Bu çalışma aşağıdaki gelen RAW fon tarafından desteklenmiştir: Ulusal Sağlık Enstitüleri K01 DK083512, DP2&#39;deki OD008470, ve R01 DK100237 verir; Dimes Basil O&#39;Connor Başlatan Bilgin hibe # 5-FY12-75 Mart; Bilim ve Biyolojik Bilimler Bölümü Notre Dame Koleji Üniversitesi&#39;nden fon başlatmak; ve Gallagher Ailesi adına Elizabeth ve Michael Gallagher Notre Dame Üniversitesi cömert bir hediye kök hücre araştırmaları teşvik etmek. Maliyeciler çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayımlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz onların destek için Biyolojik Bilimler Bölümü kurmayları teşekkür ederiz ve bizim zebrabalıkları koloninin bakım ve refah onların üstün özveri için Notre Dame de Zebra Araştırma Merkezi. Son olarak, bu çalışma konusunda yorumlar, tartışmalar ve anlayışlar için bizim araştırma laboratuvarında üyelerine teşekkür ederim.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada, biz yetişkin zebrabalıkları nefron segmenti bileşenlerin görselleştirme izin yöntemler tarif etmişlerdir. Floresan dekstran konjügatların enjeksiyonu bu proksimal tübül hücrelerinin 30,38 endositik özellikleri nedeniyle tercihli PCT etiketleme sağlar. Bu yöntem, farklı floresan konjugatlarının bir kuş sürüsü ile elde edilebilir dekstranlar varlığından büyük bir esneklik ile yapılabilir. İkinci etiketleme işlemleri gerekli değildir Buna ek olarak, lizin tamir edilebilir dekstranlar kullanımı PCT kesimleri etiketlemek için özellikle uygun bir yoldur. Bu, nispeten basit bir sinyal tespit edilmesini sağlar ve diğer birçok floresan etiketler, immunolabeling ve raportör transgenik çizgiler kullanımı ile uyumludur. Alkalin fosfataz Etiket aynı zamanda, PST PCT güçlü reaktivite ve biraz daha zayıf bir reaktiviteye sahip, proksimal tübül işaretler. Son olarak, DBA boyama bir ch gösterilecek uzak tübül segmentlerinde, etiketleme sağlararacteristic morfolojisi dallıdır. Immün olmayan kökenli, şeker bağlayıcı proteinler olan çeşitli lektin molekülleri, memeli nefron kesimleri 47 ayırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. O memeli böbreklerde 47. toplama kanalları işaretlemek için kullanılır gibi zebrabalıkları DBA, distal tübül kesimleri ile korelasyon olması ilginçtir. Birlikte ele alındığında, bu yöntemler, böbrek bileşimi ve işlevini belge çeşitli kombinasyonlar halinde kullanılabilir. Bu yöntemlerin hepsi tüm böbrek hazırlıklar kullanılabilir beri, tamamen daha fazla zaman tüketen, sıkıcı yöntemlerle, örneğin, cryosection iş ve immunolabeling kullanımına dayanmadan organın her nefron yapısını ve fonksiyonunu değerlendirmek için araçlar sağlar. Bununla birlikte, bu yöntemler, makalede açıklanan lekeleri cryosection olarak geçerli değildir. Cryosection analizi immünohistokimyası belirli peptidleri algılamak için daha uygundur (bütün montaj kıyasla) örnekleri oluştururDES, ancak elbette bu tip analiz uygun bir birincil antikor kullanılmasını gerektirir. Ne yazık Zebrafish hayvan modeli ile çalışan bir büyük sınırlama antikorların düşük mevcudiyet kalır. Böylece WİSH yani, en yaygın olarak kullanılan kalır &#39;git, gen ekspresyonunun analizi için