Name: fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus
Uploaded: 2017-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus at JoVE.com

이 연구는 2014 NMSU HHMI 부여 #52008103, 및 NSF PGR 부여 #1238731 NIH 그랜트 #SC1AI109055에 의해 지원 되었다. 우리는 NMSU 봄 2015 BIOL302 분자 방법 클래스와 Lavesh Bhatia 참가자를 뚱뚱한 몸 문화 실험 그들의 기술 지원에 대 한 감사합니다.

1. 솔루션 및 시 약 준비 <ol><li>아미노산 재고 솔루션 <ol><li>준비 4 X 아미노산 재고 솔루션 23 , 24 무게와 표 1에 주어진 농도 따라 삼각 플라스 크에 20 다른 아미노산을 추가. 
		참고: 경우에 따라 amino acid(s) 솔루션에서 제외 하 고 수 어 금 니 같은 양의 osmolytes의 동등한 농도 유지 하기 위해 마 니 톨에 의해 대체.</li>
		<li>DdH 2 O 생산 솔루션의 원하는 볼륨의 적절 한 금액을 추가.</li>
		<li>아미노산 완전히 해산 할 수 있도록 부드럽게 액체 완전히 취소 될 때까지 지속적으로 교 반 하면서가 열, 그것은 약간의 노란 색상에 걸릴 것입니다. 
		참고: 그것은 해산 더 소수 성 아미노산의 일부 있도록 HCl를 추가 하 여 6 pH를 감소 해야 할 수도 있습니다.</li>
		<li>약 수는 솔루션 및 살 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m로 기 공 크기.</li>
		<li>최대 6 개월 동안-20 ° C에서 밀봉된 한 콘테이너에서 매장.</li>
	</ol></li> <li>APS 참고: 25 참조.
	<ol><li>X 20에 대 한 재고 솔루션을 소금, 물 50 mL에 표 2에 나열 된 염 결합. 완전히 녹아 때까지 저 어. 
		참고: 그것은 약간을 완전히 해산 소금 솔루션을 열 필요가 있을 수 있습니다.</li>
		<li>멸 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m로 기 공 크기 및 솔루션-20에서 50 mL 튜브에 저장 ° c.</li>
	</ol></li> <li>칼슘 재고 솔루션 <ol><li>칼슘 재고 솔루션 X 50 물 (표 3) 100 mL를 염화 칼슘의 0.90 g 추가; 완전히 녹아 때까지 저 어.</li>
		<li>멸 균 필터 주사기를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기, aliquot 솔루션 50 mL 튜브, 필터링 및-20에서 저장 ° c.</li>
	</ol></li> <li>Tris 버퍼 (pH 7.4) <ol><li>는 Tris 버퍼, 소금 및 표 4에 나열 된 솔루션을 결합 하 여 고 추가 ddH 2 O 최대 100 mL.</li>
		<li>멸 균 필터 주사기를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기와 약 수 솔루션 50 mL 튜브 필터, 실내 온도에 저장.</li>
	</ol></li> <li>뚱뚱한 몸 문화 매체 <ol><li>뚱뚱한 몸 문화 매체를 준비 하려면 위에 나열 된 모든 솔루션을 준비.</li>
		<li>뚱뚱한 몸 문화 매체의 200 mL을 표 5에서 볼륨에 의하여 그들을 결합 하는 것.</li>
		<li>7.2 NaOH 또는 HCl에 산도 조정.</li>
		<li>멸 균 필터 주사기 필터를 사용 하 여 0.2 µ m 기 공 크기와 솔루션.</li>
		<li>15 mL aliquots로 솔루션을 분할 하 고-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장.</li>
	</ol></li></ol> 2. 해 부에 대 한 준비 <ol><li>조명 stereomicroscope (10-20 배 확대)을 준비 하 고 2 초 정밀 핀셋과 마이크로 해 부가 위 레이아웃.</li>
	<li>실험에 필요한 모든 솔루션을 준비합니다. 실내 온도에 뚱뚱한 몸을 배양 해 동. 
	참고: 침 부드럽게 30 보다 더 높은 솔루션을가 열 하 여 녹 수 있다 ° c.</li>
	<li>는 흡 인기와 성인 여성 모기 (출현 후 3-7 일)를 수집 하 고 그들을 anesthetize 이산화탄소 또는 얼음을 사용 하 여 
	참고: 한 번 취, 모기 지켜져야 한다 CO 2 짧은 시간에 대 한 가능한, 또는 20 분을 초과 하지 않는, 모기 얼음에 취 수 하 고 약 30 분 동안 보관</li>
	<li>잘 당 ap 3 mL와 함께 6-잘 접시 준비.</li>
</ol> 3. 뚱뚱한 몸을 해 부 <ol><li>해 stereomicroscope을 집중 하 고 편안한 높이로 자를 조정.</li>
	<li>현미경 표면에 오목 현미경 슬라이드를 놓고 중앙에 APS의 두 방울을 추가.</li>
	<li>모기 다리는 집게를 사용 하 여 선택 하 고 현미경 슬라이드에 APS 표면에 그것을 전송.</li>
	<li>신중 하 게 모기는 흉부에 의해 왼쪽 손에 집게 그립 하 고 복 부 쪽이 위쪽으로 모기 회전.</li>
	<li>시체 꾸준한 흉부를 잡고 있는 동안, 오른손에 집게와 마지막 2 개의 복 부 세그먼트를 파악 하 고 부드럽게 당겨. 
	참고: 마지막 2 개의 복 부 세그먼트에서 복 부와 연결 된 난소, 말 tubules, hindgut, midgut; 구분 됩니다. 때로는 자르기 복 부 밖으로 슬라이드 합니다. 그들은 제거 되지 않은, 만든 작은 구멍에는 집게의 닫힌된 끝을 삽입 하 고 나머지 조직 제거.</li>
	<li>오른쪽 집게를 따로 설정 하 고 봄이 위를 선택 합니다. 가슴 아래 세그먼트까지 복 부에 있는 구멍에 한 블레이드를 밀어. 부드럽게 하 고 신속 하 게 복 부 세로로 잘라. 
	참고: 컷 했다 일단 복 부를 시작 한다 밖으로, 확장 이것 즉시 발생 하지 않을 수 있습니다 비록.</li>
	<li>두 번째 컷, 가슴 아래와 첫 번째 컷 종료 보다 약간 측면 컷 될 수 있도록 진행. 
	참고: 복 부 해야 다음을 열고 가슴을 표 피와 AP 내 면 몰입 지방 기관에서 해리. 이 복 부 체 벽은 생체 외에서 문화에 대 한 뚱뚱한 몸을 준비.</li>
	<li>집게의 쌍의 팁을 사용 하 여 APS 솔루션에서 지방 시체를 리프트 하 고 AP를 포함 하는 실 온에서 6 잘 플레이트에 솔루션에서 그들을 전송. 뚱뚱한 몸 문화에 전에 대략 0.5 h에 대 한 나머지 조직 허용.</li>
</ol> 4. 뚱뚱한 몸 문화 <ol><li>0.5 h 이상 그들을 equilibrate를 위한 실내 온도에 APS에 지방 시체를 품 어.</li>
	<li>지방 시체는 집게의 팁을 사용 하 여 전송 하 고 부드럽게 APS 솔루션에서 그들을 들어 냅니다. 뚱뚱한 몸 문화 매체에는 팁 낮은. 
	참고: 뚱뚱한 몸 한다 매체의 표면에 열고 자유롭게 떠. 뚱뚱한 몸 문화 각 우물에서 매체의 150-200 µ L 96 잘 접시에서 일반적으로 수행 됩니다. 하나 잘 최대 3 개의 개별 지방 기관, 들어갈 수 있는 그리고 그들은 이상의 12 h (게시 되지 않은 개인 결과)에 대 한 가능한.</li>
	<li>잠복기, 후 지방 시체에서에서 전송 매체 다운스트림 처리에 대 한 적절 한 시 약을 포함 하는 원심 분리기 1.5 mL 튜브에. 
	참고: 일반적인 분석 포함 정량 16 , 17 , 18 , 19, 서양 blotting 18 , 20, transcriptomics 26, proteomics 21 또는 대사체학 22.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Benelli, G., Mehlhorn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+malaria,+rising+of+dengue+and+Zika+virus:+insights+for+mosquito+vector+control.">Declining malaria, rising of dengue and Zika virus: insights for mosquito vector control.</a> Parasitol Res. 115 (5), 1747-1754 (2016).</li><li>Newby, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+to+eradication:+a+progress+report+on+the+malaria-eliminating+countries.">The path to eradication: a progress report on the malaria-eliminating countries.</a> Lancet. 387 (10029), 1775-1784 (2016).</li><li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Biology of Mosquitoes. 2, (1992).</li><li>Long, C. A., Zavala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malaria+vaccines+and+human+immune+responses.">Malaria vaccines and human immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 32, 96-102 (2016).</li><li>Mendis, K. N., David, P. H., Carter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immune+responses+against+sexual+stages+of+malaria+parasites:+considerations+for+malaria+vaccines.">Human immune responses against sexual stages of malaria parasites: considerations for malaria vaccines.