Bu çalışma sırasıyla Dana-Farber Kanser Enstitüsünde ve Güney Kaliforniya Üniversitesi&#39;nde Fiziksel Bilimler-Onkoloji Merkezleri (PS-OC) kurmak üzere U54CA143798 ve U54CA143907 Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) Grants tarafından finanse edildi. SM Mumenthaler, bu çalışmaların bir kısmını destekleyen bir PS-OC trans-network ödülü aldı. Operetta HCS platformunu bağışları için hayırsever taraftarlarımıza, özellikle Stephenson ailesi, Emmet, Toni ve Tessa&#39;ya en büyük şükranlarımızı sunmak istiyoruz. Rehberlik için J. Foo&#39;ya ve Uygulamalı Moleküler Tıp Merkezi ekip üyelerine de teşekkür ederiz: D. Agus klinik rehberlik ve mentorluk için, K. Patsch deneysel tasarım ile anlamlı tartışmalar için R. Rawat, görüntü analiz protokollerinde yardım için , J. Katz, Operetta ile teknik yardım için, ve P. Macklin ve D. Ruderman&#39;a yararlı tartışmalar ve geri bildirimler.

1. Hücre Kültürü NOT: Akciğer fibroblastları (CCD-19Lu GFP) ile birlikte kültürlendiğinde, burada NSCLC hücrelerinin (H3255) fenotipik yanıtları EGFR hedefleyici ajan erlotinib&#39;e araştırılmıştır. Aynı veri seti için, iki hücreli popülasyonun (H3255 ve CCD-19Lu GFP) florasan esaslı ve morfolojiye dayalı sınıflamaları, uyumlarını örneklemek için gerçekleştirildi. Bununla birlikte, yalnızca bir sınıflandırma metodunun kullanılması gerekmekte ve uygulama temel alınarak seçilmesi gerekmektedir. <ol><li> % 10 ısı ile inaktif FBS ve% 1 penisilin / streptomis ile desteklenmiş 500 mL RPMI-1640 hazırlayın. NOT: Büyüme ortamı ve takviyeleri diğer hücre tipleri için gerektiği gibi değiştirilebilir. </li><li> 37 ° C&#39;de% 5 C02&#39;de saf popülasyonlar olarak 10 cm3 plakalarda kültür hücreleri ve 3-4 günde bir uygun oranda geçirin. </li></ol> 2. Hücrelerin Hazırlanması <ol><li> Bir hücre süspansiyonu hazırlamak için, cOrtamları çalkalayın ve hücreleri 5 mL 1X Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) ile yıkayın. </li><li> PBS&#39;yi aspire edin, 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılan 1 mL% 0.05&#39;lik tripsin ekleyin ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin (veya hücreler artık plakaya yapışana kadar). </li><li> Tripsin nötralize etmek için H3255 ve CCD-19Lu GFP plakalarına 4 mL RPMI ekleyin ve hücre solüsyonlarını 15 mL konik tüplere pipetleyin. </li><li> RT&#39;de 5 dakika boyunca 150 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı aspire edin ve topak hazırlamak için konik tüpler içinde RPMI medya 10 ml hücre peletleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li></ol> 3. Hücre Kaplama <ol><li> Tohumu standartlaştıracak hücreleri sayın. <ol><li> Çözeltilerdeki hücreleri karıştırmak için tüpleri tersine çevirin. Bir mikrosantrifüj tüpü içine her bir hücre süspansiyonu 10 mcL Pipet ve 10 mcL trypan mavi ekleyin. </li><li> Bir hücre sayma slaydına bu çözeltiden 10 μL pipetleyin ve otomatik hücre sayacına yerleştirin. NOT: Diğer hücre sayımı yöntemleri ( örn.. Hemositometre) kullanılabilir. </li><li> Hücre sayısını en az üç kez tekrarlayın veya elde edilen sayılar tutarlı olacak şekilde yapın. </li></ol></li><li> Çok iyi plaka üzerine tohum hücreleri NOT: Çekilecek tabaklar sayısı görüntülenecek olan zaman noktalarının sayısına bağlıdır. Alternatif olarak, hücreler, histone-2B-GFP (veya yeterli nükleer bölünme sağlayan diğer kararlı lentiviral nükleer lekeler) ile transforme edilirse, bir plaka zamanla yeniden görüntü haline getirilebilir. <ol><li> 100 mcL RPMI&#39;de toplam 1.500 hücre / kuyu tohumlandı. Üç hücre popülasyonunu plakaya üç hücre süspansiyonu hazırlayın: H3255, CCD-19Lu GFP ve% 50 H3255 +% 50 CCD-19Lu GFP. Her bir zaman noktası için her birini aynı plakalarla üçlü olarak yapın. NOT: İlk ekim yoğunluğu, her hücre hattı ve plaka boyutu için optimize edilmelidir. </li><li> Çok kanallı bir pipet kullanarak 3 x 96 oyuklu plakalarda tohum hücreleri. Hücreleri O / N 37 ° C,% 5 CO 2&#39;de inkübe edin. </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 4. İlaç Dozajlama <ol><li> 10 mM konsantrasyonda nihai bir erlotinib stok solüsyonu yapmak için erlotinib tozuna DMSO ekleyin. NOT: İlaç istenildiği şekilde ikame edilebilir. </li><li> İlacı hücre kültürü ortamı ile, 10 uM&#39;de en yüksek nihai konsantrasyona sahip olan nihai konsantrasyonun 2 katı olacak şekilde seyreltin ve toplam beş ilaç konsantrasyonu ve ilaç kontrolü olmaksızın, 1: 10 oranında dört defa seyreltin. NOT: DMSO konsantrasyonu, en yüksek ilaç dozunda% 0.1 v / v&#39;ye eşitse veya bunu aşarsa, gözlemlenen etkilerin DMSO toksisitesinden kaynaklanmadığından emin olmak için hiçbir ilaç kontrolü eşdeğer miktarda DMSO içermemelidir. </li><li> Ortamda seyreltilmiş 1x&#39;lik nihai bir ilaç konsantrasyonu için uygun çözeltiye 100 μL&#39;lik ilaç solüsyonu pipetleyin. </li></ol> 5. Görüntü Edinimi NOT: Görüntüler 0, 2 ve 3. günlerde elde edildi. Çalışılan hücre tiplerine ve hücresel proseslere bağlı olarakArzu edilen zaman noktaları çalışılabilir. <ol><li> Leke hücreleri görüntülemeye hazırlanın. <ol><li> Boya çözeltisini, aşağıdaki son konsantrasyonlarda hazırlayın. <ol><li> Floresan bazlı sınıflandırma için PBS içinde 5 μg / mL nükleer leke ve 5 uM ölü hücre lekesi hazırlayın (Malzeme Listesine