Bu çalışma Federal Almanya Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (FKZ 0312138A ve FKZ 316159), AB Yapısal Fonlarıyla Devlet Mecklenburg-Batı Pomerania (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 ve ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) ve Alman Kalp Vakfı (F / 01/12). Buna ek olarak, RD, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi (889001), DAMP Vakfı ve BMBF (VIP + 00240) FORUN Programı tarafından desteklenmektedir.

Yenidoğan farelerini içeren bu protokolün tüm basamakları, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi hayvan bakımına ilişkin etik kurallara göre gerçekleştirildi. 1. Hücre Kültürü Tabletlerinin Hazırlanması ve Kardiyomiyosit Kültürü için Orta <ol><li> PBS içinde% 0.1 jelatin ile bir hücre kültürü plaka kaplayın ve 37 ° C&#39;de 4 saat süreyle inkübe edin veya gece boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. Jelatı çıkarın ve steril laminer hava akımı altında kurumasına izin verin. </li><li> % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin (P / S) ile takviye edilmiş 50 mL DMEM&#39;den oluşan hücre kültürü ortamı hazırlayın. 37 ° C&#39;ye kadar ısıtın. </li></ol> 2. Yenidoğan Kardiyomiyositlerinin İzolasyonu <ol><li> Yenidoğan farelerini (1-2 günlük) steril makaslarla kesilerek kurutun ve göğsü göğüs kafesi boyunca açın. Toraksı hafifçe bastırırken forseps kullanarak kalbi çıkarın ve kalbi, buz gibi HBSS içeren 24 yuvalı bir plakaya aktarın(Ca 2+ ve Mg 2+ olmadan). </li><li> Steril forseps kullanarak kalp dışı dokuları ve daha büyük damarları çıkarın. Temizlenmiş kalpler buz soğukluğunda HBSS içeren 1.5 mL tüp içine aktarılır. Enzimatik sindirim için tüp başına maksimum 5 kalp kullanın. </li><li> Küçük makaslarla kalpleri &lt;0,5 ila 1 mm³ parçaya kesin. </li><li> Öğütülmüş kalpler HBSS ile 1 mL mikrolitrelik pipet kullanılarak aspirasyon / ilave HBSS ile iki kez yıkanır. Enzimleri eklemeden önce HBSS&#39;yi tamamen çıkarın. </li><li> Yenidoğan kalplerindeki enzimatik sindirim için, piyasada bulunan bir kit kullanın ve üreticinin protokolünü izleyin (Malzeme Tablosuna bakın ). 35 ° C&#39;de 37 ° C&#39;de enzimlerle inkübe ederken kıyılmış kalpleri içeren tüpü her 5 dakikada sallayın. </li><li> Tohum, kardiyomiyosit fraksiyonunun yapışmasına izin vermek için 1.5-2 saat boyunca hücre kültürü ortamı içeren kaplanmamış hücre kültürü kaplarında hücreleri askıya aldı. Yüksek saflık varsa bu adımı tekrarlayınKardiyomiyositlerin tedavisi gereklidir. Arzu edildiği takdirde, kardiyomiyositsiz fraksiyonu daha da kültürleyin. NOT: 15 kalp içeren bir hücre süspansiyonu için, ön kaplama adımı 75 cm2&#39;lik hücre kültürü şişeleri üzerinde gerçekleştirilebilir. Genellikle, bir yenidoğan kalpten yaklaşık 5 x 105 hücre elde edilir. </li><li> 15 mL konik tüp içinde süpernatantı toplayın ve 300 x g&#39;de 10 dakika santrifüjleyin. 1 mL hücre kültürü ortamında hücreleri tekrar süspanse edin. </li><li> Bir Neubauer odacık hemositometresi ile hücreleri sayın veya eşdeğer bir yöntem kullanın. </li><li> Plaka, kardiyomiyositleri 6 yuvalı plakalarda 3 x 10 5 hücre / cm² yoğunlukta izole etti. Hücreleri gece boyunca 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de inkübe edin. NOT: İsteğe bağlı olarak hücreler de bu noktada transfekte edilebilir. Bununla birlikte, hücreler elektroporasyona tabi tutulmadan önce bir gün kültüre alındığında canlılığın arttığı gözlenmiştir. </li></ol> Floresanla Etiketli miRNA ile Transfeksiyon <ol><li> öncesiSıcak bir hücre kültür ortamı (adım 1.2&#39;ye bakın) ile 37 ° C&#39;ye kadar bir su banyosu veya eşdeğer bir cihazda inkübe edin. </li><li> RNaz içermeyen steril suda flüoresan miRNA&#39;nın 20 uM stok solüsyonu hazırlayın. </li><li> 90 mM Na2HPO4, 90 mM NaH2PO4, 5 mM KC1, 10 mM MgCl2 ve 10 mM sodyum süksinat içeren elektroporasyon tamponunu hazırlayın ve pH&#39;ı 7.2&#39;ye ayarlayın; Elektroporasyon tamponu birkaç ay boyunca -20 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> 5 dakika süreyle% 0.05 tripsin kullanarak kültür çanak