</a> Int J Parasitol. 20 (4), 497-502 (1990).</li><li>Frings, S., Lindemann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant+response+of+isolated+olfactory+receptor+cells+is+blocked+by+amiloride.">Odorant response of isolated olfactory receptor cells is blocked by amiloride.</a> J Membr Biol. 105 (3), 233-243 (1988).</li><li>Froese, A., Szyszka, P., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+GABAergic+inhibition+on+odorant+concentration+coding+in+mushroom+body+intrinsic+neurons+of+the+honeybee.">Effect of GABAergic inhibition on odorant concentration coding in mushroom body intrinsic neurons of the honeybee.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 183-195 (2014).</li><li>Yewhalaw, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+insecticide+resistance:+an+impediment+to+insecticide-based+malaria+vector+control+program.">Multiple insecticide resistance: an impediment to insecticide-based malaria vector control program.</a> PLoS One. 6 (1), e16066 (2011).</li><li>Arrese, E. L., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+fat+body:+energy,+metabolism,+and+regulation.">Insect fat body: energy, metabolism, and regulation.</a> Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2010).</li><li>Raikhel, A. S., Deitsch, K. W., Sappington, T. W., Crampton, J. M., Beard, C. B., Louis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. , 507-522 (1997).</li><li>Price, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fat+body+transcriptomes+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti,+pre-+and+post-+blood+meal.">The fat body transcriptomes of the yellow fever mosquito Aedes aegypti, pre- and post- blood meal.</a> PLoS One. 6 (7), e22573 (2011).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-way+regulation+of+mosquito+yolk+protein+precursor+genes+by+juvenile+hormone-,+ecdysone-,+nutrient-,+and+insulin-like+peptide+signaling+pathways.">Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways.</a> Front Physiol. 5, 103 (2014).</li><li>Raikhel, A. S., Dhadialla, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+yolk+proteins+in+insect+oocytes.">Accumulation of yolk proteins in insect oocytes.</a> Annu Rev Entomol. 37, 217-251 (1992).</li><li>Raikhel, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+mosquito+vitellogenesis:+from+basic+studies+to+genetic+engineering+of+antipathogen+immunity.">Molecular biology of mosquito vitellogenesis: from basic studies to genetic engineering of antipathogen immunity.</a> Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1275-1286 (2002).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Chandrasekar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+6.">Ch. 6.</a> Short Views on Insect Molecular Biology. , (2009).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Park, J. H., Peng, Q., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-mediated+amino+acid+signaling+in+mosquito+anautogeny.">Target of rapamycin-mediated amino acid signaling in mosquito anautogeny.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (29), 10626-10631 (2004).</li><li>Hansen, I. A., Attardo, G. M., Roy, S. G., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+of+rapamycin-dependent+activation+of+S6+kinase+is+a+central+step+in+the+transduction+of+nutritional+signals+during+egg+development+in+a+mosquito.">Target of rapamycin-dependent activation of S6 kinase is a central step in the transduction of nutritional signals during egg development in a mosquito.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20565-20572 (2005).</li><li>Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. H., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+cationic+amino+acid+transporters+required+for+nutritional+signaling+during+mosquito+reproduction.">Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signaling during mosquito reproduction.</a> J Exp Biol. 209 (Pt 16), 3071-3078 (2006).</li><li>Carpenter, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC7+amino+acid+transporters+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti+and+their+role+in+fat+body+TOR+signaling+and+reproduction.">SLC7 amino acid transporters of the yellow fever mosquito Aedes aegypti and their role in fat body TOR signaling and reproduction.</a> J Insect Physiol. 58 (4), 513-522 (2012).</li><li>Attardo, G. M., Higgs, S., Klingler, K. A., Vanlandingham, D. L., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference-mediated+knockdown+of+a+GATA+factor+reveals+a+link+to+anautogeny+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">RNA interference-mediated knockdown of a GATA factor reveals a link to anautogeny in the mosquito Aedes aegypti.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100 (23), 13374-13379 (2003).</li><li>Hugo, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+biomarkers+for+ageing+the+mosquito+Aedes+aegypti+to+determine+risk+of+pathogen+transmission.">Proteomic biomarkers for ageing the mosquito Aedes aegypti to determine risk of pathogen transmission.