Bu çalışma Chicago Kadın Kurulu Üniversitesi Wendy Will Vaka Fonu ve Şikago Kapsamlı Kanser Merkezi Destek Hibe Üniversitesi (P30 CA014599) tarafından desteklenmiştir. Bu deneme oluşturmayla katkılarından dolayı Chicago Üniversitesi&#39;nde Sitometrisi Core teşekkür etmek istiyorum ve iyi de Jong laboratuarında diğer üyeleri, özellikle Leslie Pedraza ve Sean McConnell olarak.

Zebra balığı ile ilgili tüm prosedürler Chicago Üniversitesinde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Chicago Üniversitesi, Laboratuar Hayvan Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Birliği (AAALAC) tarafından akredite edilmiştir. 1. Floresanla Etiketli T-ALL Hücrelerini Zebra bağı ile Üretme ve İzole etme <ol><li> Eşzamanlı zebrabalık embriyolarına mikroenjeksiyon <ol><li> Ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak, tol2 transposaz (plazmid DNA kaynağı için Malzeme Tablosuna bakınız) tarafından tanınan ters terminal tekrarlarını içeren plazmid DNA&#39;yı izole edin ve DNA&#39;yı elute edin Steril su içinde. NOT: Bu çalışmada GFP kullanılır, ancak herhangi bir flüoresan proteini işe yarayacaktır. </li><li> PCS2-transposaz (tol2) RNA hazırlayın <ol><li> Ticari olarak temin edilebilir kitleri kullanarak tol2 plazmid DNA&#39;yı izole edin (bakınız tPlazmid DNA kaynağı için Tablo Malzemesi) 12 ve steril suda DNA&#39;yı elute edin. </li><li> Plazmid doğrusallaştırmak için uygun tampon 5 birim NotI kısıtlama enzimi ile 1 saat 37 ° C&#39;de 1 μg tol2 DNA inkübe edin. NotI&#39;yi 65 ° C&#39;de 20 dakika ısı ile inaktive edin. </li><li> Ticari olarak mevcut bir RNA transkripsiyon kiti 13 kullanarak doğrusallaştırılmış DNA&#39;dan tol2 RNA&#39;sını SP6 RNA polimeraz ile kopyalayın 13 . RNA&#39;yı -80 ° C&#39;de tek kullanımlık bölümler halinde saklayın. </li></ol></li><li> 250 ng rag2 : c-myc plazmid DNA, 250 ng rag2 : GFP plazmid DNA, 150 ng tol2 RNA ve 0.5 μL fenol kırmızısı ekleyerek buz üzerine enjeksiyon karışımını hazırlayın. Nükleaz içermeyen su ile hacmi 10 μL&#39;ye ayarlayın. </li><li> ~ 1 nL enjeksiyon karışımını, tek hücreli bir evre syngeneic zebra balığı embriyonunun hücresine enjekte edin, daha önce kurulmuş bir cam kılcal borudan çekilen bir mikroenjektör ve iğne kullanarakBitmiş Yöntemler 8 , 14 . NOT: Transgenik süreç 15 ile üretilen sinsinik zebrafish, transplantasyondan sonra genetik heterojenliği ve bağışıklık reddini ortadan kaldırmak için kullanılır. Bununla birlikte, vahşi tip zebra bifiş veya herhangi bir istenen suş da kullanılabilir. </li><li> Enjeksiyondan 24 saat 48 saat sonra ölü, az gelişmiş veya hatalı biçimlendirilmiş embriyoları çıkarın. </li><li> Enjekte edilen balıkları enjeksiyondan 6 gün sonra balık sistemine yerleştirin ve standart protokole göre yükseltin 6 . </li></ol></li><li> Tarama enjekte edilen zebra balığı ve tümör büyümesinin izlenmesi <ol><li> Enjeksiyondan 21 gün sonra, bir epifluorescent mikroskop (uyarılma band pass: 470/40, emisyon bandpass: 525/50) kullanarak bir Petri kabı ve ekran GFP floresan embriyo orta bir damla tek bir enjekte larva yerleştirin. NOT: Zebra balığı larvaları oHem rag2 : c-myc hem de rag2&#39;yi entegre etmiştir : GFP, yeşil bir flüoresan timusa (pozitif balık) sahip olacak ve timüsün ötesinde habis yeşil fluoresan hücrelerinin genişlemesi gösterebilir. Bir GFP + timüslü tüm balıklar, bir GFP + T-ALL geliştirmeye devam edecektir. Plazmitlerin entegrasyonunu göstermeyen larvalar, herhangi bir yeşil floresan hücresi (negatif balık) içermezler. </li><li> Negatif balı (flüoresans eksikliğine bağlı olarak) ayrı bir tüp içine yerleştirin ve enjeksiyondan 