hücrelerini çıkarın. Hücre kültürü ortamı ilave ederek tripsini inaktive edin. </li><li> Bir Neubauer odacık hemositometresi ile hücreleri sayın veya eşdeğer bir yöntem kullanın. Hücreleri 300 xg&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> 100 uL başına 4 x 10 5 hücre konsantrasyonu elde etmek için elektroporasyon tampon hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Bir tüpte flüoresan miRNA (son konsantrasyon: 0.25 uM) ile hücre süspansiyonunun 100 uL&#39;sini karıştırın veKarışımı bir elektroporasyon küvetine yükleyin. <ol><li> Ampirik olarak hücre türüne bağlı olarak uygun miktarda miRNA belirler. </li></ol></li><li> &quot;G-009&quot; programını kullanarak bir elektroporasyon cihazı (bkz . Malzeme Tablosu ) kullanılarak elektroporasyon gerçekleştirin . </li><li> Önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı 500 mcL ekleyin ve 4-iyi cam-alt oda slayt bir kuyuya tüm hücre süspansiyonu (4 x 10 5 hücre) aktarın. 37 ° C&#39;de 1 gün boyunca hücreleri% 5 CO 2 atmosferinde kültürleyin. NOT: FRAP analizi için ~% 80&#39;lik bir hücre yoğunluğu en uygunudur. Etiketli miRNA transfeksiyonu sadece elektroporasyon ile yapılmalıdır. Etiketli miRNA moleküllerinin homojen dağılımı FRAP ölçümü için yararlı olduğu için reaktif temelli transfeksiyon önerilmez. </li></ol> 4. 3D-FRAP Mikroskopi Uygulaması (3. Gün) <ol><li> Mikroskop inkübatörünü 37 ° C&#39;ye ısıtın; C ve FRAP ölçümünden önce en az 2 saat konfokal mikroskop sistemi üzerinde geçiş yaparak bir termal denge kurun ve kayma olasılığını azaltın. Mümkünse% 5 CO2 atmosferi uygulayın. </li><li> Oda slaydını sahne örneği tutucusuna yerleştirin. </li><li> Transfekte edilmiş kardiyomiyositlerin bir kümesini 1.4 NA yağ hedefi (400X büyütme) ve düşük lazerli güçte 561 nm lazer uyarma ışığı kullanarak, 570-680 nm&#39;lik bir algılama aralığıyla bulun. NOT: FRAP ayarlarının tanımı, görüntü elde etme ve analiz, mikroskop spesifik yazılımı kullanılarak yapılmıştır (bkz . Malzeme Tablosu ). </li><li> &quot;Kurulum Yöneticisi&quot; nde &quot;z-Stack&quot;, &quot;Zaman Serileri&quot;, &quot;Ağartma&quot; ve &quot;Bölgeler&quot; düğmelerini etkinleştirin. </li><li> FRAP parametrelerini tanımlayın. <ol><li> &quot;Acquisition Mode&quot; menüsündeki görüntü toplama ayarlarını, &quot;frame size&quot;4; 512 x 512, &quot;satır adım&quot; 1 ve &quot;tarama süresi&quot; &lt;1 sn. </li><li> &quot;Kanallar&quot; menüsünde, minimum lazer uyarımından maksimum flüoresan elde etmek için lazer gücü, ofset ve kazanç ayarlarını yapın ( örn., Lazer gücü:% 1-5); Yoğunluk doygunluğundan kaçınmak için ayarlayın. &quot;İğne deliği boyutu&quot; nu 2 μm olarak ayarlayın. </li><li> Ardından, &quot;Bölgeler&quot; menüsünde &quot;ROI çizim aracı&quot; nı seçin ve hedef hücrenin, referans hücrenin ve arka plan alanını işaretlemek için imleci kullanın. Gerekirse, photobleaching için birkaç hedef hücre seçin. </li><li> &quot;Ağartma&quot; menüsünde ( örneğin, yinelemeler: 9-14, ışıkla temizleme için lazer gücü:% 100, görüntü yakalama aralığı: 60 s, devir sayısı: 15) foto-ağartma ayarlarını yapın. 3 ilk taramadan sonra ağartmanın başlangıcını tanımlayın. </li><li> &quot;Z-Stack&quot; menüsünde, hücrelerin kalınlığına bağlı olarak z-stack alımının sınırlarını tanımlayın. &quot;Sayı o&quot; ayarlayınF z-katmanları &quot;yı 12 - 15&#39;e ayarlar. </li><li> FRAP denemesini başlatın ve flüorür iyileşmesini kaydedin. NOT: Bir FRAP deneyinin ayarları hücrenin türüne, flüoresan boyaya ve mikroskop sistemine bağlı olduğundan, FRAP için en uygun parametreleri belirlemek için pilot denemeler yapmak en iyisidir. Ağartma, ilk floresan yoğunluğunu en az% 50 azaltmak için yeterli olmalıdır. Tipik olarak, floresan iyileşmesi, plato fazına erişilinceye kadar 30-60 saniyede bir kaydedilmelidir. </li></ol></li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> Elde edilen z-yığınlarının maksimum projeksiyonlarını oluşturun ve ağartılmış hedef hücrelerin, referans hücrenin ve arka planın flüoresan yoğunluk değerlerini elde edin. Mikroskopa özgü