</a> PLoS One. 8 (3), e58656 (2013).</li><li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+mosquitoes,+large+implications:+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti.">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasit Vectors. 8, 252 (2015).</li><li>Uchida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+oogenesis+in+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae)+by+infusion+of+the+hemocoel+with+amino+acids.">Induction of oogenesis in mosquitoes (Diptera: Culicidae) by infusion of the hemocoel with amino acids.</a> J Med Entomol. 38 (4), 572-575 (2001).</li><li>Uchida, K., Ohmori, D., Yamakura, F., Suzuki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+free+amino+acid+concentration+in+the+hemolymph+of+the+female+Culex+pipiens+pallens+(Diptera:+Culicidae),+after+a+blood+meal.">Changes in free amino acid concentration in the hemolymph of the female Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae), after a blood meal.</a> J Med Entomol. 27 (3), 302-308 (1990).</li><li>Hayes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+a+physiological+saline+solution+for+Aedes+aegypti+.(L).">Determination of a physiological saline solution for Aedes aegypti .(L).</a> J Econ Entomol. 46 (4), 624-627 (1953).</li><li>Price, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Fat+Body+Transcriptomes+of+the+Yellow+Fever+Mosquito+Aedes+aegypti,+Pre-+and+Post+Blood+Meal.">The Fat Body Transcriptomes of the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti, Pre- and Post Blood Meal.</a> Plos One. 6 (7), e22573 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+technical+reports.+Modification+of+the+TRI+reagent+procedure+for+isolation+of+RNA+from+polysaccharide-and+proteoglycan-rich+sources.">Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide-and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19 (6), 942-945 (1995).</li><li>Fujiwara, T., Kazawa, T., Haupt, S. S., Kanzaki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+odorant+concentration+dependent+inhibition+controls+temporal+properties+of+spike+responses+of+projection+neurons+in+the+moth+antennal+lobe.">Postsynaptic odorant concentration dependent inhibition controls temporal properties of spike responses of projection neurons in the moth antennal lobe.</a> PLoS One. 9 (2), e89132 (2014).</li><li>Larsen, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+in+an+insect+organ+culture.">Growth in an insect organ culture.</a> J Insect Physiol. 13 (4), 613-619 (1967).</li><li>Judy, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+Structure,+and+Absolute+Configuration+of+a+New+Natural+Insect+Juvenile+Hormone+from+Manduca+sexta.">Isolation, Structure, and Absolute Configuration of a New Natural Insect Juvenile Hormone from Manduca sexta.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 70 (5), 1509-1513 (1973).</li><li>Marks, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+of+hormones+in+insect+cell+and+organ+cultures.">The action of hormones in insect cell and organ cultures.</a> Gen Comp Endocrinol. 15 (2), 289-302 (1970).</li><li>Hughes, G. L., Pike, A. D., Xue, P., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+Wolbachia+into+Anopheles+and+Other+Insect+Germlines+in+an+Ex+vivo+Organ+Culture+System.">Invasion of Wolbachia into Anopheles and Other Insect Germlines in an Ex vivo Organ Culture System.</a> PLoS One. 7 (4), e36277 (2012).</li><li>Postlethwait, J. H., Handler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Juvenile-Hormone+and+20-Hydroxy-Ecdysone+during+Vitellogenesis+in+Isolated+Abdomens+of+Drosophila+melanogaster.">Roles of Juvenile-Hormone and 20-Hydroxy-Ecdysone during Vitellogenesis in Isolated Abdomens of Drosophila melanogaster.</a> J Insect Physiol. 25 (5), 455-460 (1979).</li><li>Spielman, A., Gwadz, R. W., Anderson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecdysone-initiated+ovarian+development+in+mosquitoes.">Ecdysone-initiated ovarian development in mosquitoes.</a> J Insect Physiol. 17 (10), 1807-1814 (1971).</li><li>Boudko, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+and+transport+mechanism+of+amino-acid+transceptor+Slimfast+from+Aedes+aegypti.">Substrate specificity and transport mechanism of amino-acid transceptor Slimfast from Aedes aegypti.</a> Nat Commun. 6, 8546 (2015).</li><li>Fleischer, J., Bumbalo, R., Bautze, V., Strotmann, J., Breer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+odorant+receptor+Olfr78+in+enteroendocrine+cells+of+the+colon.">Expression of odorant receptor Olfr78 in enteroendocrine cells of the colon.</a> Cell Tissue Res. 361 (3), 697-710 (2015).</li><li>Jones, K. H., Senft, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+to+determine+cell+viability+by+simultaneous+staining+with+fluorescein+diacetate-propidium+iodide.">An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide.</a> J Histochem Cytochem. 33 (1), 77-79 (1985).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. A3B, (2001).</li></ol>