bakın). </li><li> Morfoloji bazlı sınıflandırma için 5 μg / mL nükleer leke, 5 uM ölü hücre lekesi ve PBS&#39;de 5 μM hücre lekesi hazırlayın (Bkz . Malzeme Tablosu ). </li></ol></li><li> Her göze 20 μL boya çözeltisi ekleyin. Işıktan korunarak 37 ° C&#39;de 30 dakika inkübe edin. </li></ol></li><li> Optimize edin ve görüntü elde edin. <ol><li> Kuluçka makinesinden çanağı çıkarın, plakanın tabanını% 70 EtOH ile silin ve plakayı görüntüleme odasına yerleştirin. </li><li> &#39;Kurulum&#39; sekmesinde, kanal seçimi bölümüne uygun kanallar eklemek için &#39;Kanal Seçimi&#39;nin altındaki&#39; + &#39;düğmesini tıklayın.Görüntü ( yani parlak alan, nükleer leke, ölü hücre lekesi, GFP ve RFP sinyalleri). </li><li> &#39;Düzen Seçimi&#39;ni tıklayın ve odak düzlemini tanımlamak için 0 μm&#39;den başlayan ve 20 μm&#39;de biten her 2 μm&#39;de z istifli test görüntüleri alın. Bu mesafeyi her kanal için &#39;Yükseklik&#39; altına girin. </li><li> Ağırlıkları değerlendirmek ve pozlama sürelerini optimize etmek için her kanalın altındaki &#39;Anlık Görüntü&#39;yü tıklayın. Gerektiğinde &#39;Zaman&#39; başlığının altına daha yüksek veya daha düşük değerler girin. </li><li> Ekranın sağ tarafında, plaka şemasında uygun oyukları (görüntülenecek) vurgulayın. Aşağıdaki kuyu şasesinde, benzer şekilde görüntülenecek yirmi beş alanı vurgulayın. </li><li> Yukarıdaki kanallarda gri ölçekli TIFF görüntüleri oluşturmak için &#39;Deneme Çalıştır&#39; altında, sol sekmede &#39;Plaka Adı&#39; içindeki plakayı belirleyin ve resim edinme protokolünü 10X&#39;lik bir hedefle çalıştırmak için &#39;Başlat&#39; düğmesine (altındaki) tıklayın. NOT: Adım adım yöntemGörüntüleme protokolü için rölötikler aletler arasında farklılık gösterebilir ancak parametre değerleri yine de optimize edilmelidir. </li><li> İkinci ve üçüncü günlerde görüntülemeyi tekrarlayın. </li></ol></li></ol> 6. Görüntü Analizi NOT: Tüm görüntü analizi, tescilli yazılım kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu genel olarak mevcut olmadığı için, CellProfiler 2.2 ve CellProfiler Analyst 2.0&#39;da aşağıda listelenen kısa bir protokol ve ek materyal olarak sunulan ayrıntılı protokol ile karşılaştırılabilir analizler de tasarlanmıştır (test görüntüleri iş akışını test etmek için boru hatlarına önceden yüklenmiştir). Bu deneydeki görüntüler, her kuyunun ayrı ayrı yüklenebilmesi için kuyu başına de gruplanmıştır. Aşağıdaki CellProfiler boru hatları, her resim dosyasından meta veri bilgilerini ayrıştıran ve görüntülerin kanal tarafından daha da gruplandırılmasını sağlayan bir normal ifade içermektedir. <ol><li> Açık kaynak yazılımını indirin ve yükleyin: &#39;CellProfiler9; Ve &#39;CellProfiler Analisti&#39;. Yükleme sırasında tüm varsayılan seçenekleri ve eklentileri kabul edin. </li><li> Heteroselüler kültürleri alt popülasyonlara sınıflandırın. <ol><li> &#39;CellProfiler&#39; yazılımını açın, &#39;Dosya&#39; | &#39;İthalat Boru Hattı&#39; | &#39;Dosyadan&#39; ve uygun dosyayı seçin (floresans tabanlı sınıflandırma için &quot;Fluorescence_Classification.cppipe&quot; veya morfoloji tabanlı sınıflandırma için &quot;Morphology_Classification.cppipe&quot;). NOT: Bu dosyalar temel görüntü işleme ve çekirdek / hücre bölütlemesi için protokoller içerir. Bu hücreler arasında bulunan düzensiz Hoechst lekesi nedeniyle, çekirdekler bölünmüş ve büyütülmüş ve daha sonra çekirdeklerin daha düşük yoğunluklarla bölümlenmesine olanak tanımak için görüntüyü maskelemek için kullanılmıştır. <ol><li> Hücreleri, eGFP yoğunluğuna dayalı olarak H3255 veya CCD-19Lu olarak sınıflandırmak ve morfoloji özelliklerini hesaplamak için flüorüre dayalı sınıflandırma boru hattını seçin. NOT: CCD-19Lu hücreler GFP ile transforme edildi. </li><li> Çekirdekleri ve hücreleri segmentlere ayırmak ve morfoloji özelliklerini hesaplamak için morfolojiye dayalı sınıflandırma boru hattını seçin. NOT: Sınıflandırma için &#39;CellProfiler Analyst&#39; de daha aşağı doğru analiz gereklidir. Ölü hücreler, flüorüre dayalı sınıflandırma yoluyla sınıflandırılır. </li></ol></li><li> Ekranın sol alt köşesindeki &#39;Çıktı Ayarlarını Görüntüle&#39;yi tıklayın. Analiz amaçlı görüntü dosyalarının konumunu (&#39;Varsayılan Giriş Klasörü&#39;) ve çıkarılan verilerin hedefini (&#39;Varsayılan Çıktı Klasörü&#39;) seçin. </li><li> Analiz işlemine başlamak için &#39;Analiz Et görüntüleri&#39; seçeneğini tıklayın. Analiz tamamlandığında, hesaplanan verileri görüntülemek için &#39;Tamam&#39;ı tıklayın ve&#39; Varsayılan Çıktı Klasörüne &#39;gidin. NOT: Örnek parametre değerleri ve resimleri Ek Dosya 1-CellProfilerProtocol.pdf&#39;de mevcuttur . </li><li> Morfolojiye dayalı sınıflandırma için (yalnızca) aşağıdakileri yapın. <ol><li> &#39;CellProfiler Analyst&#39; yazılımını açın, CellProfiler&#39;de oluşturulan veritabanı özellikleri dosyasını seçin ve &#39;Aç&#39; seçeneğini tıklayın. </li><li> Ekranın sol üst kısmındaki &#39;Sınıflandırıcı&#39; sekmesini tıklayın. Denemeden rastgele hücre görüntüleri çağırmak için &#39;Getir&#39;i tıklayın; Resimler sınıflandırılmamış pencerede görünecektir. </li></ol></li><li> Hücreleri uygun kutuya seçip sürükleyerek elle hücreleri pozitif (H3255) veya negatif (CCD-19Lu) olarak sınıflandırın (bkz. Ek Dosya 2-Boru Hattı.pdf: Şekil B ). Alt popülasyon başına en az 50 hücre sınıflandırdıktan sonra, &#39;Sınıflandırıcıyı Eğitin&#39;i tıklayın ve ardından&#39; Progress&#39;i izle&#39;yi tıklayın. NOT: Hücreler, kullanıcı denetimli random orman makinesi öğrenme algoritması 12 üzerinden sınıflandırılır. Doğruluk onaylanmış eşiğin (&gt;% 90) üzerinde değilse, geri dönüp &#39;CellProfiler&#39; üzerindeki hücre segmentasyonunu optimize etmek gerekebilir veya hücreler sınıf için ideal olmayabilirMorfoloji ile yenerek. </li><li> Her alt popülasyon için hücre sayıları içeren bir tablo oluşturmak için &#39;Tümüne Puan Ver&#39;i tıklayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kanemura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+in+vitro+proliferative+activity+of+human+fetal+neural+stem/progenitor+cells+using+indirect+measurements+of+viable+cells+based+on+cellular+metabolic+activity.">Evaluation of in vitro proliferative activity of human fetal neural stem/progenitor cells using indirect measurements of viable cells based on cellular metabolic activity.</a> J Neurosci Res. 69 (6), 869-879 (2002).</li><li>Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+the+pH+dependence+of+3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium+bromide-formazan+absorption+on+chemosensitivity+determined+by+a+novel+tetrazolium-based+assay.">Effects of the pH dependence of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide-formazan absorption on chemosensitivity determined by a novel tetrazolium-based assay.</a> Cancer Res. 49 (16), 4435-4440 (1989).</li><li>Hsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+tea+polyphenols+induce+differentiation+and+proliferation+in+epidermal+keratinocytes.">Green tea polyphenols induce differentiation and proliferation in epidermal keratinocytes.</a> J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 29-34 (2003).</li><li>Caicedo, J. C., Singh, S., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+in+image-based+profiling+of+perturbations.">Applications in image-based profiling of perturbations.</a> Curr Opin Biotechnol. 39, 134-142 (2016).</li><li>Sero, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+shape+and+the+microenvironment+regulate+nuclear+translocation+of+NF-kappaB+in+breast+epithelial+and+tumor+cells.">Cell shape and the microenvironment regulate nuclear translocation of NF-kappaB in breast epithelial and tumor cells.</a> Mol Syst Biol. 11 (3), 790 (2015).</li><li>Chen, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclassification+of+prostate+cancer+circulating+tumor+cells+by+nuclear+size+reveals+very+small+nuclear+circulating+tumor+cells+in+patients+with+visceral+metastases.">Subclassification of prostate cancer circulating tumor cells by nuclear size reveals very small nuclear circulating tumor cells in patients with visceral metastases.</a> Cancer. 121 (18), 3240-3251 (2015).</li><li>Ohlund, D., Elyada, E., Tuveson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+heterogeneity+in+the+cancer+wound.">Fibroblast heterogeneity in the cancer wound.</a> J Exp Med. 211 (8), 1503-1523 (2014).</li><li>Paraiso, K. H., Smalley, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast-mediated+drug+resistance+in+cancer.">Fibroblast-mediated drug resistance in cancer.</a> Biochem Pharmacol. 85 (8), 1033-1041 (2013).</li><li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+and+function+of+fibroblasts+in+cancer.">The biology and function of fibroblasts in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).</li><li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens.">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9, 482 (2008).</li><li>Dao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler+Analyst:+interactive+data+exploration,+analysis+and+classification+of+large+biological+image+sets.">CellProfiler Analyst: interactive data exploration, analysis and classification of large biological image sets.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3210-3212 (2016).</li><li>Garvey, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-content+image-based+method+for+quantitatively+studying+context-dependent+cell+population+dynamics.">A high-content image-based method for quantitatively studying context-dependent cell population dynamics.</a> Sci Rep. 6, 29752 (2016).</li><li>Juarez, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+differences+in+cell+line+population+dynamics+using+CellPD.">Quantifying differences in cell line population dynamics using CellPD.</a> BMC Syst Biol. 10 (1), 92 (2016).</li><li>Mumenthaler, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Impact+of+Microenvironmental+Heterogeneity+on+the+Evolution+of+Drug+Resistance+in+Cancer+Cells.">The Impact of Microenvironmental Heterogeneity on the Evolution of Drug Resistance in Cancer Cells.</a> Cancer Inform. 14, 19-31 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates14. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.
Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features. 
For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately. 
While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations. 
In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors13,15.

Hücre bazlı tahliller, temel araştırma ve ilaç geliştirme ayarlarında önemli bir yere sahiptir. Bununla birlikte, bu standart tayinlerin sınırlamaları, in vitro ve klinik veriler arasındaki uyumsuzluk ve çoğu ilaçların FDA onayını almaması nedeniyle giderek daha belirgin hale gelmiştir. Burada, eşzamanlı olarak ortaya çıkan çevre uyarılarına yanıt olarak heterosellüler fenotipleri eş zamanlı olarak analiz etmek için kantitatif görüntülemenin kullanılması için yeni bir yöntem sunuyoruz. Hücrenin yaşayabilirliğini ölçmek için kullanılan geleneksel hücre bazlı tahliller şunları içerir: tripan mavisi dışlama testleri, MTT / MTS ve Annexin V-FITC akış sitometrisi boyaması. Tripan mavisi dışlama testleri, basit ve ucuz olsa da, çok sayıda hücre gerektirir, zaman alıcıdır ve genellikle kullanıcı tarafından önyargılanmadan etkilenir 1 . MTT ve MTS tahlilleri, mitokondriyal metabolik hız ölçümleri yoluyla dolaylı olarak hücre yaşayabilirliğini ölçer. Bununla birlikte, metabolik aktiviteHücrelerin türleri, yanlış sonuçlara yol açan ve hücre tipleri ve koşulları 2 , 3&#39;te standartlaşmayı önleyen farklı kültür koşullarından (örneğin, ortam veya oksijen konsantrasyonu) etkilenebilir. Bu tekniklerin bir başka büyük dezavantajı, çoklu hücre tiplerini ayırt edememeleridir - çoğu biyolojik sistem heterosellülerdir. Akış sitometrisi yöntemleri çoklu hücre popülasyonları arasında ayırt etme yeteneğine sahipken, hücre etiketleri gereklidir, dinamik örnekleme zorludur ve yapışkan hücreler kullanıldığında bu uygulama zaman alıcı ve hata eğilimli hale gelir. Morfolojik değişiklikler de dahil olmak üzere diğer önemli hücresel fenotipler, çevresel uyaranlara yanıt olarak ortaya çıkar ancak geleneksel hücre bazlı tahliller tarafından yakalanmaz. Hücre durumlarını morfolojik karakterizasyon yoluyla profilleme ve benzerliklerini örnekler arasında haritalama,Temel hücre biyolojisi ve ilaç keşfi de dahil olmak üzere temel ve translasyonel araştırmaların birçok yönüne yeni anlayışlar kazandırmak. Ayrıca, tümör hücresi morfolojisinin tümör alt tipi 5 ve saldırganlık 6 ile korele olduğu gösterilmiştir. Dolayısıyla, bu hücresel özellikleri ve bunların belirli çevresel rahatsızlıklarla nasıl ilişkili olduklarını incelemek çok önemlidir. Ek olarak, ortak kültür sistemlerinde alt popülasyonlar arasında ayrım yapmak için morfolojik özelliklerin farklılıklarını kullanabilir. Floresan olarak etiketlenen hücrelerin düşüşleri vardır ( yani doğal hücre özelliklerini değiştirerek zaman alıcıdır) ve bu nedenle hücre tiplerini sınıflandırmak için ilave yöntemler avantajlıdır. Mikroskopi tabanlı görüntüleme, hücresel fenotipe çok katlı, kantitatif ve sağlam bir şekilde profil oluşturmada alternatif bir yöntemdir. Bu el yazmasında, nicel görüntüleme hattını, evriminBir tümör içindeki heterojen hücre popülasyonlarının nary dinamikleri. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) hücreleri ile tümörlerde bulunan en yaygın stromal hücre türü Kanserle İlişkili Fibroblastlar (CAF) arasındaki etkileşime odaklanırız. CAF&#39;ler tümörün başlatılması, ilerlemesi ve terapötik tepki ile ilişkilendirilmiştir; Bu nedenle CAFs yokluğunda tümör hücreleri üzerinde fenotipik analizler yapmak 7 , 8 , 9 yanıltıcı olabilir. Özellikle, KKH&#39;lerin klinik tedavisinde sıklıkla kullanılan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörünü (EGFR) hedefleyen küçük bir molekül olan erlotinib&#39;e yanıt olarak CAF&#39;lerin tümör hücreleri üzerindeki etkilerini değerlendirdik. Değerlendirme için yüksek içerikli bir tarama platformu ve eşlik eden görüntü analiz yazılımını kullandık; Bununla birlikte, bu metodolojiyi diğer araştırmacılar tarafından erişilebilir kılmaya yönelik bir girişimde, açık kaynaklı yazılımları kullanarak karşılaştırılabilir bir aşağı akış protokolü geliştirdik:CellProfiler 10 ve CellProfiler Analisti 11 . Çoğu görüntü tabanlı yüksek içerikli tarama testleri, belirli bir enstrüman modeline özgü ticarileştirilmiş yazılımlarla analiz edilir. Altta yatan algoritmalar genellikle tescilli olduğundan sonuçları farklı yazılımlarla diğer laboratuvarlarda çoğaltmak zordur. Bu görüntü temelli boru hattını kullanarak, her iki floresans ve morfoloji bazlı sınıflandırmayı kullanarak, ilaç tedavisine yanıt olarak bir heterosellüler kültüre ait her bir alt popülasyonun hücre çoğalması, ölümü ve morfolojisi ölçülmüştür. Aşağıdaki protokol karmaşık hücresel proseslerin problanması için sağlam bir metodoloji sağlar.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td>cell culture medium</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td>medium supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>medium supplement</td></tr><tr><td>TC20</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td>cell counter</td></tr><tr><td>TC20 slides with trypan blue</td><td>Biorad</td><td>1450003</td><td>cell counter slides</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Corning</td><td>3904</td><td>clear bottom black plates</td></tr><tr><td>Erlotinib</td><td>LC Laboratories</td><td>E-4007</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>317275-100ML</td><td>solution to resuspend drug</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Invitrogen</td><td>H21491</td><td>nuclear dye</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td>dead cell stain</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange CMRA</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td>whole cell stain</td></tr><tr><td>Operetta high content imaging system</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institue</td><td>version 2.2.0 (rev 9969f42)</td><td>http://cellprofiler.org/releases/</td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td></td><td></td><td>Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 &amp;ordm;C at 5% CO&lt;sub&gt;2.&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>15 mL Falcon conical tubes</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>10 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; cell culture plates</td><td>TPP</td><td>93040</td><td></td></tr></tbody></table>

discrimination and characterization of heterocellular populations using quantitative imaging techniques

Hücresel süreçler karmaşıktır ve çoklu hücre tipleri ve çevreleri arasındaki etkileşim sonucunda ortaya çıkmaktadır. Mevcut hücre biyolojisi teknikleri çoğu zaman bu etkileşimin doğru yorumlanmasına izin vermez. Kantitatif görüntüleme tabanlı bir yaklaşım kullanarak, heterojen hücre popülasyonlarının dinamik fenotipik tepkilerini ( yani morfoloji değişiklikleri, çoğalması, apoptozisi) çevre uyaranlarındaki değişikliklere karakterize etmek için yüksek içerikli bir protokol sunuyoruz. Uygulamaya bağlı olarak, flüoresan yoğunluğuna veya doğal morfoloji özelliklerine dayalı hücre tiplerini ayırt etme yeteneğimizi vurguluyoruz. Bu platform, geleneksel hücre biyolojisi tahlillerine kıyasla daha kısa süreler, daha az reaktif miktarı ve hata olasılığı düşük iken pertürbasyona alt popülasyon yanıtının daha kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar. Bununla birlikte, bazı vakalarda, hücre popülasyonlarının belirlenmesi zor olabilir ve karmaşık cellu bazında nicelendirilebilirDaha fazla sorun giderme gerektirecektir; Protokolde bu koşulların bazılarını vurguluyoruz. Bu uygulamayı bir kanser modelinde uyuşturucuya tepki kullanarak göstermek; Bununla birlikte, diğer fizyolojik süreçlere daha kolay uygulanabilir. Bu protokol, bir ortak kültür sistemi içinde alt popülasyonları tanımlamaya ve her ikisinin de dış uyaranlara verilen tepkileri karakterize etmesine izin verir.

Toplam 4050 bireysel görüntü için üç tablaya karşı 25 alan / oyuk, 54 oyuk / plaka (3 hücre popülasyonu x 6 ilaç konsantrasyonu x 3 kopya) içeren bir görüntü seti ürettik. Deney boyunca üretilen görüntü setleri, hücrelerin alt popülasyonlarının sınıflandırılmasında kullanılan çeşitli kantitatif özellikteki hücrelerin ( örn., Morfoloji, flüoresan) özümlenmesi için tescilli yazılım kullanılarak analiz edildi (materyal tablosuna bakınız). Bununla birlikte, kullanılan ticari yazılımın erişimi sınırlı olduğundan, CellProfiler ve CellProfiler Analyst&#39;de karşılaştırılabilir downstream boru hatları oluşturuldu. Alt popülasyonlara Heteroselüler Sınıflandırma Çekirdekler, DNA lekesi (burada Hoechst) temel alınarak tanımlandı ve parçalara bölündü ve hücre popülasyonları floresans veya mo&#39;yaRfoloji ( Şekil 1 ). Floresan bazlı sınıflandırma için, fibroblastlar (CCD-19Lu) daha önce GFP-lentivirüs ile dönüştürülmüştür. GFP yoğunluk seviyeleri her çekirdek için ölçüldü ve kabul edilen eşiğin üstünde hesaplanan (arka plandaki sinyal temelli) CCD-19Lu olarak sınıflandırılırken, aşağıda belirtilenler tümör hücreleri olarak tanımlandı (H3255). Morfolojiye dayalı sınıflandırma için, hücreler daha önce toksik olmayan bir hücresel leke ile boyandılar (materyal tablosuna bakınız) ve bu sitoplazmayı tanımlamak ve parçalamak için kullanılmıştır. Her bir popülasyondan ~ 50-100 hücre ile bir makine öğrenme algoritması eğitildi. Popülasyonlar arasında önemli derecede farklı olan, daha sonra CCD-19Lu ve H3255 hücrelerini ayırmak için doğrusal bir sınıflandırıcı tasarlamak için kullanılan morfolojik özellikler belirlendi. Floresan ve morfoloji sınıflandırma protokolleri, iki hücre popülasyonunu ayırt ederken uyumlu% 97.4 (n = 1403) idiVe ilaçla tedavi edilen koşullarda (1 μM erlotinib)% 92.5 (n = 916) uyumlu bulunmuştur ( Şekil 2 ). Alt popülasyonların fenotipik analizleri Hücre tipleri arasında ayrım yapmanın yanı sıra, her alt popülasyonun fenotipik özelliklerini karakterize etmeyi amaçladık. Çoklama analizleri, zamandan ve reaktiflerden tasarruf sağlar, tutarlılık katar ve incelenen sistemle ilgili ek bilgi sağlar. Birçok potansiyel fenotipik çıktı vardır ve bunları ilginç sorulara dayanarak seçmelidir. Burada erlotinib tedavisine yanıt olarak hücre morfolojisi ve canlılık durumundaki değişiklikler araştırılmıştır. İlaç tedavisinden üç gün sonra, H3255 hücrelerinin nükleer alanındaki azalma ve hücresel alanın artışı gözlendi ( Şekil 3A ). Nükleer alan arasındaki ortalama farkIki taraflı tip-2 (eşit varyans) t- testi ( p = 7.92 x 10 -16 ) yoluyla &quot;ilaçsız&quot; ve &quot;ilaç&quot; uygulanan popülasyonların istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulundu. Bu gözlemin uyuşturucu tedavisi tarafından strese verilen hücresel bir yanıt olduğunu varsayarız. Ayrıca, bir ilacın, hücreler üzerinde sitotoksik ( yani , ölü hücrelerin sayısının zaman içinde artması) veya sitostatik ( yani , hücre doğumlarının zaman içinde azalması) etkisi olup olmadığının derin klinik etkiye sahip olup olmadığının incelenmesi ilgi çekicidir. Örneğin, bir sitostatik ilaç etkisi, büyümeyi durdurmaya neden olur, ancak hücreleri tümörden ortadan kaldırmaz, böylece kanser hücreleri ilaç uzaklaştırıldıktan sonra hücre proliferasyonunu yeniden başlatma potansiyeline sahiptir. İlaç etkileri genellikle bağlam, konsantrasyon ve hücre türüne bağlı olabilir. Bir hücre tipinde erlotinib&#39;in sitotoksik bir yanıt ortaya çıkardığını daha önce gözlemledik, buna karşın acBaşka bir dilde ytostatik yanıt 13 . Geleneksel canlılık testleri nispi hücre sayısını verir ve bu nedenle büyüme tutuklamaları ile hücre ölümü arasında ayrım yapmaz. Burada, ölen hücreler, propidyum iyodür lekesine dayanılarak tanımlandı ( Şekil 3B ). Erlotinibin H3255 hücrelerine karşı hem sitotoksik hem de sitostatik etkileri gözlendi, ölümlerin sayısında bir artış ve ilaç tedavisi sonrasında doğum sayısı azaldı ( Şekil 3C ). Hücrenin temizlenmesi yüzünden muhtemelen 1. günden sonra ölen hücrelerin sayısının düştüğü belirtilmelidir. CCD-19Lu hücreleri ilacından etkilenmedi. Bu platformun ek bir avantajı, nicel veri üretmektir. Örneğin, eş-kültür deneyimizde, 1178 (% 75.8) H3255 hücresinin ilk alt popülasyonunun erlotinsiz veya erlotinsiz üç gün sonra 2.817 (% 87.9) veya 396 (% 57.2) olduğu tespit edildiIb tedavisi (sırasıyla Şekil 4 ). Göreli yüzde yerine fiili hücre sayıları üretebildiğimiz için (akış sitometrisi yöntemlerinde olduğu gibi), ilaç tedavisi esnasındaki kompozisyon değişikliğinin CCD-19Lu&#39;da bir artış değil, H3255 hücrelerinde bir azalmaya bağlı olduğu sonucuna vardık. Deneysel olarak değerlendirilmesi zor ve muhtemelen hücre tipleri arasında farklılık gösteren hücre boşluğu nedeniyle ölüm oranlarının hafife alınabileceği hiçbir şeyin değeri yoktur. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig1.jpg" /> Şekil 1: Görüntü Analizi Protokolüne Genel Bakış. Hem morfolojiye dayalı sınıflandırma hem de flüoresans temelli sınıflandırma kullanarak heterosellüler popülasyonları sınıflandırmak için iki potansiyel downstream görüntü analizi boru hatları. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig1large.jpg" target="_blank">Lütfen onu tıklayın</a>Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için e tuşuna basın. <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig2.jpg" /> Şekil 2: Morfoloji ve Floresan Temelli Sınıflandırma Arasındaki Uyumluluk. ( A ) İki sınıflandırma protokolünün örtüşmesini gösteren eşzamanlılık arsası. Aynı hücreler, hem morfoloji hem de flüoresan bazlı sınıflandırma kullanılarak H3255 olarak sınıflandırıldı. İki protokol, tedavi edilmemiş hücrelerin% 97.4&#39;ü (n = 1403) ve erlotinib ile tedavi edilen hücrelerin% 92.5&#39;i (n = 916) sınıflandırılmıştı (Not: beyaz alan görselleştirilemeyecek kadar küçüktür). ( B ) flüoresan esaslı ve morfolojik tabanlı sınıflandırma arasındaki iyi ve kötü eşzamanlılık örneklerini gösteren 10X görüntü. Beyaz oklar, platformlar arasında tutarsız olarak sınıflandırılan hücrelere işaret ediyor. Giriş görüntüsü: mavi çekirdekler (Hoechst); Yeşil - CCD19Lu (GFP). SınıflandırmaFication görüntüleri: Kırmızı - H3255; Yeşil - CCD-19Lu. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig3.jpg" /> Şekil 3: Tek Deneysel Kurulumdan Multiplexed Fenotipik Ölçümler. ( A ) Çekirdek ve hücre alanı gibi morfolojik özellikler, ilaç varlığında ve yokluğunda tek hücre seviyesinde hesaplandı. Not: 100 μm2&#39;den küçük ölçülen hücre alanları enkaz olarak kabul edildi ve analizlerden hariç tutuldu. Kutu çizimi, birinci ve üçüncü çeyrek aralıklarla ve% 95 güven aralığı hata çubuklarıyla medyanı göstermektedir. ( B ) H3255 (mavi) ve CCD-19Lu (yeşil) hücreler birlikte kültürlenmiş ve propidin yoğunluğuna göre ölü hücreler tespit edilmiştirIyodür boyası (kırmızı) ve 10X objektif kullanılarak görüntülendi. Ölçek çubuğu = 1 mm (üst panel); 100 μm (alttaki görüntüler). ( C ) Yaşayan ve ölen hücrelerin toplam sayısı, erlotinib ilavesi ile canlı hücrelerin sayısının belirgin bir şekilde azalması ve ölü hücrelerin artması ile, ilaç tedavisi olsun veya olmasın üç gün boyunca hesaplandı. Hata çubukları, üç kopyaya dayanan ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55844/55844fig4.jpg" /> Şekil 4: Zaman Üzerindeki Alt Popülasyon Dinamikleri. 0 veya 3. günde uyuşturucu ve ilaçsız H3255 (mavi) ve CCD-19Lu (yeşil) içeren kuyulardan temsilcilerin 10X görüntüsü. Her alt popülasyona ait hücreler sayılmış ve orantılı pasta grafikleri aNumuneler arasındaki nüfus kompozisyonunda ctual değişim. Ölçek çubukları = 1 mm (orta paneller, en soldaki panelde), 1 mm (üst resim), 100 μm (alttaki görüntüler). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55844/55844fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques at JoVE.com

Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır.

Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

Cellular processes are complex and result from the interplay between multiple cell types and their environment. Existing cell biology techniques often do ...

discrimination-characterization-heterocellular-populations-using

Research

JoVE Journal

Biology

7.4K Görüntüleme.  University of Southern California (USC).  Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır. 

Video: Discrimination and Characterization of Heterocellular Populations Using Quantitative Imaging Techniques

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Gelişim Biyolojisi

Heterogeneity Mapping of Protein Expression in Tumors using Quantitative Immunofluorescence

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of areas of distinct differentiation into recognized histological subtypes, or different pathological grade, often there are more subtle differences in phenotype which defy accurate classification (Figure 1). Ultimately, since morphology is dictated by the underlying molecular phenotype, areas with visible differences are likely to be accompanied by differences in the expression of proteins which orchestrate cellular function and behavior, and therefore, appearance. The significance of visible and invisible (molecular) heterogeneity for prognosis is unknown, but recent evidence suggests that, at least at the genetic level, heterogeneity exists in the primary tumor1,2, and some of these sub-clones give rise to metastatic (and therefore lethal) disease. 
Moreover, some proteins are measured as biomarkers because they are the targets of therapy (for instance ER and HER2 for tamoxifen and trastuzumab (Herceptin), respectively). If these proteins show variable expression within a tumor then therapeutic responses may also be variable. The widely used histopathologic scoring schemes for immunohistochemistry either ignore, or numerically homogenize the quantification of protein expression. Similarly, in destructive techniques, where the tumor samples are homogenized (such as gene expression profiling), quantitative information can be elucidated, but spatial information is lost. Genetic heterogeneity mapping approaches in pancreatic cancer have relied either on generation of a single cell suspension3, or on macrodissection4. A recent study has used quantum dots in order to map morphologic and molecular heterogeneity in prostate cancer tissue5, providing proof of principle that morphology and molecular mapping is feasible, but falling short of quantifying the heterogeneity. Since immunohistochemistry is, at best, only semi-quantitative and subject to intra- and inter-observer bias, more sensitive and quantitative methodologies are required in order to accurately map and quantify tissue heterogeneity in situ.
We have developed and applied an experimental and statistical methodology in order to systematically quantify the heterogeneity of protein expression in whole tissue sections of tumors, based on the Automated QUantitative Analysis (AQUA) system6. Tissue sections are labeled with specific antibodies directed against cytokeratins and targets of interest, coupled to fluorophore-labeled secondary antibodies. Slides are imaged using a whole-slide fluorescence scanner. Images are subdivided into hundreds to thousands of tiles, and each tile is then assigned an AQUA score which is a measure of protein concentration within the epithelial (tumor) component of the tissue. Heatmaps are generated to represent tissue expression of the proteins and a heterogeneity score assigned, using a statistical measure of heterogeneity originally used in ecology, based on the Simpson's biodiversity index7.
To date there have been no attempts to systematically map and quantify this variability in tandem with protein expression, in histological preparations. Here, we illustrate the first use of the method applied to ER and HER2 biomarker expression in ovarian cancer. Using this method paves the way for analyzing heterogeneity as an independent variable in studies of biomarker expression in translational studies, in order to establish the significance of heterogeneity in prognosis and prediction of responses to therapy.

Here we describe a method to quantify molecular heterogeneity in histological sections of tumor material using quantitative immunofluorescence, image analysis, and a statistical measure of heterogeneity. The method is intended for use in clinical biomarker development and analysis.

Kantitatif İmmünofloresan kullanarak Tümörler Protein İfade heterojenite Haritalama

Morphologic heterogeneity within an individual tumor is well-recognized by histopathologists in surgical practice. While this often takes the form of ...

Tıp

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Genetik

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Nicel Optik Mikroskopi: Hücresel biyofizik ölçümü Standart Optik Mikroskop ile Özellikleri

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

Biyomühendislik

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

Meme hücrelerinin Mikrodesenler ve nicel görüntüleme kullanarak acil uzamsal organizasyonu haritalama

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

Çoğaltılmış yapay hücresel MicroEnvironment dizi imalatı

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either fluorescence detection approaches, such as immunofluorescent staining or transfection with fluorescent proteins or edge detection techniques, which are often error-prone due to noise and other non-idealities in the image background. 
We designed a new algorithm that could accurately count and distinguish macrophages and fibroblasts, cells of different phenotypes that often colocalize during tissue regeneration. MATLAB was used to implement the algorithm, which differentiated distinct cell types based on differences in height from the background. A primary algorithm was developed using an area-based method to account for variations in cell size/structure and high-density seeding conditions. 
Non-idealities in cell structures were accounted for with a secondary, iterative algorithm utilizing internal parameters such as cell coverage computed using experimental data for a given cell type. Finally, an analysis of coculture environments was carried out using an isolation algorithm in which various cell types were selectively excluded based on the evaluation of relative height differences within the image. This approach was found to accurately count cells within a 5% error margin for monocultured cells and within a 10% error margin for cocultured cells.

We present a method, which utilizes a generalizable area-based image analysis approach to identify cell counts. Analysis of different cell populations exploited the significant cell height and structure differences between distinct cell types within an adaptive algorithm.

Makrofaj-fibroblast Kokültürlerinin Nicelleştirilmesi için Alan Tabanlı Görüntü Analiz Algoritması

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Biyoloji

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.