28 ve 35 gün sonra balıkları tekrar izleyin. Enjeksiyondan 28 ve 35 gün sonra, balıkları taramadan önce balık sistemi suyunda% 0.02 tamponlu trikain (MS-222) ile anestezi altına alınız. </li><li> Bir floresan etiketli timüs veya floresan etiketli bir tümör için pozitif olan her bir zebra balığı larva&#39;yı, haftada üç kez tümör büyümesini izlemek için tek bir tanka yerleştirin. </li></ol></li><li> Primer tümör balıklarından floresan etiketli T-ALL hücrelerinin toplanması <ol><li> 0.9x fosfat tamponlu salin (FBS / PBS) içinde en az 20 mL% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetüs sığır serumu hazırlayın. </li><li> Bir şişe heparin sodyum tuzu (300 ünite) 1 mL FBS / PBS ekleyin. </li><li> Vücudun% 50&#39;sinden fazlasındaki balık içeren tümörleri veya yeme veya yüzme konusunda zorluk çeken balıkları seçin. Balıkları tricaine ile aşırı dozda kurutun veya buzlu suyla daldırın. Solunum hareketleri ve kalp atışlarından yoksun olarak ölümü onaylayın. </li><li> Balık başını çıkarmak için traş bıçağı kullanın. </li><li> Aşırı kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için balık kavitesini heparin solüsyonu ile yıkayın. <ol><li> Bir pipet kullanarak, balıkların vücut boşluğuna 100 mcL heparin solüsyonu (adım 1.3.2&#39;de hazırlanmıştır) enjekte edin. Dışa akan tüm sıvıları (kan hücreleri içerecektir) çıkarın ve 1,5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. </li><li> Vücudunu tekrar yıkamak için yeni bir pipet kullanın. En az üç kez yıkayın ya da dökülen sıvı berrak hale gelinceye kadarood. </li><li> Daha sonraki analizlerde kullanılmayacağı için, 1.3.5.1 ve 1.3.5.2 adımlarında yıkamalardaki tüm sıvıyı atın. </li></ol></li><li> Lösemi hücrelerini toplayın. <ol><li> Balıkların vücut boşluğuna 100 μL FBS / PBS enjekte edin. </li><li> Tüm hücreleri sıkmak / itmek için pipetin ucuyla balık gövdesinin dışına nazik bir basınç uygulayın. NOT: Eğer bu adım bir diseksiyon mikroskopu kullanılarak gerçekleştirilirse, vücut boşluğundan dökülen tümör hücreleri belirgindir. </li><li> Her bir yıkamadan 1,5 mL&#39;lik bir mikrosantrifüj tüpüne sıvı ve hücreler toplayın. </li><li> Tümör hücrelerinin çoğu toplanana kadar (genellikle 5-10 defa) adım 1.3.6.1-1.3.6.3&#39;ü tekrarlayın. Tüm tümör hücrelerini aynı 1.5 mL&#39;lik mikrosantrifüj tüpüne alın. Hücreleri oda sıcaklığında tutun. </li></ol></li><li> Adım 1.3.6&#39;daki toplanan tümör hücrelerini, hücrelerin yığınlarını ayırmak için hafifçe pipetleyerek karıştırın. Hücre süspansiyonunu 4&#39;ten0 um gözenekli filtre. Filtre 1-2 kez 100 uL FBS / PBS ile yıkanır. Hücreleri oda sıcaklığında tutun. </li><li> Yeni bir tüpte tripan mavisinin (0.4%, seyreltilmiş 1:10 ve filtrelenmiş) 18 μL&#39;lik hücre süspansiyonunun 2 μL&#39;sini karıştırın. Bir hemositometre üzerine 10 mcL yükleyin ve izole edilmiş tümör hücrelerinin sayısını hesaplamak için canlı (mavi olmayan) floresan hücrelerinin sayısını hesaplayın. NOT: Mavi olmayan GFP negatif hücreler büyük olasılıkla normal, kötü huylu olmayan T hücreleridir ve sayılmamalıdır. Hoechst 33342 ile hücrelerin lekelenmesi için en az 2 x 106 hücre gereklidir. </li></ol></li></ol> 2. Florokimyasal olarak Etiketli T-ALL Hücrelerini, Hoechst 33342 ile Boyanarak Yan Populasyonu Belirleyin <ol><li> 1 mg / mL çalışma konsantrasyonunu oluşturmak için Hoechst 33342 1:10 &#39;ı nükleaz içermeyen H20 ile seyreltin. Boya 4 ° C&#39;de ve karanlıkta saklanmalıdır. </li><li> 1 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 49.1 mg eriterek bir 100 mM verapamil solüsyonu hazırlayın. NOT: Verapamil, ABC taşıyıcılarının bir