공개 하는 것이 없다.

곤충 기관 문화 공부 벌레 내분비학, 개발, 및 물질 대사, 또한 특정 기관과 세균 symbionts29,,3031, 사이 상호 작용을 조사로 광범위 하 게 사용 되었다 32,,3334. 뚱뚱한 몸 기관 문화 체 외에서 아미노산 전송 모기 및 다른 Diptera16,,1735 노 른 자 단백질 생산의 규칙을 공부 하 고 특히 사용 되었다 , 36. vitellogenesis 과정에서 모기 지방 시체를 사용 하 여 높은 특이성 아미노산 운송업 자의 배열을 노 른 자 단백질12 의 대량 합성 hemolymph에서 혈액 식사 파생 된 아미노산을 가져올 19,,3536. 뚱뚱한 몸 문화가 컨텍스트18에 뚱뚱한 몸을 영양 요구의 묘사에 쓸모 있었다.
시작 자료, 여성 모기의 품질은이 실험의 성공에 대 한 중요 한. 모기 유 충에서 붐비는 조건에서 제기 하 고 일반적으로 높은 영양소 다이어트를 먹이 최고의 결과 얻을. 실험 설계 측면에서 실험실에서 모기 뚱뚱한 몸 문화 조건을 설정할 때 고려해 야 할 몇 가지 중요 한 변수가 있다. 우리는 뚱뚱한 몸을 유전자 발현에 따라 크게 개인 생활 역사와 모기11,22의 영양 상태는 이전 학문에서 보였다. 모기 문화 조건이 균일 한 크기의 변화를 줄이기 위해 고 영양 실험 모기의 보유. 또한, 수행 하는 해 인사 일관 된 결과를 신속 하 고 정확한 해를 되도록 훈련 한다. 다른 얼룩 방법37,38을 사용 하 여 격리 된 지방 기관에서 세포 생존 능력을 확인할 수 있습니다.
뚱뚱한 몸 문화 실험의 실험 설계 해 수 주어진된 기간에 가능한 고려 소요 됩니다. 지방 기관의 필요한 경우, 여러 개의 절 개 세션 또는 여러 dissectors 필요할 수 있습니다. 모기와 다른 곤충에 뚱뚱한 몸 문화를 체 외에서 미래의 애플 리 케이 션의 넓은 범위가 있다. 그것은 살충제에 대 한 잠재적인 약 후보자를 테스트 하기 위해 특히 유용할 것 이다. 뚱뚱한 몸 trophocytes에 특정 기자 단백질을 표현 하는 곤충에서 유전자 변형 기술의 사용 뚱뚱한 몸 생리학의 연구에 대 한 강력한 생물 검정을 개발 하는 새로운 방법을 열 것 이다.

