롤린</td>
			<td>115</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3068.2</td>
			<td>920.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>떠들고</td>
			<td>105</td>
			<td>53.32</td>
			<td>5598.6</td>
			<td>1679.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트레오닌</td>
			<td>119</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1270.92</td>
			<td>381.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트립토판</td>
			<td>204</td>
			<td>10.68</td>
			<td>2178.72</td>
			<td>653.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>티로신</td>
			<td>181</td>
			<td>5.32</td>
			<td>962.92</td>
			<td>288.88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>117</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1249.56</td>
			<td>374.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>메티오닌</td>
			<td>149</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1591.32</td>
			<td>477.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1입니다. 아미노산 재고 솔루션 X 4입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>50 ml ddH2O에 추가 그램 무게</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>8.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.074 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6 H2O</td>
			<td>0.120 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>0.0250 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2. 20 X 소금 재고 솔루션.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>100 ml ddH2O에 추가 하는 그램에 무게</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2-2 H2O</td>
			<td>0.90 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<stron></stron>g > 표 3. 칼슘 재고 솔루션 X 50.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>재고 솔루션의 농도</td>
			<td>100 ml 버퍼에 대 한 음량 주식</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트리 스 pH8.0</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.25 M</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>100 ml (~ 93 mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 4. Tris 버퍼.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>볼륨 주식 200 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아미노산 재고 솔루션</td>
			<td>150 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>소금 재고 솔루션</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>칼슘 재고 솔루션</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES 버퍼</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>26 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 5. 뚱뚱한 몸 문화 매체.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>주석</td>
			<td>진 설명</td>
			<td>배 변경</td>
			<td>P-값</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006138</td>
			<td>Vitellogenin-B</td>
			<td>3443</td>
			<td>2.52E-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006126</td>
			<td>Vitellogenin-C</td>
			<td>2795</td>
			<td>8.64E-91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006563</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>1002</td>
			<td>2.17E-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010434</td>
			<td>Vitellogenin-A</td>
			<td>220</td>
			<td>1.14E-27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006542</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>185</td>
			<td>2.14E-65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL012678</td>
			<td>AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%)</td>
			<td>96</td>
			<td>4.00E-70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL000080</td>
			<td>가설 단백질</td>
			<td>82</td>
			<td>6.69E-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL015312</td>
			<td>Vitellogenic cathepsin B</td>
			<td>77</td>
			<td>1.27E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL009588</td>
			<td>핵 수용 체 3</td>
			<td>75</td>
			<td>4.58E-56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010529</td>
			<td>가설 단백질</td>
			<td>66</td>
			<td>1.32E-29</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 6. 실험 결과.
보충 파일 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/Table_of_genes_for_figure_1.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

뚱뚱한 몸은 곤충에 중앙 대사 기관 이다. 선물이 라이브 기관 문화 시스템 사용자가 다양 한 자극에 격리 지방 몸 조직의 응답 공부입니다.

지방 기관 문화 시스템 Aedes Aegypti, Zika 바이러스 벡터에

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

9.4K 조회수.  New Mexico State University. 뚱뚱한 몸은 곤충에 중앙 대사 기관 이다. 선물이 라이브 기관 문화 시스템 사용자가 다양 한 자극에 격리 지방 몸 조직의 응답 공부입니다.

비디오: Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

여성 A. aegypti 모기에의 dsRNA의 분사

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

연구

생물학

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion rate. This method can be used to obtain a better understanding of the process of diuresis in insects and is especially useful in the study of diuresis in blood-feeding arthropods that are able to take up huge amounts of liquid in a single blood meal. 
This RNAi-mediated gene knockdown combined with an in vivo diuresis assay was developed by the Hansen lab to study the effects of RNAi-mediated knockdown of aquaporin genes on Aedes aegypti mosquito diuresis1. 
The protocol is setup in two parts: the first demonstration illustrates how to construct a simple mosquito injection device and how to prepare and inject dsRNA into the thorax of mosquitoes for RNAi-mediated gene knockdown. The second demonstration illustrates how to determine excretion rates in mosquitoes using an in vivo bioassay.

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

In this protocol we combine RNAi-mediated gene silencing with an in vivo diuresis assay to study the effects knockdown of genes of interest has on mosquito fluid excretion.