inhibitörüdür ve yan popülasyon deneyleri için önemli bir kontroltür. Numunelere verapamil ilavesi, ABC taşıyıcılarının Hoechst 33342 boyasını atma kabiliyetini engelleyecektir. Dolayısıyla, verapamil numuneye eklendiğinde doğru bir yan nüfus kaybolur. </li><li> 28 ° C&#39;ye kadar su banyosu yapın. </li><li> Floresansla aktive hücre ayırıcı (FACS) tüplerine hücre ve solüsyon ekleyerek örnekleri ve kontrolleri karanlıkta hazırlayın. <ol><li> Numuneleri, bir FACS tüpüne 10 6 hücre, 15 uL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 μL DMSO ilave ederek hazırlayın. FBS / PBS ile hacmi 1 mL&#39;ye ayarlayın. </li><li> Bir FACS tüpüne 10 6 hücre, 15 uL 1 mg / mL Hoechst 33342 ve 2.5 uL 100 mM verapamil ilave ederek kontrolleri hazırlayın. FBS / PBS ile hacmi 1 mL&#39;ye ayarlayın. NOT: Minimum 10 6 hücre / numune önerilir, ancak özellikle yan populatİyon hücreleri daha ileri analiz için sıralanacaktır. 10 6 hücre / mL&#39;yi aşmayın ve Hoechst 33342 konsantrasyonunu 15 μg / mL&#39;de tutun. 10 x 10 6 hücre lekelenirse, toplam reaksiyon hacmi 10 mL&#39;dir. </li></ol></li><li> Karanlıkta 120 dakika boyunca 28 ° C su banyosunda inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, hücreleri hemen buz üzerine koyun ve karanlıkta tutun. </li><li> Hücreleri 4 ° C&#39;de 6 dakika 300 x g&#39;de peletleyin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL FBS / PBS ile yıkayın. </li><li> Hücreleri 4 ° C&#39;de 6 dakika 300 x g&#39;de peletleyin. Süpernatanı çıkarın. 1 mL FBS / PBS&#39;de hücreleri tekrar süspanse edin. </li><li> Hücrenin sınıflandırılıncaya kadar 4 ° C&#39;de tutun. </li><li> Hücre ayırmadan 15 dakika önce, her bir 1 mL FBS / PBS (son konsantrasyon: 2 ug / mL) 2 μL propidyum iyodür (PI) stokunu (1 mg / mL) ekleyin. İyice karıştırın. </li></ol> 3. Floresanla Etiketlenmiş T-ALL Hücre Popülasyonunda Yan Popülasyonu Bulmak için FACS kullanın <ol><li&gt; Hoechst 33342 boya uyarma için bir UV lazer ve PI uyarma için bir 488-nm lazeri ile ve GFP + T-ALL hücrelerinin saptanması için donatılmış bir hücre sıralayıcı lekeli zebra balığı, T-ALL hücresi süspansiyonları analiz edin. </li><li> canlı için bir kapı belirleyin, GFP + T-ALL hücreleri. <ol><li> kapı üzerinden çöp Kullanım İleri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) alan. NOT: FSC hücre boyutunu ayırt etmek için kullanılır ve SSC hücresinin ayrıntı düzeyini ayırt etmek için kullanılır. </li><li> çiftleri ayırt FSC ve SSC genişliği kullanım. NOT: Alan, boy ve genişlik: detektörleri akış sitometresi ile tanımlanan üç bileşeni vardır. Konum tipik olarak hücrenin floresan ölçmek için kullanılır. Genişliği uçuş süresini ölçen ve iki hücre yığılmaz ve sanki iki kat geniştir. </li><li> Canlı tümör hücreleri için uygun dedektörleri kullanarak PI için GFP için pozitif ve negatif hücrelerin etrafındaki bir kapı çizin (örneğin GFP ve PI için PerCP Cy5-5 için FITC). </li></ol></li><li&gt; Canlı hücre kapısı olarak, (sırasıyla 450/50 ve 670/30), Hoechst Mavi ve Hoechst kırmızı bant geçiş filtreleri içinden Hoechst 33342 floresan ölçer. NOT: Bu kurulduktan sonra yan nüfus varsa, belirgin olacaktır. gerçek bir yan nüfus düşünülmesi için önemlisi, yan nüfus sırayla verapamil kontrolünde kaybolur gerekir. </li><li> başka deneyler için yan nüfus hücreleri sıralama durumunda, büyük meme ucu (100 um) kullanmak ve% 100 FBS 3 mL içeren bir FACS tüpü içine hücreleri toplamak. sıralama sonra hücre canlılığı artırmak için daha büyük bir meme ucu (100 um) yerine daha küçük bir uç (70 um) kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li><li>Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research.">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).