prosedür. Mor veya kırmızı çökeltileri üretmek için BCIP NBT ve / veya INT substrat reaksiyonlar kullanarak DİLERİZ cryosections floresan boyama ile uyumlu değildir. Bir seçenek floresan WİSH tespiti, zebra balığı embriyonik örnekler için optimize edilmiş olan ve yetişkin böbreğinin kullanım için uygun olabilir bir prosedürün kullanımı çağırmak olacaktır. Bu video makalede yöntemlerin açıklaması ayrı ayrı bölümler gibi eGFP veya mCherry gibi bir muhabir ile etiketlenmiş edildiği transgenik zebrafish hatları ile birlikte floresan, WISH gibi teknikler ile daha fazla deneyler için izin vermelidir. Alternatif olarak, yöntemler, burada tarif edilen edebildiğidiğer hayati boyalar, örneğin, diğer lektinlerin ile kombinasyon halinde test edilebilir d. Böylece, daha fazla uyum ve burada açıklanan yöntemlerin genişleme bütün montaj böbrek hazırlıkları ve analiz için araştırmacının ihtiyaçlarına göre çağırılacak. Bu durumda, bu yöntemler, devam eden yenileme çalışmaları için Zebrafish modeli ile birlikte uygulanması için ve genetik hastalığın modelleme geniş bir potansiyele sahiptir. Böbrek hatalarımız için yenilikçi araştırma ve tedaviler için acil bir ihtiyaç vardır. Milyonlarca insan, konjenital akut ve / veya kronik nedenlerden kaynaklanan her yıl böbrek hastalığı çeşit muzdarip. Ayrıca, böbrek hastalığı prevalansı bu hastalıkları küresel bir halk sağlığı sorunu 14,15 yaparak, dünya çapında yükselmeye devam ediyor. Harici bir diyaliz makinesi böbrekler bu rolü gerçekleştirmek mümkün değilse metabolik atıkların bir hastanın kanını kurtulmak için hizmet sayede örneğin hemodiyaliz gibi tedaviler mevcuttur. Ne yazık kiTedavisi devam eden yaşam için gerekli olduğu, bu müdahale, sınırlamaları vardır. Ayrıca, hastalar en sonunda hasta, bekleme üzerine yerleştirildiği zaman almak için yıllar alabilir bir böbrek nakli gerektirecektir. Hatta bir böbrek nakli aldıktan sonra, birçok hasta prosedürü sonucunda olumsuz etkileri acı ve hayatlarının geri kalanı için bu etkileri savaşmak zorundadır. Bu zorluklar, böbrek hastalığı önlemeye ya da belki de, doku rejenerasyonu 8,16,52,53 ek olarak bir yardımcı olmak için ya da yeni tedavilerin geliştirilmesi için ciddi bir ihtiyaç göstermektedir. Biyomedikal laboratuarlarda insan deneğin kullanımının bariz etik kısıtlamaları göz önüne alındığında, hayvan modeller, insan hastalığının patogenezinde çalışma için yeni tedavilerin testleri için gereklidir. Anatomik benzerlik ve evrimsel yakın bir sonucu olarak, fare, insan hastalıklarının 45 en yaygın olarak kullanılan model olmuştur. Ancak, bu hayvanın belirli sınırlamalar dahil olmak üzere, vardıryetersizlik ing in vivo ve büyük ölçekli genetik ekranlar tamamladıktan pratiklik organ gelişimini görselleştirmek için. Zebra balığı insan hastalığı 45,46 organ gelişimi ve modelleme çalışmaları için uygun bir ve faydalı model organizma vardır. Insan hastalığı ile ilgili olarak, zebrabalıkları fonksiyonel homologları ve insan genlerinin tüm 54,55 yaklaşık% 70 mevcuttur. Son çalışmalar böbrek araştırmalar 31,37,56 birçok alanları için zebrafish programını ortaya koymuştur. AKI sonra Zebrafish yenilenme ve onarım çalışmaları