모기는 말라리아, 뎅기열, chikungunya, Zika1,2,3등 엄청난 인간 질병의 벡터. 강렬한 국제적인 노력이이 질병을 억제 하 고 질병 전송 모기 인구를 통제 하에 불구 하 고 모기 품 어진 질병의 전염병 발생은 특히 개발 도상국에서에서 여전히 일반적 이다. 이 질병의 많은 대 한 효과적인 백신은 사용할 수 없는 또는 제한 된 효능4,5. 발생을 방지 하는 가장 효과적인 방법은 살충제 처리를 통해 주로 모기 인구를 통제 하는 것입니다. 그러나, 살충제 저항 많은 모기 인구에서 개발 하 고 세계6,,78주변 일반적인 문제. 모기 생리학의 연구 소설 도구와 질병을 제어 하는 전략의 발전에 필수적 이다.
모기 뚱뚱한 몸을 영양소 저장, 대사 항상성, 생식, 그리고 xenobiotic 놓을9,10,,1112에 중심 역할을 한다. 트리 글리세라이드, 글 리 코겐, 아미노산 저장 단백질의 형태로 주요 저장 기관 이다. 그것은 또한 대부분의 hemolymph 단백질 및 대사 산물에 대 한 종합의 위치 역할을 합니다. 모기, 뚱뚱한 몸을 빼앗아 혈액 식사13,14후 여성에서 발생 하는 노 른 자 단백질 생산의 유일한 소스입니다.
주 세포 유형의 뚱뚱한 몸은 큰, 이다 trophocyte 또는 체형3,,910,12. 지방이 신체 조직 돌출부 또는 칼 집으로 구성 하 고 어디 지방 신체의 돌출부가 큰 복 부 체 벽에 붙어있는 복 부에 있는 가장 큰 부분으로 모든 신체 부위는 모기의에서 찾을 수 있습니다.
여기에 제시 된 모기 뚱뚱한 몸 문화 시스템 70 년대에 개발 되었다 고 지방 신체 생리학10, 특히 현재 분석 기술 함께 공부를 위한 강력한 도구를 남아 있다. 이 기법의 기초 복 부 몸 벽과 연결 된 지방 신체 조직의 격리를 기반으로 합니다. 복 부 표 피의 소수 성 특성 포장 되어 복 부 지방이 신체의 연결 된 돌출부와 문화 매체의 표면에 떠 그것을 발생 합니다. Tracheolar 구조와 spiracles 교양된 조직에의 산소를 보장 유지 됩니다. 이제부터, 우리 "지방 시체." 이러한 준비를 참조 한다 고립 된 지방 시체 가능한 적절 한 매체 (게시 되지 않은 결과)에서 알을 품을 때 12 h 이상 유지. 지방이 신체 문화는 뚱뚱한 몸을 내분비학 및 생리학9,10,12,,1516에 관한 질문의 다양 한 해결은 귀중 한 도구 17.
교양된 지방 시체 다양 한 실험 대상이 될 수 있는 고 제어 치료의 타이밍은 조사자에 의해 따라 결정 될 수 있다. 잠복기의 끝에, 지방 기관 수 수집 및 정량16,,1718,19,18 를 더럽혀 서 포함 한 다운스트림 분석에 대 한 처리 20, proteomics21또는 대사체학22. 함께 배양 수 수백의 그룹에 개별 지방 시체에서 다양 한 스케일에서 실험을 수행할 수 있습니다.
여기에 포함 된 대표적인 결과 지방 시체 아미노산 및 vitellogenesis16,17의 혈액 식사 활성화를 시뮬레이션 하기 위해 스테로이드 호르몬 20-hydroxy ecdysone 존재 양식에서 파생 했다 23,24. 우리와 다음 세대 시퀀싱 분석을 통해 활성화 된 지방 기관 대 하지 활성화의 차동 유전자 발현을 비교 분석.