</li><li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+system+for+the+study+of+human+disease.">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li><li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+cancer:+the+state+of+the+art+and+the+path+forward.">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li><li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+localization+of+side+population+(SP)+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue.">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).</li><li>Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+kidney+marrow+contains+ABCG2-dependent+side+population+cells+exhibiting+hematopoietic+stem+cell+properties.">Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.</a> Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).</li><li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish.">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299, 887-890 (2003).</li><li>Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+the+frequency+of+tumor-propagating+cells+using+limiting+dilution+cell+transplantation+in+syngeneic+zebrafish.">Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish.</a> J Vis Exp. , e2790 (2011).</li><li>Martelli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+signaling+pathways+in+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+initiating+cells.">Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells.</a> Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).</li><li>Smith, A. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).</li><li>Blackburn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+evolution+enhances+leukemia-propagating+cell+frequency+in+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia+through+Akt/mTORC1+pathway+activation.">Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation.</a> Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Plasmid+Purification.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification.</a> JoVE Science Education Database. , (2016).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, (2007).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li><li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish.">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1993).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+"side+population"+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Komuro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+side+population+cells+(stem-like+cell+population)+in+pediatric+solid+tumor+cell+lines.">Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines.</a> J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).</li><li>Moshaver, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+small+subpopulation+of+candidate+leukemia-initiating+cells+in+the+side+population+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia.">Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia.</a> Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yan popülasyon tahlili oldukça duyarlıdır; Bu nedenle, protokoldeki küçük değişiklikler, yan popülasyon hücrelerinin saptanmasında zorluklara neden olabilir. İlk olarak, boyama aşamasındaki sıcaklık, her bir hayvan / hücre sistemine özeldir. Memeli sistemleri için yan popülasyon tahlili tipik olarak 37 ° C&#39;de yapılır. Zebra balığı T-ALL hücreleri 37 ° C&#39;de inkübe edildiğinde, çoğu hücre öldü ve bu inkübasyon sıcaklığını kabul edilemez duruma getirdi (veriler gösterilmed...