yazılımı kullanarak, &quot;İşleniyor&quot; → &quot;Maksimum yoğunluk projeksiyonu&quot; → dosya seçin → &quot;Uygula&quot; yı tıklayın. <ol><li> Alternatif olarak, eşdeğer bir görüntü analiz aracı ( <eM&gt; örneğin ImageJ). </li></ol></li><li> Hedef hücre, arka plan ve referans hücrenin tüm zaman noktalarında bulunan flüorens yoğunluk verilerini bir elektronik tabloya kopyalayın. <ol><li> Edinme işlemi sırasında oluşan photobleaching&#39;i düzeltmek için hedef hücrenin yoğunluk değerlerinden referans hücrenin arka plan yoğunluğunu ve yoğunluğunu çıkartın. Her zaman noktası için arka plan ve referans hücre düzeltmeleri yapın. </li><li> Düzeltilmiş FRAP verilerini, ilk flüoresan ile her bir değeri bölerek ağartmadan önce ilk flüoresans yoğunluğuna göre normalize edin. </li><li> FRAP eğrilerini elde etmek için, her bir zaman noktasının yoğunluk değerlerinden çıkararak çamaşır suyu bittikten hemen sonraki flüoresan yoğunluğuna taban çizgisini ayarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+state-of-the-art.">Small silencing RNAs: state-of-the-art.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).</li><li>Raghunathan, S., Patel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+small+interfering+RNA+in+cardiovascular+diseases.">Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases.</a> Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).</li><li>Sluijter, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+Cardiovascular+Regenerative+Medicine:+Directing+Tissue+Repair+and+Cellular+Differentiation.">MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation.</a> ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).</li><li>Li, M., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+MicroRNAs:+Potential+and+Emerging+Biomarkers+for+Diagnosis+of+Cardiovascular+and+Cerebrovascular+Diseases.">Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases.</a> Biomed Res Int. , 1-9 (2015).</li><li>Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+cardiovascular+disease:+an+introduction+for+clinicians.">MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians.</a> Heart. 101 (12), 921-928 (2015).</li><li>Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+and+pannexin+signaling+in+gastrointestinal+and+liver+disease.">Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease.</a> Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).</li><li>Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connexin+43+in+cardiovascular+diseases.">Role of connexin 43 in cardiovascular diseases.</a> Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).</li><li>Naus, C. C., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+and+challenges+of+connexin+connections+to+cancer.">Implications and challenges of connexin connections to cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).</li><li>Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+modulate+glioma+invasion+by+direct+transfer+of+microRNA.">Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA.</a> Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).</li><li>Lee, H. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+deliver+synthetic+microRNA+mimics+to+glioma+cells+and+glioma+stem+cells+and+inhibit+their+cell+migration+and+self-renewal.">Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal.</a> Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).</li><li>Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+microRNA+is+transferred+between+glioma+cells.">Functional microRNA is transferred between glioma cells.</a> Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).</li><li>Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+mediated+miRNA+intercellular+transfer+and+gene+regulation:+A+novel+mechanism+for+intercellular+genetic+communication.">Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication.</a> Sci Rep. 6, 19884 (2016).</li><li>Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+connexin26+mutants+associated+with+human+hearing+loss+have+trans-dominant+effects+on+connexin30.">Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30.