tübül epitel rejenerasyon ve neonephrogenesis oluşur ve 30,37 Timecourse rejenerasyon boyunca üst üste iki süreç olduğunu göstermektedir. Bir aminoglikozid antibiyotik olarak adlandırılan gentamisin kullanımı yetişkin zebrabalıkları 29,30,37 ABH sonuçlarını incelemek için aracılığıyla bir yaralanma paradigması olarak kullanılmıştır. Gentamisin bir yaklaşık olarak iki haftalık bir süre boyunca yaralanmayı takip eden, proksimal tubules yeniden, ve bu arada yeni nefron organı 29,30,37 boyunca oluştururlar. Genel olarak, epitel rejenerasyon düzenleyen mekanizmalar son derece tartışmalı kalır. Tamir işleminin bir önerilen mekanizmasında, lümenine ölü hücre dökülmesi ve ardından başlangıç ​​akut yaralanma olay vardır. Sonra, yeni hücreler ayırt sonra de-farklılaşma, çoğalma ve göç olayları bir dizi, yaralı bazal membran repopulating ve yaralı siteye işlevini geri vardır. Alternatif olarak, diğer çalışmalar yedek hücreler nefron tübüller içinde ikamet kök / progenitör hücrelerden kaynaklanan ileri sürmüşlerdir. Zebrabalıkları neonephrogenesis süreci ile ilgili olarak, hücre agregatları gentamisin enjeksiyon 29,30 tarafından aşağıdaki AKI gözlenmiştir. Bu agregalar sonra zaten mevcut olan tübüllerine 29,30 içine indiğimizde yeni nefron içine olgun. Nefron epitel rejenerasyonu ve neonephr birleştiren ortak konuogenesis onların sırf gizem faktörü: Şu anda bu rejeneratif kahramanlık geçerli anlayışlar vardır daha ortaya nasıl hakkında katlanarak daha sorular vardır. Ancak bugüne kadar, kanıt birkaç heyecan verici çizgileri zebrafish kullanarak böbrek yenilenmesi araştırması gerçekten de doğrudan öteleme potansiyel 56-58 olabilir insan AKI içine ilgili karşılaştırmalı bilgiler sağlayabilir olduğu fikrini desteklemektedir. Kimyasal tarama son histon deasetilaz inhibitörü metil-4-(feniltio) -butanoat (m4PTB) 56,57 tanımlanmasına yol açan zebrafish embriyo böbrek projenitör hücrelerin çoğalmasını arttırmak küçük molekülleri tanımlamak için. Gentamisin kaynaklı AKI ile zebra balığı larvalarına karşı Bu bileşimin uygulanmasıyla larva yaşama ve artmış renal tübüler çoğalması 56,58 gelişmiş olduğunu göstermektedir. Orta işemi ile uyarılan AKI ile farenin m4PTB ile muamele edildi, geri kazanımlarının Assoc hızlandırıldırenal tübüler hücrelerin 58 çoğalan hem tübüler atrofi ve hücre döngüsü tutuklama bir azalma ile iation. Bu bulgular, normal zebra balığı böbrek gelişimi ve / veya AKI rejeneratif tepki sorumlu yollar memelilerin 56 ile konserve olacağını göstermektedir. Böylece, ileri çalışmalar söz konusu sinyalizasyon yolları belirlemek ve bunların etkileşimleri-zebrabalıkları nefroloji alanında bu önemli hedef için bir umut cadde sağlar anlamak rejenerasyon-yani mekanizmalarını ayrı kızdırmak için gerekli iken. Bunlar da bu protokolde tarif nefron hücre etiket gibi araçlar, AKI modellerinde böbrek kompozisyon ve özelliğe değerlendirmek için kullanılabilir tahlillerin bir grubunu temsil eder. Dahası, böbrek hastalığı transjenik modelleri karakterize uygulanabilir ve böbrek baraj sonra nefron yapının restorasyon teşvik edebilen kimyasal terapötik durumların belirlenmesinin yol sağlayabiliryaş.