Yan nüfus tahlili hücre zarı ATP bağlayıcı kaset (ABC), taşıyıcı proteinler, yüksek düzeyde bir DNA bağlanma boya Hoechst 33342 akıttığı bir doku içinde belli hücrelerinin gelişmiş yetenek istifade. Hoechst 33342 boya dışa akımı, hücreler boya UV lazeri tarafından uyarılır sonra dual dalga boyu akış sitometrik analizi kullanılarak tespit edilebilir. Bu deney, ilk olarak fare hematopoietik kök hücreler (HSC), 1 tanımlamak için kullanılmıştır, ancak güne kadar bir çok doku ve kanser kök / progenitör hücre popülasyonlarının belirlenmesi için kullanılmıştır (referans 2 de incelenmiştir). Ancak, bütün hücre popülasyonları bir yan nüfusu ve tüm yan popülasyonları kök / progenitör hücreler açısından zenginleştirilmiş olan değil. Zebra balığı, geleneksel fare mo üzerinde avantaj sayı ile insan kanseri 3, 4 çalışmak için güçlü bir omurgalı genetik model sistemKanserin DELS. Balığı embriyolar harici transgenesis ve kanser başlangıcında ve ilerlemesinde de dahil olmak üzere patolojik süreçlerin, in vivo gözlem kolaylaştıran döllenir ve optik açıdan berrak olan edilir. Bugüne kadar, yan nüfus tahlil potansiyel kök veya progenitör hücreler sadece HKH&#39;lerin tespit etmek zebrabalıkları böbrek iliği uygulanır ve herhangi bir Zebra balığı kanser modelleri 5, 6 olmuştur algılamak için. T-hücresi akut lenfoblastik lösemi zebra balığı modeli (T-ALL) morfolojik ve insan T-ALL 7, 8, 11 arasındaki genetik olarak benzer. T-ALL, insanlarda, pediatrik% 10-15&#39;ini ve TÜM vakaların 9 yetişkin% 25&#39;i oluşturuyor saldırgan kanseridir. T-ALL tedavisi geliştirilmiş olsa da, nüks hala yaygındır ve kötü prognoz ile ilişkilidir. T-ALL tümörler Heterojen olanLösemi başlatan hücreler (LIC&#39;ler dahil olmak üzere birçok farklı tümör hücresi alt popülasyonu içerir. LIC&#39;ler tek bir hücreden tüm tümörü yeniden başlatma kabiliyetleri ile tanımlanır ve bir tümör hücre popülasyonu içerisindeki LIC&#39;lerin sıklığı, sınırlayıcı bir seyreltme transplantasyon testi (LDA) aracılığıyla çeşitli hücre dozlarını alıcılara naklederek hesaplanabilir. LICs 8 , 10 , 11 frekansını hesaplamak için zebrafish&#39;de LDA deneyleri yapılırken, bu belirleme gezinme sırasında yapılır ve LIC&#39;lerin prospektif izolasyonuna izin vermez. Bu nedenle, kanserli kök hücre aktivitesi için zenginleştirilmiş bir popülasyonu prospektif olarak izole etmek için bir yöntem bulunmamaktadır. Zebra balığı T-ALL&#39;lerinden yan popülasyon hücrelerinin belirlenmesi ve izole edilmesi bu eksikliği gidermeye yönelik ilk adımdır. Burada sunulan protokol, Zebr&#39;de T-ALL tümörlerinin nasıl verimli bir şekilde üretileceğini açıklamaktadırafish tol2 aracılı transgenesis kullanan T-ALL tümörler hücreleri hasat ve hücrelerin yan popülasyonu tespit Hoechst 33342 ile boyanır. Zebra balığı, T-ALL in vivo deney gelecek yan popülasyonu, hücrelerin Lics için zenginleştirilmiş ya da diğer stem- veya projenitör benzeri özelliklere sahip olup olmadığı içerebilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Syngeneic zebrafish (CG2)</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">See Mizgireuv et al., 2006</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">rag2:c-myc plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">rag2:GFP plasmid constructed in de Jong Lab</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:208px;">rag2 promoter from Langenau Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">pCS2-transposase plasmid</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td>Chien Laboratory</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">NotI -HF restriction enzyme</td>
			<td style="width:199px;">New England Bio-Labs Inc.</td>
			<td>R3189S</td>
			<td>500 units in 25 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:245px;">mMessage Machine SP6 Transcription Kit</td>
			<td style="width:199px;">Ambion</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific - AM1340</td>
			<td>25 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:199px;">Qiagen, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">12643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">SteREO Discovery V8 Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>495015-0008-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Digital microinjector</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Brass straight-arm needle holder</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Magnetic base and stand</td>
			<td style="width:199px;">Tritech Research</td>
			<td>MINJ-HBMB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:199px;">Narishige International</td>
			<td style="width:208px;">MN153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Glass capillaries</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">B100-50-10</td>
			<td>10 cm without filament</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Flaming/Brown micropipette puller</td>
			<td style="width:199px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:208px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Microloader pipette tips</td>