</a> Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).</li><li>Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+gap+junctions+in+monolayer+and+three-dimensional+cultures+of+human+tendon+cells+using+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching.</a> J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).</li><li>Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+requires+a+biphasic+modulation+of+gap+junctional+intercellular+communication+caused+by+dynamic+changes+of+connexin43+expression.">Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).</li><li>Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+shuttling+of+miRNA+-+A+novel+pathway+of+intercellular+gene+regulation+and+its+prospects+in+clinical+application.">Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application.</a> Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).</li><li>Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+connexin43+in+the+EGF/EGFR+signalling+during+self-renewal+and+differentiation+of+neural+progenitor+cells.">Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells.</a> Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).</li><li>Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).</li><li>Laupheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Migration+of+Subpopulations+of+Bone+Marrow+Cells+along+an+SDF-1+&#945;+and+ATP+Gradient.">Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 &#945; and ATP Gradient.</a> Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).</li><li>Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+enhance+the+antiproliferative+effect+of+microRNA-124-3p+in+glioblastoma+cells.">Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells.</a> J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).</li><li>Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mobility+to+crosstalk.+A+model+of+intracellular+miRNAs+motion+may+explain+the+RNAs+interaction+mechanism+on+the+basis+of+target+subcellular+localization.">From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization.</a> Math Biosci. 280, 50-61 (2016).</li><li>Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+single+molecule+microscopy+reveals+two+kinetically+distinct+pathways+for+microRNA+assembly.">Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly.</a> EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).</li><li>Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photobleaching,+laser+illumination+unbinds+fluorescent+proteins.">Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins.</a> J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).</li><li>Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+generation+and+calcium+increase+induced+by+visible+light+in+astrocytes.">Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).</li><li>Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA:+Function,+detection,+and+bioanalysis.">MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis.</a> Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).</li><li>Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNA+expression+profiles+in+normal+human+tissues.">Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues.</a> BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat Commun. 2, 282 (2011).</li><li>Squadrito, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RNAs+Modulate+MicroRNA+Sorting+to+Exosomes+and+Transfer+to+Acceptor+Cells.">Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells.</a> Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).</li><li>Zhang, B., Farwell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs:+a+new+emerging+class+of+players+for+disease+diagnostics+and+gene+therapy.">microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).</li><li>Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+delivery+of+miRNAs+for+cancer+therapy:+Challenges+and+strategies.">In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