Böbrek vücutta fizyolojik fonksiyonları yerine getiren bir çok kompleks bir organdır. Böbreğin en önemli işlevi, metabolik atık atılımı olduğunu ve bu görevi yakından sıvı dengesinin korunması ile iç içedir. Böbrek eş zamanlı kan basıncı, elektrolit düzeyleri ve asit-baz dengesini düzenleyen ederken, kan filtreleme ve idrar oluşturarak bu işleri gerçekleştirir. Nefron denilen çok özel epitel tübülleri böbrek 1,2 temel fonksiyonel birim olarak hizmet vermektedir. Yetişkin omurgalılarda, nefron genellikle birçok tübülleri oldukça küçük organ haline paketi dolayısıyla izin veren bir merkezi drenaj sistemini çevreleyen sıkıca sarılmış bir düzende organize edilmektedir. Örneğin, her bir insan böbrek üstü 1.000.000 nefron 3 içerebilir. Fare gibi diğer memeliler böbrek başına 4 8-10 bin nefron sırasına sahip. Böbrek karmaşıklık derecesi, bu memeliler ve diğer vert arasındaki farklılıktoplam nefron sayısında varyasyonlar ve böbrek içindeki mimari düzeni nedeniyle ebrates. Pronephros, mezonefrostan ve metanephros: Omurgalı türlerin çok üç ardışık gelişim sırasında böbrek yapıları ve nefron bağış ve düzenleme ile ilgili artan karmaşıklık her bir form görüntüler oluştururlar. Muhafaza edilmesi son böbrek yapısı yetişkin böbreğinin organ tipik olarak bir ya da mesonephros metanephros 2 olarak hizmet vermektedir. Her bir böbrek şekilde, ancak, nefron bazlı kompozisyon 2&#39;ye sahiptir. Nefron böbrek beygir ve metaboliti salgısı ve reabsorption birlikte kan filtrasyon sorumludur. Nefron epitel hücrelerden oluşan basit tübüler yapılardır ve farklılaşmış epitellerinden ayrık, son derece uzmanlaşmış alanları belirli görevleri yerine hangi segmental bir örgüt daha var. Nefron boyunca süzülen madde akış için, tipik haliyle, üç büyük parçaları Compris ki oradaE her birim: (1) renal korpuskül, proksimal, orta ve distal segmentleri ile (2) bir borucuk, ve (3) bir toplama kanalı 1. Proksimal tübül organik çözücüler, özellikle glükoz ve amino asitlerin 1 geri emiliminin sorumludur. Ara tübül (veya Henle loop) tuz ve su Kural 1 önemli bir sitedir. Son olarak, tuz ve diğer iyonlarının ince ayar tübül içinde ve uzak toplama kanalında ortaya çıkar ve son derece endokrin sistemi 1 tarafından düzenlenir. Oradan, süzüntü sonuçta bir atık ürün 1 olarak vücuttan çıkan, üreter ve mesane üzerinden geçecek. Böbrek fonksiyon kaybı, normal nefron etkinliği önlemek nedenleri çok sayıda kaynaklanıyor olabilir. Bu nedenler böbrek gelişimi, örneğin, yaralanma farklı türde nefron 5 veya nedenleri sakat doğumlara yol konjenital defektler (genetik ve environme hem kaynaklanan sırasında oluşabilirntal kökenleri). Edinsel yaralanmalar geniş akut böbrek hasarı (ABH) veya kronik böbrek hasarı (KBH) olarak kategorize edilir. AKI genellikle iskemi veya toksin maruziyeti 6,7 kaynaklanan böbrek fonksiyonlarında ani bir kaybı içermektedir. Memelilerde, nefron epitel onarım tür yaralanmalarda 8 sonra mümkün olduğunu ve birçok kişi AKI sonra böbrek fonksiyonlarında tam restorasyon sergilerler. % 70 insidans aralığında 6,7 - Ancak, AKI geniş bir 30 arasında rapor edilmiştir, yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkilidir. CKD, aksine, tipik olarak 8,9 fibroz ile bağlantılı uzun süreli hasar yıl kaynaklanan böbrek fonksiyon kaybı ile ilişkilidir. Ya bir diğer 10-12 bireyin yatkınlık gibi ayrıca bir etkileşimi, AKI ve KBH arasında var. Örneğin, AKI muzdarip olanlar CKD ve hatta ölüme 13 daha duyarlıdırlar. Böbrek hastalığı görülme sıklığı, ABD&#39;de hem de dünya genelinde, epide ulaşmıştırmikrofon oranlarda ve yaşlı nüfus böbrek 14,15 için rejeneratif tıp müdahaleleri tanımlamak için artan bir ihtiyaç vardır-bu nedenle genişledikçe artacağı tahmin edilmektedir. AKI hasta kurtarabilirsiniz bu bilgiye rağmen, uzun böbrek doğuştan rejeneratif güçlerine olmayan bir organ olduğu düşünülmektedir. Bu geleneksel görünümünü büyük ölçüde son yıllarda 16 olarak revize edilmiştir. AKI sonra farelerde ve sıçanlarda böbrek hasarı araştıran bir çalışma nefron tübül epitel hücrelerinin çoğalmasını ve fonksiyonel nefron 17-20 yeniden göstermiştir. Memeliler nefron yenilemek için bu adaptif bir yeteneğe sahip olmasına rağmen, böbrek fibrozis ve KBH 21 yol tetiklenebilir önemli sınırlamalar ve uyumsuz tepkiler vardır. Örneğin, yeni bir çalışma kemirgen nefron tekrarlanan epitel hücre ablasyon azalmış rejenerasyon ve hav böbrek fibroz-düşündüren nefron ile ilişkili olduğunu göstermiştiradet rejenerasyon eşik 22 sınırlıdır. Yetişkin memeli böbrek, kayıp ya da hasarlı olanları yerine yeni nefron oluşturan dolayısıyla imha kalıcı bir nefron açığı 8,9 yol açtığına dair kanıt yoktur. İlginçtir, bazı omurgalılar nefron epitelyaya yenileyici tarafından ve aynı zamanda yeni nefron üreterek AKI cevap yok, bir süreç neonephrogenesis veya nefron neojenezi 23 olarak anılacaktır. Neonephrogenesis toksin maruziyeti veya kısmi rezeksiyon sonrası balık oluşur ve yaralanma modelleri tarihsel olarak daha yakın akvaryum balığı 24,25, tilapia 26, paten 27, Medaka&#39;nın 28, ve, Zebra balığı 29,30 dahil ettik. Bunlardan, Zebra balığı böbrek rejenerasyon sorumlu hücresel ve moleküler yollar keşfetmek için uygun bir genetik araştırma modeli sağlar. Bu video makalede, biz yetişkin zebrabalıkları nefron segmentleri etiketlemek nasıl gösterilmektedir. Nefron anatomi, moleküler özellikleri Bilgi,ve fonksiyonel özellikleri zebrafish kullanarak başarılı bir gelecek böbrek çalışmalar için gereklidir. Yetişkin zebrabalıkları böbrek mezonefron yapıdır ve yetişkin memelilerin, kuşlar, sürüngenler 31 bulunan metanephros yapıdan daha nefron sayısında ve organizasyon açısından doğası gereği daha az karmaşıktır. Bununla birlikte, zebra balığı nefron kademeli bir kurum memelilere benzerdir ve birinci gen ekspresyon çalışmaları 31-35 göre embriyonik böbrek belgelenmiştir. Zebra balığı embriyo nefron proksimal kıvrık tübül (PCT) dahil lineer borucuk kesimleri, proksimal düz tübül (PST), distal erken (DE), ve distal geç (DL) 31-35 (Şekil 1) içerir. Zebra balığı yetişkin nefron benzer tüp şeklindeki segmentleri 30,31,36,37 (Şekil 1) sahip. PCT ayrıca fonksiyonel bir fenotip ile tanımlanabilir: PCT epitel hücreleri içinde mevcut floresan etiketli dekstran bileşikleri (boyut olarak 10-70 kDa) bir araya getirecekembriyonik böbrek ve yetişkin zebrabalıkları iki kullanılmıştır dolaşımı, bu proksimal tübül hücreleri 38-41 (Şekil 1) endositik alımını değerlendirmek. Zebra balığı ve memeliler arasında nefron segmentlerinden biri fark Zebra balığı bir ara tubule veya Henle 30-37 döngü yoksun olduğunu; Memelilerde bu segment fonksiyonları su tasarrufu için, ve zebra balığı kendi idrarı konsantre bir aciliyet olmadan bir tatlı su türü olduğundan, bu zebra balığı Bu segmenti 32,33 yoksun olması şaşırtıcı değildir. Bu nedenle, genel olarak, büyük ölçüde bileşimin nefron zebrabalıkları ve memeli böbrek 32,33 arasında muhafaza edilir. Bu benzerlikler gelişimsel nefrogenezisi 32-35,42 sırasında renal ifade edilen genlerin fonksiyonlarını incelemek ve bu şekilde olabilir, insan koşullarının önemli listesine ilave sayısız böbrek hastalıkları 43,44 modellemek için kullanılan bir araştırma aracı olarak zebrafish sağlamıştır kullanılarak incelenmiştirZebra balığı 45,46. Bugün, yetişkin zebrabalıkları böbrek nedeniyle genetik tractability ve bu türün gen fonksiyonu ve sinyal yolları sorgulamak için kullanılabilir teknolojik kaynakların genişleyen damak böbrek rejenerasyon karşılaştırmalı çalışmalar için cazip bir modeldir. Çeşitli çalışmalar AKI 29,30,37 sonra rejenerasyon mekanizmalarının araştırılması için Zebrafish mesonephrosun kullandık. Yetişkin zebrabalıkları böbrek kullanmaya devam AKI araştırma için, nefron işlevselliği ankete farklı nefron bölgeleri ve yöntemleri etiketlemek zarif yöntemler olması esastır. Yetişkin böbrek analizi için çeşitli yöntemler embriyonik böbrek protokollerden adapte edilmiştir. Yetişkin Zebrafish floresan işaretli dekstran enjekte edilmesi, zebra balığı embriyolarının 38-41 (Şekil 1) deki gibi, endositoz yoluyla 30 mezonefron nefron olarak PCT epitel etiketler. Bu yöntem, visualiz için kullanılmıştırproksimal tübüller restore fizyolojik fonksiyonu 30 (Şekil 1) bir değerlendirilmesini sağlar AKI, sonrasında kendi reabsorbing mülkünü geri e. Nefron proksimal tübül bir başka özelliği, bu alandaki epitel hücreleri, endojen alkalin fosfataz faaliyetinin yüksek seviyelerini gösteren bir fırça sınır 37 sahip olmasıdır. Bu nedenle, yakın epitel cin çarpmış (Enzimle İşaretlenmiş Floresans) olarak bilinen bir floresan-dayalı bir teknik kullanılarak 47 -97 yetişkin zebrabalıkları böbrekte görsel olarak tespit edilebilir. Burada, biz proksimal tübül fonksiyonel değerlendirmesini almak ve bu tübül segment boyutu ve konturları harita şekilde, yetişkin zebrabalıkları böbrekte floresan dekstran alımı tayinidir 30,48 gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Sonra, fluoresan bir etiket alkalin fosfataz ile erişkin nefron proksimal tübül bölgelerini etiketlemek için teknikleri açıklar. Üçüncü olarak, ilk kez rhod gösterecekamin-etiketli lektin Dolichos memeli böbrek 49 toplama kanalları genel bir işaretleyici olarak kullanılmaktadır aglutinini (DBA), biflorus, yetişkin zebrabalıkları böbrek uzak tübül işaretler. DBA alkalin fosfataz boyama dışlayan olduğu gibi, bu etiketler geniş yetişkin zebrabalıkları nefronun pan-uzak menziller karşı pan-proksimal ayırt etmek için bir yol sağlar. Bütün montaj ve Kriyostaz histolojik bölümlerde hem de bu floresan lekeleri uygulanması boyunca, benzersiz her nefron segmenti tespit çözünen taşıyıcı genlerin ekspresyon alanları ile bu etiketleri ilişkilidir. Bu nedenle bu protokol de bizim embriyo DİLERİZ protokol 50 dayanan in situ hibridizasyon (DİLERİZ) analizlerinde yetişkin doku bütün montaj için modifiye doku işleme prosedürleri için bir rehber içerir. Bu prosedürler, O morfolojik ve fonksiyonel özelliklerini belge çeşitli kombinasyonlarda (Şekil 2) kullanılabilirf yetişkin zebrabalıkları böbrek nefron. Böylece, bu protokol yenileme çalışmaları, diğer renal hastalık modelleri içinde fenotipik karakterizasyonu uygulanabilir ve hatta yetişkin böbreğinin oluşumunu çalışmak için kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="754">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made by diluting 10 X Pbs in distilled water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbst</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.1% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Pbs with 0.05 % Tween</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">0.05% Tween-20 detergent in 1 X Pbs.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Tween 20</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB02038</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">4% PFA/1X Pbs</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Dissolve 4% PFA (w/v) (Electron Microscopy Sciences, Cat # 19210) in 1 X Pbs, bring to boil on a hot plate in a fume hood. Cool and freeze the aliquots for storage in the freezer at -20&#176;C. Thaw just before use and do not refreeze stocks.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fine Forceps</td>
			<td style="width:99px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS-1050</td>
			<td style="width:321px;">Dumont Tweezers Pattern #55&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Slide</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4445</td>
			<td style="width:321px;">White Frost&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Glass Coverslip</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-540A</td>
			<td style="width:321px;">18 x 18 mm</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Modeling Clay</td>
			<td style="width:99px;">Hasbro</td>
			<td style="width:119px;">Playdoh</td>
			<td style="width:321px;">Other modeling clays can be substituted and work similarly</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Slide Holder</td>
			<td style="width:99px;">Thermo-Fisher</td>
			<td style="width:119px;">12-587</td>
			<td style="width:321px;">Optional: cardboard tray to store slides flat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;">Bleaching solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Bleach Mix Formula (for a 20 mL solution): 
			1.6 mL of 10% Potassium hydroxide solution 
			0.6 mL of 30% Hydrogen peroxide solution 
			100 &#956;l of 20% Tween 
			Fill to 20 mL with distilled water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Hydroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">221473</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">H1009</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Blocking Solution (for a 10 mL solution): 
			8 mL of 1X Pbs with 0.05% Tween 
			2 mL of fetal calf serum 