			<td style="width:199px;">Eppendorf North America Inc.</td>
			<td>930001007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phenol Red solution</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">P0290</td>
			<td>0.5% concentration 100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Plastic Transfer pipettes</td>
			<td style="width:199px;">Fisherbrand</td>
			<td>137119D</td>
			<td>graduated 7.5 mL bulb</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Tricaine methanesulfonate (MS-222)</td>
			<td style="width:199px;">Western Chemical, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - NC0342409</td>
			<td>100 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:199px;">HyClone Laboratories, Inc.</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific - SH3007103</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:199px;">Gibco by Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">1001-023</td>
			<td>pH 7.4 (1x) - 500 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Heparin sodium salt</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:208px;">2106</td>
			<td>15 - 300 unit vials</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">40 um mesh filter</td>
			<td style="width:199px;">Falcon Corning Brand</td>
			<td style="width:208px;">352340</td>
			<td>Case of 50</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">T8154</td>
			<td>20 mL - Solution (0.4%)</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Hoechst 33342</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">H3570</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Verapamil</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">V4629</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma Life Science</td>
			<td style="width:208px;">D8418</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">Propidium Iodide</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:208px;">P3566</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">FACSAria Fusion cell sorter</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">BD FACSDiva 8.0.1</td>
			<td style="width:199px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:245px;">FlowJo v10.2</td>
			<td style="width:199px;">FlowJo, LLC</td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of the side population in myc-induced t-cell acute lymphoblastic leukemia in zebrafish

Hem sağlıklı hem de habis dokudan heterojen hücre popülasyonları, DNA bağlama boyası Hoechst 33342&#39;yi dışarı atma yeteneği ile karakterize bir hücre popülasyonu içerebilir. Hücrelerin bu &quot;yan popülasyonu&quot;, Hoechst 33342&#39;den sonra akış sitometrik yöntemleri kullanılarak tanımlanabilir Boya ultraviyole (UV) lazerle uyarılır. Birçok hücre tipinin yan popülasyonu stem veya progenitor benzeri hücreler içerir. Bununla birlikte, tüm hücre tiplerinin tanımlanabilir yan popülasyonu yoktur. Danio rerio , zebrafish, T hücreli akut lenfoblastik löseminin (T-ALL) sağlam bir in vivo modeline sahip ancak bu zebra bağı T-ALL&#39;lerin bir yan popülasyonu olup olmadığı bilinmiyor. Burada açıklanan yöntem, zebra balığı T-ALL&#39;deki yan popülasyon hücrelerinin nasıl izole edilebileceğini açıklamaktadır. Başlamak için, zebra balığı içindeki T-ALL, tol2 plazmidlerinin bir hücre evresi embriyolarına mikroenjeksiyonu yoluyla üretilir. Tümörler aniden yarısından fazlasına genişlediği bir aşamaya geldiğindeMalın vücudu, T-ALL hücreleri hasat edilebilir. Hücreler daha sonra Hoechst 33342 ile lekelenir ve yan popülasyon hücreleri için akış sitometrisi ile muayene edilir. Bu yöntem, zebra balığı T-ALL araştırmasında geniş uygulamalara sahiptir. Zebra balığı içinde bu yan popülasyon hücrelerinin kanserli kök hücre benzeri olup olmadığını teyit eden bilinen bir hücre yüzeyi belirteçleri bulunmamakla birlikte, in vivo fonksiyonel transplantasyon testleri mümkündür. Ayrıca, bu yan popülasyon hücrelerinin genetik özelliklerini tanımlamak için tek hücreli transkriptomikler uygulanabilir.

Zebra balığı içinde fluoresan myc kaynaklı T-ALL tümörleri verimli bir şekilde üretmek için, tol2 transposaz bölgeleri ile çevrili dairesel DNA yapıları tol2 RNA ile birlikte enjekte edilebilir. Doğrusallaştırılmış DNA&#39;nın zebrafish embriyolarına enjeksiyonundan önceki çalışmalar,% 5 transgenesis oranı 8 bildirmektedir. Protokol, tol2 aracılıklı transgenezi içerecek şekilde ayarlandığında,% 10-44 arasında değişen transgene...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish at JoVE.com

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir.

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

6.5K Görüntüleme.  The University of Chicago.  Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir. 

Video: Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

HIV-1 tropizm genotipik Çıkarım kullanarak Nüfus tabanlı Sıralama V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Yenidoğan ve Erişkin Merkezi sinir sisteminin Kültüre Mikroglia

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.