<table><tbody><tr><td>Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fiskars</td><td>83872</td><td></td></tr><tr><td>Fly pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>789060</td><td></td></tr><tr><td>Battery-powered aspirator w/ collection vial</td><td>Hausherrs Machine Works, Inc.</td><td>3740-01-210-2368</td><td></td></tr><tr><td>Fine tip forceps</td><td>World Precision Instruments, Inc.&amp;nbsp;</td><td>500085</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 well plate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CL S3383</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Alanine</td><td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>Arginine</td><td>Sigma</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>Asparagine</td><td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>Aspartic Acid</td><td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>Glutamic Acid</td><td>Sigma</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Histidine</td><td>Sigma</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>Isoleucine</td><td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Phenylalanine</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>Proline</td><td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>Serine</td><td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>Threonine</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>Tryptophan</td><td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>Tyrosine</td><td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Valine</td><td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Methionine</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH8.0&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

fat body organ culture system in aedes aegypti, a vector of zika virus

곤충 뚱뚱한 몸을 곤충 신진 대사 영양소 저장, 간 및 지방 조직 척추 동물에서의 기능을 미러링에 중심 역할을 한다. 곤충 지방 신체 조직 일반적으로 곤충 시체를 통해 배포 됩니다. 그러나, 그것은 종종 복 부에 집중 이며 복 부 체 벽에 부착 된.
모기 지방 몸은 달걀 생산을 위한 중요 한 노 른 자 단백질의 유일한 소스 이다. 모기 지방 신체 조직의 생체 외에서 문화 모기 생리학의 연구에 대 한 중요 한 시스템을 대표 하는 따라서, 신진 대사, 그리고, 궁극적으로, 계란 생산. 뚱뚱한 몸 문화 프로세스 솔루션 및 시 약, 아미노산 재고 솔루션, Aedes 생리 염 분 소금 재고 솔루션 (AP), 칼슘 재고 솔루션 및 뚱뚱한 몸 문화 매체를 포함 하 여의 준비로 시작 합니다. 프로세스 지방 시체 해 부, 실험 치료 다음 계속 합니다. 치료 후, 다른 분석의 다양 한 수행할 수 있습니다, RNA 시퀀싱 (RNA-Seq), 정량, 서쪽 오 점, proteomics, metabolomics 등.
우리의 예제에서는 실험 황열병 모기, Aedes aegypti, 뎅기열, Zika, chikungunya, 등 arboviruses의 주요 벡터에서에서 절단 및 지방 시체의 문화를 통해 프로토콜 보여 줍니다. 컨트롤 대 upregulate 노 른 자 단백질으로 알려진 생리 적인 조건 하에서 경작 하는 지방 시체에서 RNA 유전자 발현의 조사에 대 한이 절차의 잠재적인 유틸리티를 보여 주기 위해 RNA-Seq 분석 대상이 됐다.

예를 들어, 우리는 뚱뚱한 몸을 문화 실험을 수행 하 고 모든 20 자연적 사건 아미노산 및 6 h에 대 한 곤충 스테로이드 호르몬 20-hydroxy ecdysone (10 µ M)의 균형 잡힌된 혼합물을 포함 하는 솔루션에 그들을 배양 하 여 고립 된 지방 시체를 자극 . 컨트롤, 지방 시체는 시간의 동일한 금액에 대 한 APS에 incubated 했다.
부 화, 후 총 RNA 격리 된 제조업체의 지침에 따라 트라이 시 약27 을 사용 하 여 했다. 품질 추출 된 RNA 샘플의 수량 및 분 광 광도 계, fluorometric 정량 및 agarose 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 평가 됐다. RNA 시퀀싱 라이브러리 총 RNA의 4 µ g를 사용 하 여 생성 된 및 두 개의 서로 다른 기술을 사용 하 여 계량 했다. 그 후, 도서관 짝된 끝-시퀀싱에 대 한 상업적인 공급자에 게 보내졌다.
이 실험의 결과 표 6에 표시 됩니다. 유전자 아미노산 및 20-hydroxyecdysone 강한 transcriptional 반응을 보이고 했다 주로 노 른 자 단백질 유전자, 이전 결과11합의입니다.
그림 1 에서는 차동 1,256의 유전자 표현 레벨을 나타내는 열 지도 2 개의 다른 처리 후 교양된 지방 기관에서 유전자 표현.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55508/55508fig1.jpg"> 
그림 1 . 뚱뚱한 몸 문화에 표현 하는 유전자의 열 지도. 열 지도 heatmap 패키지28 R 소프트웨어 환경의 일부를 사용 하 여 다른 라이브러리에 있는 각 유전자에 대 한 특정 사본 수에 따라 계산 했다. 어두운 그늘 높은 유전자 발현을 나타냅니다. 1256 유전자 식에 통계적으로 유의 한 변화를 (Q 값 &#60; 0.05) 표시 됩니다. 유전자 (에 따르면 그들의 계통 발생 관계) 왼쪽에 dendrogram 표시, 그들의 평균된 식 수준에 따라 정렬 됩니다. 아미노산 (AA)와 20-hydroxyecdysone (20E) 자극 후 식 위로 또는 아래로 통제 되는 유전자의 높은 숫자 note APS Aedes 생리 식 염 수를 =. 유전자와 그들의 상대 식 레벨의 목록에 대 한 추가 파일 1 을 참조 하십시오. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/55508fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>아미노산</td>
			<td>분자량 g/mol</td>
			<td>mM 농도</td>
			<td>리터 당 밀리 그램</td>
			<td>300 mL 볼륨에 대 한 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>알라닌</td>
			<td>89.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>2377.19</td>
			<td>713.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아르기닌</td>
			<td>174.2</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4647.66</td>
			<td>1394.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아스파라긴</td>
			<td>150.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4004.67</td>
			<td>1201.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic 산</td>
			<td>133</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3548.44</td>
			<td>1064.53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>시스테인</td>
			<td>121.16</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1293.99</td>
			<td>388.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>글루탐산</td>
			<td>147.1</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3924.63</td>
			<td>1177.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>글루타민</td>
			<td>146</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3895.28</td>
			<td>1168.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>글리신</td>
			<td>75</td>
			<td>53.32</td>
			<td>3999</td>
			<td>1199.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>히스티딘</td>
			<td>155.16</td>
			<td>80</td>
			<td>12412.8</td>
			<td>3723.84</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>이소류신</td>
			<td>131</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1399.08</td>
			<td>419.72</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lycine</td>
			<td>183</td>
			<td>26.68</td>
			<td>4882.44</td>
			<td>1464.73</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>신</td>
			<td>131</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3495.08</td>
			<td>1048.52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>페닐알라닌</td>
			<td>165</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1762.2</td>
			<td>528.66</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>프롤린</td>
			<td>115</td>
			<td>26.68</td>
			<td>3068.2</td>
			<td>920.46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>떠들고</td>
			<td>105</td>
			<td>53.32</td>
			<td>5598.6</td>
			<td>1679.58</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트레오닌</td>
			<td>119</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1270.92</td>
			<td>381.28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트립토판</td>
			<td>204</td>
			<td>10.68</td>
			<td>2178.72</td>
			<td>653.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>티로신</td>
			<td>181</td>
			<td>5.32</td>
			<td>962.92</td>
			<td>288.88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valine</td>
			<td>117</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1249.56</td>
			<td>374.87</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>메티오닌</td>
			<td>149</td>
			<td>10.68</td>
			<td>1591.32</td>
			<td>477.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1입니다. 아미노산 재고 솔루션 X 4입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>50 ml ddH2O에 추가 그램 무게</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>8.0 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.074 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6 H2O</td>
			<td>0.120 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>0.0250 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2. 20 X 소금 재고 솔루션.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>100 ml ddH2O에 추가 하는 그램에 무게</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2-2 H2O</td>
			<td>0.90 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<stron></stron>g > 표 3. 칼슘 재고 솔루션 X 50.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>재고 솔루션의 농도</td>
			<td>100 ml 버퍼에 대 한 음량 주식</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>트리 스 pH8.0</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0.25 M</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>NA</td>
			<td>0.3 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>NA</td>
			<td>100 ml (~ 93 mL)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 4. Tris 버퍼.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>구성 요소</td>
			<td>볼륨 주식 200 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>아미노산 재고 솔루션</td>
			<td>150 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>소금 재고 솔루션</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>칼슘 재고 솔루션</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES 버퍼</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>26 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 5. 뚱뚱한 몸 문화 매체.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>주석</td>
			<td>진 설명</td>
			<td>배 변경</td>
			<td>P-값</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006138</td>
			<td>Vitellogenin-B</td>
			<td>3443</td>
			<td>2.52E-112</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006126</td>
			<td>Vitellogenin-C</td>
			<td>2795</td>
			<td>8.64E-91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006563</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>1002</td>
			<td>2.17E-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010434</td>
			<td>Vitellogenin-A</td>
			<td>220</td>
			<td>1.14E-27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL006542</td>
			<td>vitellogenic carboxypeptidase</td>
			<td>185</td>
			<td>2.14E-65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL012678</td>
			<td>AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%)</td>
			<td>96</td>
			<td>4.00E-70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL000080</td>
			<td>가설 단백질</td>
			<td>82</td>
			<td>6.69E-188</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL015312</td>
			<td>Vitellogenic cathepsin B</td>
			<td>77</td>
			<td>1.27E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL009588</td>
			<td>핵 수용 체 3</td>
			<td>75</td>
			<td>4.58E-56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAEL010529</td>
			<td>가설 단백질</td>
			<td>66</td>
			<td>1.32E-29</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 6. 실험 결과.
보충 파일 1. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55508/Table_of_genes_for_figure_1.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus at JoVE.com

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

뚱뚱한 몸은 곤충에 중앙 대사 기관 이다. 선물이 라이브 기관 문화 시스템 사용자가 다양 한 자극에 격리 지방 몸 조직의 응답 공부입니다.

지방 기관 문화 시스템 Aedes Aegypti, Zika 바이러스 벡터에

The insect fat body plays a central role in insect metabolism and nutrient storage, mirroring functions of the liver and fat tissue in vertebrates. Insect ...

fat-body-organ-culture-system-in-aedes-aegypti-a-vector-of-zika-virus

Research

JoVE Journal

Biology

Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

9.4K 조회수.  New Mexico State University. 뚱뚱한 몸은 곤충에 중앙 대사 기관 이다. 선물이 라이브 기관 문화 시스템 사용자가 다양 한 자극에 격리 지방 몸 조직의 응답 공부입니다.

비디오: Fat Body Organ Culture System in Aedes Aegypti, a Vector of Zika Virus

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

연구

면역학 및 감염병학

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

생물학

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine the rate of infection, disseminated infection, and potential transmission of the virus in the mosquito population in question. These procedures are widely utilized with various modifications in vector competence evaluations globally. They are important in determining the potential role that a given mosquito (i.e., species, population, individual) may play in the transmission of a given agent.

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

The presented protocol can determine the vector competence of Aedes aegypti mosquito populations for a given virus, such as Zika, in a containment setting.

지카 바이러스를 사용하여 Aedes aegypti 모기에 벡터 역량 분석

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of disease cases each year. E. aedis causes mortality and reduced reproductive fitness in the mosquito vector and has been explored for its potential as a biocontrol agent. The protocol we present for culturing E. aedis is based on its natural infection cycle, which involves both horizontal and vertical transmission at different life stages of the mosquito host. Ae. aegypti mosquitoes are exposed to spores in the larval stage. These infected larvae then mature into adults and transmit the parasite vertically to their offspring. Infected offspring are then used as a source of spores for future horizontal transmission. Culturing E. aedis can be challenging to the uninitiated given the complexities of the parasite&#8217;s life cycle, and this protocol provides detailed guidance and visual aids for clarification.

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A protocol to culture the microsporidian parasite Edhazardia aedis. The parasite is passaged from one generation of Aedes aegypti mosquitoes to the next via horizontal transfer at the larval stage followed by vertical transmission at the adult stage. Live sporoplasms survive long-term in infected eggs.

Aedes aegypti 모기에서 현미경 포리디안 기생충 에드hazardia aedis의 전파

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In the laboratory, researchers can deliver animal-derived and artificial blood meals to mosquitoes via membrane feeders, which allow for manipulation of meal composition. Here, we present methods for feeding blood and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes and quantifying the volume consumed by individual females.
Targeted feeding and quantification of artificial/blood meals have broad uses, including testing the effects of meal components on mosquito behavior and physiology, delivering pharmacological compounds without injection, and infecting mosquitoes with specific pathogens. Adding fluorescein dye to the meal prior to feeding allows for subsequent meal size quantification. The meal volume consumed by mosquitoes can be measured either by weight, if the females are to be used later for behavioral experiments, or by homogenizing individual females in 96-well plates and measuring fluorescence levels using a plate reader as an endpoint assay. Meal size quantification can be used to determine whether changing the meal components alters the meal volume ingested or if meal consumption differs between mosquito strains. Precise meal size quantification is also critical for downstream assays, such as those measuring effects on host attraction or fecundity. The methods presented here can be further adapted to track meal digestion over the course of days or to include multiple distinguishable markers added to different meals (like nectar and blood) to quantify the consumption of each meal by a single mosquito.
These methods allow researchers to singlehandedly perform high-throughput measurements to compare the meal volume consumed by hundreds of individual mosquitoes. These tools will therefore be broadly useful to the community of mosquito researchers for answering diverse biological questions.

Feeding and Quantifying Animal-Derived Blood and Artificial Meals in Aedes aegypti Mosquitoes

The goal of this protocol is to deliver animal-derived and artificial blood meals to Aedes aegypti mosquitoes through an artificial membrane feeder and precisely quantify the volume of meal ingested.

Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

Females of certain mosquito species can spread diseases while biting vertebrate hosts to obtain protein-rich blood meals required for egg development. In ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Aedes aegypti 모기 감염 Wolbachia 유지

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...