			150 &#956;l of DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Alkaline phosphatase activity detection</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td style="width:321px;">We utilize the ELF 97 Endogenous Phosphatase Detection Kit.&#160; To prepare the working substrate solution, dilute the substrate 20-fold in the detection buffer, according to the manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Alkaline phosphatase wash solution</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Recipe for Wash Buffer Solution (for a 100 mL solution): 
			5 mL of 0.5M EDTA 
			120 mg of Levamisole 
			95 mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, fluorescein, 40,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1844</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, cascade blue, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1976</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, lucifer yellow, 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1825</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dextran, tetramethylrhodamine (fluoro-ruby), 10,000 MW</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D1817</td>
			<td style="width:321px;">Dilute with distilled water to make a 50 mg/ml stock solution, and store aliquots in the freezer at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dolichos biflorus agglutinin (DBA)-rhodamine</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">RL-10-32</td>
			<td style="width:321px;">DBA Staining Solution (for a 100 &#956;l solution): 
			1 &#956;l of DBA 
			99 &#956;l of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">E6601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:99px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Vectashield Hard Set Mounting Medium</td>
			<td style="width:99px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:119px;">H-1400</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micro cover glass</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td align="right" style="width:119px;">48393081</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Dimethyl Sulfoxide, DMSO</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">67-68-5</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0289</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">EDTA, 0.5M Solution, pH 8.0</td>
			<td style="width:99px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB00502</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Levamisole</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L-9756</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Tissue Freezing Medium</td>
			<td style="width:99px;">Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TFM-C</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue-Tek Cryomold Biopsy, 10x10x5mm</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>4565</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">TruBond 380 Adhesive Microscope Slides</td>
			<td style="width:99px;">Tru Scientific</td>
			<td style="width:119px;">0380W</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Liquid Blocker &#8211; Super PAP Pen</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71312</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Immuno stain moisture chamber</td>
			<td>Evergreen Scientific</td>
			<td>240-9020-Z10&#160;</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cryostat</td>
			<td style="width:99px;">Therm</td>
			<td style="width:119px;">Microm&#8482; HM 525 Cryostat</td>
			<td style="width:321px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">SMZ645; SMZ1000; 83455 P-Blue GFP/DAPI; 83457 P-Endow GFP/FITC; 83457 P-TRITC</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows:&#160; Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The TRITC filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:216px;">Compound microscope</td>
			<td style="width:99px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">96310 C-FL UV-2E/C DAPI; 96311 C-FL B-2E/C FITC; 96313 C-FL Y-2E/C Texas Red</td>
			<td style="width:321px;">Filter set used was as follows: Hoechst/DAPI filter was used for DAPI, propidium iodide, dextran-cascade blue and alkaline phosphatase detection. GFP/FITC filter was used for dextran-FITC, dextran lucifer yellow, and anti-GFP detection. The Texas Red filter was used for dextran-fluoro-ruby, PI, and DBA detection.&#160;&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of nephron composition and function in the adult zebrafish kidney