<html> MiRNAlar, hücresel fizyolojideki kilit aktörlerdir ve hücrelerarası değişim için bir yol olarak GJ&#39;leri 11 , 12 , 22 kullanarak - diğerlerinin yanında - kullanarak sinyal molekülleri olarak hareket ettiği gösterilmiştir. Mevcut protokol , hücre kümelerinde flüoresan miRNA&#39;lar kullanarak bu GJ&#39;ye bağımlı mekikleşmeyi karakterize etmek için bir in vitro canlı hücre görü...

Küçük kodlamayan RNA&#39;lar hücresel gen düzenlemesinde önemli oyunculardır. Bu moleküller, belirli bir hedef mRNA&#39;ya bağlanan 20-25 nükleotidden oluşur, bu da translasyonun bloke edilmesine veya mRNA parçalanmasına yol açar 1 , 2 . MiRNA ve siRNA gibi küçük RNA&#39;lar tarafından üstlenilen gen düzenleyici süreç, birçok farklı türde 3 bulunmuş olan oldukça korunmuş bir mekanizmadır. Özellikle miRNA molekülleri çoğalma, farklılaşma ve rejenerasyon 4 , 5 dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçler için çok önemlidir. Buna ek olarak, miRNA ekspresyonunun düzensizliği, bir çok patolojik bozukluğa atfedilir. Buna uygun olarak, miRNA&#39;ların teşhis için biyolojik belirteç olarak ve gen terapisi için terapötik ajanlar olarak uygun olduğu gösterilmiştir 6,7 </sup&gt;. Boşluk kavşakları (GJs), iki bitişik hücrenin plazma zarında, 1 kD&#39;ye kadar bir molekül ağırlığına sahip moleküllerin difüzyonel değişimini sağlayan özel protein yapılarıdır. Dokuların gelişimi, farklılaşması, hücre ölümleri ve kanser veya kardiyovasküler hastalık 8 , 9 , 10 gibi patolojik bozukluklar için önemli oldukları gösterilmiştir. Birkaç molekül, iyonlar, metabolitler ve nükleotidler de dahil olmak üzere GJ kanallarını geçebilecek nitelikte olarak tarif edilmiştir. İlginç bir şekilde, GJ&#39;lerin küçük RNA&#39;ların hücre içi hareketi için bir yol sağladığı 11,12 bulundu. Dolayısıyla, miRNA&#39;lar yalnızca üretildikleri hücrede değil, aynı zamanda alıcı hücreler içinde de hareket edebilir. Bu, hücrelerarası sinyal iletim sisteminde miRNA&#39;ların rolünü vurgular. Aynı zamanda, veriler gösterilenBu boşluk bağlantılı hücresel-iletişim, miRNA fonksiyonuyla yakından ilişkilidir. MiRNA ve GJ&#39;lerin doku homeostazı, patoloji ve teşhis üzerindeki belirgin etkisi nedeniyle, GJ&#39;lerin ve miRNA&#39;nın ilgili hücre içi dinamikleri hakkında kapsamlı bir anlayış, miRNA&#39;ya dayalı hastalıkların mekanizmalarını aydınlatmaya ve yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır. MiRNA terapileri. Boşluk bağlantılı bağlanmanın derecesine bağlı olarak, miRNA moleküllerinin hücreler arasında aktarılması çok hızlı bir işlem olabilir. Bu nedenle, bu düzenleyici sinyal moleküllerinin hızlı hücresel hareketi görselleştirilmesi ve miktarının belirlenmesine izin veren bir yöntem gereklidir. Genellikle, akış sitometrisi ve moleküler biyolojik teknikler küçük RNA&#39;ların 11 , 12 , 13 , 14&#39;ün geçişini göstermek için uygulanmıştır. Bununla birlikte, FRAP mikrolarına karşıBu yaklaşımlar yüksek zamansal çözünürlüğe sahip değildir, bu da GJs yoluyla miRNA değişimini analiz ederken zorunludur. Ayrıca, FRAP mikroskopisi daha az invazivtir ve bu nedenle birkaç hücre tipinde 15 , 16 , 17 moleküllerin GJ&#39;ye bağlı değişimini değerlendirmek için güçlü ve yeni bir canlı hücre görüntüleme tekniğini temsil eder. Burada, kardiyomiyositler arasındaki miRNA&#39;yı değerlendirmek için 3D-FRAP uygulamasını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Bu amaçla kardiyomiyositlere flüoresan etiketli miRNA transfekte edildi. Bu miRNA ile işaretlenmiş bir hücre fotobleached edildi ve bitişik hücrelere ait boşluk birleşimsel miRNA re-influx&#39;a zamana bağlı bir şekilde kaydedildi. FRAP deneylerinin yüksek zamansal çözünürlüğü, yaşayan hücreler arasında miRNA ve siRNA&#39;nın hücreler arası transferinin hassas değerlendirilmesi için kinetik çalışmalar yapma imkanı sunar. MoreoKüçük RNA&#39;lar farklı mekanizmalar vasıtasıyla çok farklı kinetiklerle değiştirilebildiğinden FRAP mikroskopisi, GJ&#39;lerin ilgili kepçme süreçlerinde ne dereceye kadar yer aldığını açıklığa kavuşturmaya yardımcı olabilir 18 . Ek olarak, 3D-FRAP, GJ geçirgenliğinde fizyolojik ve patolojik değişiklikler ve bunun küçük RNA transferi üzerindeki etkisini araştırmak için kullanılabilir 15,19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="698">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">neonatal NMRI mice</td>
			<td style="width:159px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Gelatin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7041</td>
			<td style="width:179px;">0.1% solution in PBS, sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">PBS</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-53500</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Dulbecco&#180;s modified medium</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P04-03550</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td style="width:179px;">100 U/ml, 100&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:159px;">Pan Biotech</td>
			<td style="width:119px;">P30-3306</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Cell culture plastic</td>
			<td style="width:159px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88281</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">HBSS</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">88281</td>
			<td style="width:179px;">included in primary cardiomyocyte isolation kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250061</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:243px;">miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">CP-004500-01-05</td>
			<td style="width:179px;">dissolve in RNAse free water, stock solution 20&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:243px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S3139</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:159px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">T877.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:159px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">28305.01</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Sodium succinate</td>
			<td style="width:159px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">3195.1</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">0.05% Trypsin/EDTA solution</td>
			<td style="width:159px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">L2153</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">4-well- Glass bottom chamber slides</td>
			<td style="width:159px;">IBIDI</td>
			<td style="width:119px;">80827</td>
			<td style="width:179px;">coat with 0.1% gelatin solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Amaxa Nucleofector II</td>
			<td style="width:159px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;">program G-009 was used for Electroporation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">LSM 780 ELYRA PS.1 system</td>
			<td style="width:159px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Excel software</td>
			<td style="width:159px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">&#945;-actinin antibody</td>
			<td style="width:159px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab9465</td>
			<td style="width:179px;">dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Connexin43 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-9059</td>
			<td style="width:179px;">dilution 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">goat anti-mouse Alexa 594 antibody</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">goat anti-rabbit Alexa 488 antibody&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11034</td>
			<td>dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Connexin43 siRNA</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM16708 ID158724</td>
			<td>&#160;final concentration 250nM</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CellTrace Calcein Red-Orange</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">DAPI nuclear stain</td>
			<td style="width:159px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D1306</td>
			<td style="width:179px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of the gap junction-dependent transfer of mirna with 3d-frap microscopy