RNAi - 중재 유전자 최저 및<em&gt; VIVO에서</em성인 여자의&gt; 이뇨 분석<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; 모기

This video protocol demonstrates an effective technique to knockdown a particular gene in an insect and conduct a novel bioassay to measure excretion ...

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Using two methods to estimate gene expression in the major gustatory appendages of Aedes aegypti, we have identified the set of genes putatively underlying the neuronal responses to bitter and repulsive compounds, as determined by electrophysiological examination.

생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱<em&gt; Aedes aegypti</em

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Aedes aegypti 모기 감염 Wolbachia 유지

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no prevention. Control of mosquito vectors can rely on chemicals applied to the immature and adult stages, which can contribute to the mortality of non-targets and more importantly, lead to insecticide resistance in the vector. The sterile insect technique (SIT) is a method of controlling populations of pests through the release of sterilized adult males that mate with wild females to produce non-viable offspring. This paper describes the process of producing sterile males for use in an operational SIT program for the control of Aedes aegypti mosquitoes. Outlined here are the steps used in the program including rearing and maintaining a colony, separating male and female pupae, irradiating and marking adult males, and shipping Aedes aegypti males to the release site. Also discussed are procedural caveats, program limitations, and future objectives.

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The sterile insect technique (SIT) is used to control specific, medically important mosquito populations that may be resistant to chemical controls. Here, we describe a method of mass rearing and preparation of sterile male mosquitoes for release in an operational SIT program targeting the Aedes aegypti mosquito.

운영 멸균 곤충 기술 프로그램에서 방출하기 위해 조사되고 표시된 수컷 Aedes aegypti 모기 준비

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

형광염염을 사용하여 로다민 B, 남성 Aedes aegypti 모기에서 짝짓기 경쟁력을 연구하기 위해

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are highly efficient at virus transmission plays a key role in virus epidemics in fields. Studying virus-insect vector interactions can advance our understanding of virus transmission and epidemics with the aim of designing novel strategies to control plant viruses and their vector insects. Immunofluorescence labeling has been widely used to analyze interactions between pathogens and hosts and is used here in the white-backed planthopper (WBPH, Sogatella furcifera), which efficiently transmits the southern rice black streaked dwarf virus (SRBSDV, genus Fijivirus, family Reoviridae), to locate the virions and insect proteins in the midgut epithelial cells. Using laser scanning confocal microscopy, we studied the morphological characteristics of midgut epithelial cells, cellular localization of insect proteins, and the colocalization of virions and an insect protein. This protocol can be used to study virus activities in insects, functions of insect proteins, and interactions between virus and vector insect.

This protocol for immunofluorescent labeling of both plant virus proteins and vector insect proteins in excised insect guts can be used to study interactions among virus and vector insects, insect protein functions and molecular mechanisms underlying virus transmission.

Most plant viruses in nature are transmitted from one plant to another by hemipteran insects. A high population density of the vector insects that are ...

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus (AAV)2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

Adeno-associated viruses (AAV) are promising vectors for gene therapy applications. Here, the AAV2 vector is produced by co-culture of Spodoptera frugiperda (Sf9) cells with Sf9 cells infected with baculovirus (BV)-AAV2-GFP (or therapeutic gene) and BV-AAV2-rep-cap in serum-free suspension culture. Cells are cultured in a flask in an orbital shaker or Wave bioreactor. To release the AAV particles, producer cells are lysed in buffer containing detergent, which is subsequently clarified by low-speed centrifugation and filtration. AAV particles are purified from the cell lysate using AVB Sepharose column chromatography, which binds AAV particles. Bound particles are washed with PBS to remove contaminants and eluted from the resin using sodium citrate buffer at pH 3.0. The acidic eluate is neutralized with alkaline Tris-HCl buffer (pH 8.0), diluted with phosphate-buffered saline (PBS), and further concentrated with tangential flow filtration (TFF). The protocol describes small-scale pre-clinical vector production compatible with scale-up to large-scale clinical-grade AAV manufacturing for human gene therapy applications.

Process Development for the Production and Purification of Adeno-Associated Virus AAV2 Vector using Baculovirus-Insect Cell Culture System

In this protocol, AAV2 vector is produced by co-culturing Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells with baculovirus (BV)-AAV2-green fluorescent protein (GFP) or therapeutic gene and BV-AAV2-rep-cap infected Sf9 cells in suspension culture. AAV particles are released from the cells using detergent, clarified, purified by affinity column chromatography, and concentrated by tangential flow filtration.