Zebra balığı modeli böbrek geliştirme, yenilenme ve hastalığı incelemek için ilgili sistem olarak ortaya çıkmıştır. Hem embriyonik ve yetişkin zebrabalıkları böbrekler yüksek omurgalıların memeliler dahil olmak üzere diğer ile muhafaza edilmektedir nefron olarak bilinen bir işlevsel birimler oluşmaktadır. Zebra balığı Araştırma zamanlarda yetişkin nefron hasar meydana sonra iki farklı fenomen sızmak olduğunu göstermiştir: Birincisi, tahrip tübül epitel hücreleri yerine mevcut nefron içinde sağlam yenilenmesi vardır; ikinci olarak, tamamen yeni nefron neonephrogenesis olarak bilinen bir süreç böbrek öncü hücrelerden üretilmektedir. Bunun aksine, insan ve diğer memeliler nefron epitelyal rejenerasyon için sadece sınırlı bir yeteneği var gibi görünmektedir. Bugüne kadar, bu böbrek rejenerasyon olayların sorumlu mekanizmalar anladım kötü kalır. Yetişkin zebrabalıkları böbrekler hem nefron epitel rejenerasyonu ve neonephrogenesis uğradığından, onlar olağanüstü bir deneysel bıraktı sağlamakBu olayları incelemek digm. Ayrıca, böbrek rejenerasyon düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları tanımlamak için kullanılabilir Zebra balığı modelinde mevcut genetik ve farmakolojik araçlar geniş bir yelpazesi var. Bu tür bir araştırma önemli yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirilmesidir. Bu protokol, yetişkin zebrabalıkları böbrek, böbrek ve test bileşimi nefron özelliğe ölçmek için kullanılabilir etiketleme teknikleri yer verilmiştir. Bu durumda, bu yöntemler arasında, ancak bunlarla kısıtlı değildir yetişkin zebrabalıkları böbrek yetmezliği paradigmaların, nephrotoxicant maruz rejimler veya nitroredüktaz aracılı hücre ablasyon tekniği olarak hedef hücre ölümü genetik yöntemler ileride fenotipik nitelendirilmesi için geniş çapta uygulanabilir. Dahası, bu yöntemler, yetişkin böbrek oluşumunda genetik pertübasyonları incelemek için kullanılabilir ve aynı zamanda kronik hastalık modelleme boyunca renal durumunu değerlendirmek için uygulanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney at JoVE.com

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

analysis-nephron-composition-function-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

43.7K Görüntüleme.  University of Notre Dame.  Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır. 

Video: Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Tüm Böbrek İliği Nakli

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Biyoloji

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Organları diseksiyonu

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Yetişkin Zebra balığı içine intraperitoneal enjeksiyon

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Doğrudan Yetişkin Zebra balığı Böbrek Hücre Nakli

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek diseksiyonu

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

Yetişkin Zebra balığı Biyokimyasal Analiz için Kan Alma

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Bir Floresan Gümrükleme Testi kullanarak Zebra balığı Böbrek Fonksiyon Değerlendirilmesi

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...