MiRNA ve siRNA gibi küçük antisens RNA&#39;lar, hücresel fizyoloji ve patolojide önemli rol oynar ve dahası, çeşitli hastalıkların tedavisinde terapötik ajanlar olarak kullanılabilir. MiRNA / siRNA tedavisi için yeni, yenilikçi stratejilerin geliştirilmesi, temel mekanizmalar hakkında kapsamlı bir bilgiye dayanmaktadır. Yeni veriler, küçük RNA&#39;ların hücreler arasında bir boşluk bağlantısına bağlı bir şekilde değiştirildiğini ve böylece alıcı hücrede gen düzenleyici etkilere yol açtığını düşündürmektedir. Moleküler biyolojik teknikler ve akış sitometrik analizi, miRNA&#39;nın hücrelerarası alışverişini incelemek için yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu yöntemler moleküllerin boşluk birleşim akışını incelerken gerekli olan yüksek zamansal çözünürlüğü sağlamazlar. Dolayısıyla, miRNA / siRNA&#39;nın hücreler arası sinyal molekülleri olarak etkisini araştırmak için, bu küçük RNA&#39;ların hücresel seviyede analiz edilmesine izin verecek yeni araçlar gereklidir. Bu protokol, apKardiyak hücreler arasındaki miRNA moleküllerinin boşluk birleşimine bağımlı değişimini aydınlatmak için photobleaching (3D-FRAP) mikroskopisi sonrası üç boyutlu flüoresan iyileşmesinin plikasyonu. Önemlisi, bu basit ve non-invaziv canlı hücre görüntüleme yaklaşımı, yüksek zaman zamanlı çözünürlük ile gerçek zamanlı olarak floresanla işaretlenmiş küçük RNA&#39;ların boşluk birleşimsel geçişinde görselleştirme ve miktar tayini yapılmasına olanak tanır. 3D-FRAP tarafından elde edilen veriler, küçük hücrelerin içinde hücrelere sinyal düzenleyici moleküller olarak etki eden hücreler arası gen düzenlenmesinin yeni bir yolunu teyit etmektedir.

Burada, yenidoğan kardiyomiyositlerde flüoresan miRNA&#39;nın boşluğun junctional geçişini incelemek için non-invaziv bir teknik olarak 3D-FRAP mikroskobisini sunuyoruz. İzole edilen kardiyomiyositlerde, tipik olarak çizgili α-aktinin paterni görüldü ve hücreler arası hücre sınırları boyunca yüksek Cx43 plakları bulundu ( Şekil 1A , beyaz ok başları), bu da moleküllerin yüksek hücre içi akılarına izin verdi. İzole edilen kardi...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy at JoVE.com

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Burada, miRNA&#39;nın aralık bağlantısına bağımlı tomurcuk analizi için photobleaching (3D-FRAP) sonrası üç boyutlu floresan geri kazanımının uygulanmasını açıklıyoruz. Yaygın olarak uygulanan yöntemlerin aksine, 3D-FRAP, küçük RNA&#39;ların hücreler arası transferinin gerçek zamanlı olarak, yüksek uzaysal-zamanlı çözünürlük ile nicelendirilmesini sağlar.

3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

analysis-gap-junction-dependent-transfer-mirna-with-3d-frap

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Görüntüleme.  Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC).  Burada, miRNA'nın aralık bağlantısına bağımlı tomurcuk analizi için photobleaching (3D-FRAP) sonrası üç boyutlu floresan geri kazanımının uygulanmasını açıklıyoruz. Yaygın olarak uygulanan yöntemlerin aksine, 3D-FRAP, küçük RNA'ların hücreler arası transferinin gerçek zamanlı olarak, yüksek uzaysal-zamanlı çözünürlük ile nicelendirilmesini sağlar. 

Video: Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Periferik Kök Hücre Göç Analizi Fare Cremaster Muscle Mikrosirkülasyon Intravital Mikroskopi

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Biyoloji

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFE Test kullanma Yüksek throughput miRNA Hedefleri tespiti

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Real-time Imaging of Plant Cell Surface Dynamics with Variable-angle Epifluorescence Microscopy

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and cytoskeletal rearrangement. Real-time and high-resolution image analysis of such intracellular events will increase the understanding of plant cell biology at the molecular level. Variable angle epifluorescence microscopy (VAEM) is an emerging technique that provides high-quality, time-lapse images of fluorescently-labeled proteins on the plant cell surface. In this article, practical procedures are described for VAEM specimen preparation, adjustment of the VAEM optical system, movie capturing and image analysis. As an example of VAEM observation, representative results are presented on the dynamics of PATROL1. This is a protein essential for stomatal movement, thought to be involved in proton pump delivery to plasma membranes in the stomatal complex of Arabidopsis thaliana. VAEM real-time observation of guard cells and subsidiary cells in A. thaliana cotyledons showed that fluorescently-tagged PATROL1 appeared as dot-like structures on plasma membranes for several seconds and then disappeared. Kymograph analysis of VAEM movie data determined the time distribution of the presence (termed &#8216;residence time&#8217;) of the dot-like structures. The use of VAEM is discussed in the context of this example.

The goal of this protocol is to demonstrate how to monitor fluorescently-tagged protein dynamics on plant cell surfaces with variable-angle epifluorescence microscopy, showing blinking dots of GFP-tagged PATROL1, a membrane trafficking protein, in the cell cortex of the stomatal complex in Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

A plant&#8217;s cell surface is its interface for perceiving environmental cues; it responds with cell biological changes such as membrane trafficking and ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu Ile Canlı Hücrelerdeki Hücre Yüzey Reseptörlerinin Oligomerizasyon Dinamiği Sayı ve Parlaklık Analizi ile Birlikte

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

Tethered Bilayer Lipid Membranes to Monitor Heat Transfer between Gold Nanoparticles and Lipid Membranes

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry using tethered bilayer lipid membranes (tBLMs) assembled on gold electrodes. Irradiated modified GNPs, such as streptavidin-conjugated GNPs, are embedded in tBLMs containing target molecules, such as biotin. By using this approach, the heat transfer processes between irradiated GNPs and model bilayer lipid membrane with entities of interest are mediated by a horizontally focused laser beam. The thermal predictive computational model is used to confirm the electrochemically induced conductance changes in the tBLMs. Under the specific conditions used, detecting heat pulses required specific attachment of the gold nanoparticles to the membrane surface, while unbound gold nanoparticles failed to elicit a measurable response. This technique serves as a powerful detection biosensor which can be directly utilized for the design and development of strategies for thermal therapies that permits optimization of the laser parameters, particle size, particle coatings and composition.

This work outlines a protocol to achieve dynamic, non-invasive monitoring of heat transfer from laser-irradiated gold nanoparticles to tBLMs. The system combines impedance spectroscopy for the real-time measurement of conductance changes across the tBLMs, with a horizontally focused laser beam that drives gold nanoparticle illumination, for heat production.

Altın Nanopartiküller ve Lipid Membranları Arasındaki Isı Transferini İzlemek için Bağlı Bilayer Lipid Membranları

Here we report a protocol to investigate the heat transfer between irradiated gold nanoparticles (GNPs) and bilayer lipid membranes by electrochemistry ...

3D-FRAP Mikroskopisi ile Gap Birleşimine Bağlı MiRNA Transferinin Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler