Name: analysis of the gap junction-dependent transfer of mirna with 3d-frap microscopy
Uploaded: 2017-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy at JoVE.com

이 연구는 연방 교육 연구부 (FKZ 0312138A 및 FKZ 316159), 유럽 연합 구조 기금 (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 및 ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) 및 독일 심장 재단 (F / 01 / 12). 또한 RD는 Rostock University Medical Center (889001)의 FORUN 프로그램, DAMP Foundation 및 BMBF (VIP + 00240)의 지원을받습니다.

신생아 생쥐가 관련된이 프로토콜의 모든 단계는 Rostock University Medical Center의 동물 관리 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 세포 배양 용 접시의 준비 및 심근 세포 배양 용 배지 <ol><li> PBS에서 0.1 % 젤라틴으로 세포 배양 플레이트를 코팅하고 37 ° C에서 4 시간 또는 4 ° C 밤새 인큐베이션하십시오. 젤라틴을 제거하고 멸균 층류 공기 흐름 하에서 건조 시키십시오. </li><li> 10 % 태아 소 혈청 (FBS)과 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)가 보충 된 DMEM 50 ML로 구성된 세포 배양 배지를 준비합니다. 37 ° C로 예열하십시오. </li></ol> 2. 신생아 심근 세포의 분리 <ol><li> 멸균 가위로 목을 베고 신생아 생쥐 (1 ~ 2 일 된)를 희생시키고 흉골을 따라 가슴을 엽니 다. 포어를 사용하여 가슴을 약간 제거하면서 가슴을 제거하고 심장을 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 24-well plate에 옮긴다.(Ca 2+ 및 Mg 2+ 없이). </li><li> 살균 포셉을 사용하여 비 심장 조직 및 큰 혈관을 제거합니다. 얼음처럼 차가운 HBSS가 들어있는 1.5 ML 튜브로 청소 마음을 전송하십시오. 효소 소화에는 튜브 당 최대 5 개의 하트를 사용하십시오. </li><li> 작은 가위로 가슴을 0.5-1mm³ 이하로 말하십시오. </li><li> 다량의 심장을 HBSS로 2 회 씻어 낸다. 1 mL microliter 피펫을 사용하여 HBSS를 흡입 / 첨가한다. 효소를 첨가하기 전에 HBSS를 완전히 제거하십시오. </li><li> 신생아 심장의 효소 소화를 위해서는 시중에서 구입할 수있는 키트를 사용하고 제조업체의 프로토콜 ( Table of Materials 참조)을 따르십시오. 35 분 동안 37 ° C에서 효소와 함께 잠복하면서 매 5 분마다 다진 하트가 담긴 튜브를 흔든다. </li><li> 비 - cardiomyocyte 분수의 준수를 허용 1.5-2 시간 세포 배양 배지를 포함하는 비 코팅 세포 배양 접시에 종자 세포를 중단. 높은 순도라면이 단계를 반복하십시오.의 심근 세포가 필요합니다. 원하는 경우, 비 - cardiomyocyte 분수를 추가로 배양하십시오. 참고 : 15 하트의 세포 현탁액의 경우, 75 cm² 세포 배양 플라스크에서 사전 도금 단계를 수행 할 수 있습니다. 일반적으로 한 신생아 심장에서 ~ 5 x 10 5 세포를 얻습니다. </li><li> 300 x g에서 10 분간 15 mL 원추형 튜브와 원심 분리기에서 뜨는 물을 수집합니다. 세포 배양 매체 1 ML에 세포를 Resuspend. </li><li> Neubauer 챔버 hemocytometer로 세포를 계산하거나, 동등한 방법을 사용하십시오. </li><li> 플레이트는 3 x 10 5 cells / cm²의 밀도를 지닌 6- 웰 플레이트상의 분리 된 심근 세포를 분리 하였다. 37 밤새 세포를 품어 ° C 5 % CO 2 . 참고 : 선택적으로이 시점에서 세포를 트랜 스펙 션 할 수도 있습니다. 그러나 일주일 동안 배양 한 후 일렉트로 포 레이션 (electroporation)을 실시 할 때 증가 된 생존력이 관찰되었다. </li></ol> 3. Fluorescently Labeled miRNA를 사용한 형질 감염 <ol><li> 사전 -따뜻한 세포 배양 배지 (단계 1.2 참조)를 수 욕조 또는 이와 동등한 장치에서 37 ° C로 가열합니다. </li><li> RNase가없는 멸균 수에서 형광성 miRNA의 20 μM 축적 용액을 준비하십시오. </li><li> 90 MM Na 2 HPO 4 , 90 MM NaH 2 PO 4 , 5 MM KCl, 10 MM MgCl 2 및 10 MM sodium succinate가 들어있는 일렉트로 포 레이션 버퍼를 준비하고 7.2로 pH를 조절하십시오. electroporation 버퍼는 -20 ° C에서 몇 개월 동안 저장할 수 있습니다. </li><li> 5 분 0.05 % 트립신을 사용하여 문화 요리에서 세포를 분리하십시오. 세포 배양 배지를 첨가하여 트립신을 비활성화시킨다. </li><li> Neubauer 챔버 hemocytometer로 세포를 계산하거나, 동등한 방법을 사용하십시오. 10 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기. </li><li> 100 μL 당 4 X 10 5 세포의 농도를 얻기 위해 일렉트로 포 레이션 버퍼에 세포를 Resuspend. </li><li> 튜브에 형광 miRNA (최종 농도 : 0.25 μm의)와 세포 현탁액의 100 μL를 혼합하고혼합물을 전기 천공 큐벳에 넣는다. <ol><li> 세포 유형에 따라 적절한 양의 miRNA를 경험적으로 결정하십시오. </li></ol></li><li> &quot;G - 009&quot;프로그램을 사용하여 일렉트로 포 레이션 장치 (물질 표 참조)를 사용하여 일렉트로 포 레이션을 수행하십시오. </li><li> 사전 예열 세포 배양 매체 500 μL를 추가하고 4 - 웰 유리 바닥 챔버 슬라이드의 우물에 전체 세포 현탁액 (4 X 10 5 세포)을 전송합니다. 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 하루 동안 세포를 배양하십시오. 참고 : FRAP 분석의 경우 ~ 80 %의 셀 밀도가 최적입니다. 분류 된 miRNA의 transfection은 electroporation을 사용하여 독점적으로 수행해야합니다. 분류 된 miRNA 분자의 균질 한 분포가 FRAP 측정에 유리하므로, 시약 기반 형질 감염은 권장하지 않습니다. </li></ol> 4. 3D-FRAP 현미경 검사 (3 일) 적용 <ol><li> 현미경 배양기를 37 °로 예열하십시오.C와 열 평형을 확립하고 표류의 가능성을 줄이기 위해 FRAP 측정 전에 적어도 2 시간 공 촛점 현미경 시스템을 전환합니다. 가능하면 5 % CO2 대기를 유지하십시오. </li><li> 스테이지 슬라이드 홀더에 챔버 슬라이드를 삽입합니다. </li><li> 1.4 NA 오일 대물 렌즈 (400 배율)와 낮은 레이저 출력에서 ​​561 nm의 레이저 여기 광을 사용하여 570-680 nm의 검출 범위로 트랜 스펙 션 된 심근 세포의 클러스터를 찾으십시오. 참고 : FRAP 설정, 이미지 획득 및 분석의 정의는 현미경 전용 소프트웨어를 사용하여 수행했습니다 ( 재료 표 참조). </li><li> &quot;Setup Manager&quot;에서 &quot;z-Stack&quot;, &quot;Time Series&quot;, &quot;Bleaching&quot;및 &quot;Regions&quot;버튼을 활성화하십시오. </li><li> FRAP 매개 변수를 정의하십시오. <ol><li> &quot;획득 모드&quot;메뉴에서 &quot;프레임 크기&quot;를 설정하여 이미지 획득 설정을 정의하십시오4; 512 x 512, &quot;라인 단계&quot;를 1로, &quot;스캔 시간&quot;을 1 초 미만으로 설정하십시오. </li><li> &quot;Channels&quot;메뉴에서 레이저 파워, 오프셋 및 게인 설정을 조정하여 최소 레이저 여기에서 최대 형광을 얻습니다 ( 예 : 레이저 출력 : 1-5 %). 강도 채도를 피하기 위해 조정하십시오. &quot;핀홀 크기&quot;를 2 μm로 설정하십시오. </li><li> 다음으로 &quot;Regions&quot;메뉴에서 &quot;ROI drawing tool&quot;을 선택하고 커서를 사용하여 대상 셀, 참조 셀 및 배경 영역을 표시합니다. 필요한 경우, 표백을 위해 여러 표적 세포를 선택하십시오. </li><li> &quot;표백&quot;메뉴 ( 예 : 반복 : 9-14, 광 표백을위한 레이저 출력 : 100 %, 이미지 획득 간격 : 60 초,주기 : 15)에서 표백 설정을 조정하십시오. 3 회 초기 스캔 후 표백 시작을 정의하십시오. </li><li> &quot;z-Stack&quot;메뉴에서 셀의 두께에 따라 Z- 스택 획득을위한 한계를 정의하십시오. &quot;숫자 o 조정f z-layers &quot;를 12 - 15로 설정합니다. </li><li> FRAP 실험을 시작하고 형광 복구를 기록합니다. 참고 : FRAP 실험의 설정은 세포 유형, 형광 염료 및 현미경 시스템에 따라 다르므로 파일럿 실험을 수행하여 FRAP에 대한 최적 매개 변수를 결정하는 것이 가장 좋습니다. 표백은 초기 형광 강도를 50 % 이상 줄이는 데 충분해야합니다. 일반적으로 형광 복구는 고원 단계에 도달 할 때까지 30-60 초마다 기록해야합니다. </li></ol></li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 획득 한 z- 스택의 최대 투사를 생성하고 표백 된 표적 세포, 참조 세포 및 배경의 형광 강도 값을 얻습니다. 현미경 전용 소프트웨어를 사용하여 &quot;Processing&quot;→ &quot;Maximum intensity projection&quot;→ 파일 선택 → &quot;Apply&quot;를 클릭하십시오. <ol><li> 또는, 동급 이미지 분석 도구 ( <e예를 들어, ImageJ). </li></ol></li><li> 대상 세포, 배경 및 참조 세포의 모든 시점에서 형광 강도 데이터를 스프레드 시트에 복사합니다. <ol><li> 획득 과정에서 발생한 photobleaching을 수정하기 위해 대상 세포의 강도 값에서 참조 셀의 배경 강도와 강도를 뺍니다. 각 시점에 대한 배경 및 기준 셀 보정을 수행하십시오. </li><li> 표백 전 초기 형광 강도로 각 값을 나눔으로써 보정 된 FRAP 데이터를 초기 형광 강도로 표준화하십시오. </li><li> FRAP 곡선을 얻으려면 각 시점의 강도 값에서 빼서 표백 직후의 형광 강도로 기준선을 설정하십시오. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+and+Mechanisms+of+miRNAs+and+siRNAs.">Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs.</a> Cell. 136 (4), 642-655 (2009).</li><li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+state-of-the-art.">Small silencing RNAs: state-of-the-art.</a> Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).</li><li>Raghunathan, S., Patel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+implications+of+small+interfering+RNA+in+cardiovascular+diseases.">Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases.</a> Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).</li><li>Sluijter, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+Cardiovascular+Regenerative+Medicine:+Directing+Tissue+Repair+and+Cellular+Differentiation.">MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation.</a> ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).</li><li>Li, M., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+MicroRNAs:+Potential+and+Emerging+Biomarkers+for+Diagnosis+of+Cardiovascular+and+Cerebrovascular+Diseases.">Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases.</a> Biomed Res Int. , 1-9 (2015).</li><li>Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+cardiovascular+disease:+an+introduction+for+clinicians.">MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians.</a> Heart. 101 (12), 921-928 (2015).</li><li>Maes, M., Crespo Yanguas, ., Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+and+pannexin+signaling+in+gastrointestinal+and+liver+disease.">Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease.</a> Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).</li><li>Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+connexin+43+in+cardiovascular+diseases.">Role of connexin 43 in cardiovascular diseases.</a> Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).</li><li>Naus, C. C., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implications+and+challenges+of+connexin+connections+to+cancer.">Implications and challenges of connexin connections to cancer.</a> Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).</li><li>Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+modulate+glioma+invasion+by+direct+transfer+of+microRNA.">Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA.</a> Oncotarget. 6 (17), 15566-15577 (2015).</li><li>Lee, H. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+deliver+synthetic+microRNA+mimics+to+glioma+cells+and+glioma+stem+cells+and+inhibit+their+cell+migration+and+self-renewal.">Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal.</a> Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).</li><li>Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+microRNA+is+transferred+between+glioma+cells.">Functional microRNA is transferred between glioma cells.</a> Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).</li><li>Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction+mediated+miRNA+intercellular+transfer+and+gene+regulation:+A+novel+mechanism+for+intercellular+genetic+communication.">Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication.</a> Sci Rep. 6, 19884 (2016).</li><li>Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant+connexin26+mutants+associated+with+human+hearing+loss+have+trans-dominant+effects+on+connexin30.">Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30.</a> Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).</li><li>Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+assessment+of+gap+junctions+in+monolayer+and+three-dimensional+cultures+of+human+tendon+cells+using+fluorescence+recovery+after+photobleaching.">Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching.</a> J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).</li><li>Lemcke, H., Nittel, M. -. L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+requires+a+biphasic+modulation+of+gap+junctional+intercellular+communication+caused+by+dynamic+changes+of+connexin43+expression.">Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression.</a> Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).</li><li>Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctional+shuttling+of+miRNA+-+A+novel+pathway+of+intercellular+gene+regulation+and+its+prospects+in+clinical+application.">Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application.</a> Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).</li><li>Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+connexin43+in+the+EGF/EGFR+signalling+during+self-renewal+and+differentiation+of+neural+progenitor+cells.">Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells.</a> Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).</li><li>Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applying+3D-FRAP+microscopy+to+analyse+gap+junction-dependent+shuttling+of+small+antisense+RNAs+between+cardiomyocytes.">Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).</li><li>Laupheimer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Migration+of+Subpopulations+of+Bone+Marrow+Cells+along+an+SDF-1+&#945;+and+ATP+Gradient.">Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 &#945; and ATP Gradient.</a> Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).</li><li>Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junctions+enhance+the+antiproliferative+effect+of+microRNA-124-3p+in+glioblastoma+cells.">Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells.</a> J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).</li><li>Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+mobility+to+crosstalk.+A+model+of+intracellular+miRNAs+motion+may+explain+the+RNAs+interaction+mechanism+on+the+basis+of+target+subcellular+localization.">From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization.</a> Math Biosci. 280, 50-61 (2016).</li><li>Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+single+molecule+microscopy+reveals+two+kinetically+distinct+pathways+for+microRNA+assembly.">Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly.</a> EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).</li><li>Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+photobleaching,+laser+illumination+unbinds+fluorescent+proteins.">Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins.</a> J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).</li><li>Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reactive+oxygen+species+generation+and+calcium+increase+induced+by+visible+light+in+astrocytes.">Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).</li><li>Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA:+Function,+detection,+and+bioanalysis.">MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis.</a> Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).</li><li>Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNA+expression+profiles+in+normal+human+tissues.">Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues.</a> BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).</li><li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat Commun. 2, 282 (2011).</li><li>Squadrito, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+RNAs+Modulate+MicroRNA+Sorting+to+Exosomes+and+Transfer+to+Acceptor+Cells.">Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells.</a> Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).</li><li>Zhang, B., Farwell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNAs:+a+new+emerging+class+of+players+for+disease+diagnostics+and+gene+therapy.">microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).</li><li>Chen, Y., Gao, D. -. Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+delivery+of+miRNAs+for+cancer+therapy:+Challenges+and+strategies.">In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).</li></ol>

저자는 아무런 이해 상충을 선언하지 않습니다.

<html> miRNA는 세포 생리학에서 중요한 역할을 담당하며, 다른 것들 중에서도 GJ를 세포 간 교환을위한 경로 11 , 12 , 22 로 사용함으로써 신호 분자로 작용하는 것으로 나타났습니다. 현재 프로토콜 세포 클러스터 내에서 형광 miRNAs를 사용 하여이 GJ 의존 shuttling을 특성화 하는 체외 라이브 셀 이미징 기술을 제공합니다. 프로토콜은 세포 모델 시스템으로 cardiomyocytes에 개발되었습니다. 그러나, electroporation이 miRNA transfection에 적합한 방법이라면이 접근법은 여러 세포 유형에 적용될 수 있습니다. 세포 간 교환 외에도 제시된 기술은 miRNA 분자의 세포 내 이동성을 조사하는데도 적합합니다 ( 예 : 세포 내에서 가능한 전달 메커니즘의 확인을 위해) 23 , 24 . FRAP 현미경에 의한 miRNA 전달에 대한 연구는 형광 태그가 붙은 miRNA 분자가 필요합니다 ( 그림 2 ). 특정 세포 miRNA의 라벨링이 가능하지 않기 때문에 외래성의 도입 된 miRNA만을 3D-FRAP에 사용하여 세포 간 이동성을 분석 할 수 있습니다 우리의 실험에서 세포는 250 nM miRNA로 형질 감염되었으며이 농도는 세포 당 miRNA 수준이 10에서 50,000 분자 인 생리적 조건에 비해 훨씬 높았다 27,28. 이러한 저농도는 FRAP 실험에는 사용할 수 없다. 특정 수준의 형광성 miRNA 분자는 충분한 형광 신호를 얻고 배경 형광과 형광 표지 된 miRNA 사이의 적절한 식별을 보장하기 위해 필요합니다. 그러나 공 촛점 이미징 시스템과 염료 특성에 따라 낮은 miRNA 농도 사용 FRAP 분석을 위해서는 -nM 범위가 가능해야합니다. &lt;/ p&gt; 유동 세포 계측법, PCR 및 루시퍼 라제 기자 분석을 포함한 세포 간 miRNA 전달을 연구하기 위해 서로 다른 기술이 일반적으로 적용됩니다 12 , 13 . 이러한 방법은 낮은 시간 해상도 ( 즉, 수 시간에서 수일)로 miRNA 셔틀 링을 감지합니다. 반대로, 3D-FRAP 현미경은 실시간으로 miRNA 전달 및 이동성의 시각화 및 정량화를 가능하게합니다. gap junctional 세포 - 세포 접촉에 더하여, miRNA의 세포 간 왕복 운동은 엑소 좀 18 , 29 , 30 과 같은 다른 메커니즘에 의해 매개된다. 3D-FRAP만이 exosomal과 gap junctional transfer를 구별하기에 충분히 높은 시간 해상도를 제공한다. 따라서, 그것은 다른 병리학 적 또는 생리 학적 조건 하에서의 miRNA 시그널링에 대한 GJ 투과성의 직접 효과에 대한 구체적인 조사를 허용한다 ( Figu2). 기존 2D-FRAP보다 우수한 3D-FRAP을 사용하는 것이 좋습니다. GJ 종속 miRNA 전송에 대한보다 정확한 데이터를 제공하기 때문입니다. 3D-FRAP 측정에는 전체 셀 볼륨이 포함되며, 이는 대형 벌크 셀 유형을 사용할 때 중요합니다. 또한, 2D-FRAP에서 형광 복구를 현저하게 저해하는 것으로 밝혀진 초점 변경 또는 세포 이동을 보정 할 수 있습니다 ( 그림 3 ). 마지막으로, 3D-FRAP 실험에서 z- 스택의 기록은 공간 정보를 얻을 수있는 가능성을 제공하는데, 단 하나의 2D 레이어가 형광 강도 분석에 사용되는 경우에는 가능하지 않습니다 ( 그림 3B ). 형광 복구는 인접한 세포로부터의 miRNA의 유입에 의존하기 때문에 표백 된 세포에 연결된 세포의 수는 중요하며 신뢰할 수있는 데이터를 얻기 위해서는 여러 측정에서 유사해야합니다. 따라서 높은 셀 밀도가 필요합니다.FRAP 분석에 가장 적합한 세포 성 클러스터의 형성을 보장한다. 또한 높은 레이저 강도로 인한 광독성 효과를 피하기 위해 가벼운 표백 조건 ( 예 : 레이저 출력, 표백 시간 및 스캔 설정)을 선택하기위한 사전 실험을 수행해야합니다 25 , 26 . 이것은 또한 획득 과정에서 발생하는 photobleaching을 줄이는 데 도움이됩니다. 한계에도 불구하고, 우리의 데이터는 3D-FRAP이 세포 네트워크 내에서 신호 분자로 miRNA의 역할을 평가하는 강력한 도구라는 것을 보여줍니다. 특정 miRNA에 대한 miRNA shuttling 또는 GJs의 선택적 투과성에 대한 connexin 조성의 영향은 운송 효율의 직접적인 정량화를 통해 해결할 수 있습니다. 3D-FRAP은 배포를 용이하게하는 적절한 조건을 정의하는 등 miRNA 및 siRNA를 특징으로하는 새로운 치료법 개발을 향상시키는 데 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다GJ 네트워크 를 통해 작은 RNAs n 개 31 , 32 .

작은 noncoding RNA는 세포 유전자 조절에서 중요한 역할을합니다. 이 분자는 특정 표적 mRNA에 결합하는 20-25 개의 뉴클레오타이드로 이루어져 번역의 막힘 또는 mRNA 분해 1 또는 2를 유도합니다. miRNA와 siRNA와 같은 작은 RNA에 의해 수행되는 유전자 조절 과정은 많은 다른 종에서 발견 된 매우 보전 된 메커니즘입니다 3 . 특히, miRNA 분자는 증식, 분화 및 재생을 포함한 다양한 생리적 과정에 매우 중요합니다. 또한, miRNA 발현의 조절 장애는 많은 병리학 적 장애로 인한 것입니다. 그에 상응하여, miRNA는 진단을위한 바이오 마커 및 유전자 요법을위한 치료제로서 적합하다는 것이 입증되었습니다 6 , 7 </sup&gt;. GJ는 분자량이 1kD 인 분자를 확산 교환 할 수있는 인접한 두 세포의 원형질막에 특화된 단백질 구조입니다. 그들은 조직 발달, 분화, 세포 사멸, 암이나 심혈관 질환과 같은 병리학 적 장애에 중요한 것으로 밝혀졌습니다 8 , 9 , 10 . 여러 분자가 이온, 대사 산물 및 뉴클레오타이드를 포함하여 GJ 채널을 통과 할 수 있다고 기술되어 왔습니다. 흥미롭게도 GJ는 작은 RNA 11,12 의 세포 간 이동을위한 경로를 제공하는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서, miRNAs는 생산 된 세포 내에서뿐만 아니라 수용 세포 내에서 작용할 수 있습니다. 이것은 세포 간 신호 전달 시스템에서 miRNA의 역할을 강조합니다. 동시에, 데이터는그 gap junctional intercellular communication은 miRNA 기능과 밀접하게 연관되어있다. 조직 항상성, 병리학 및 진단에 대한 miRNA 및 GJ의 중요한 영향으로 인해 GJ의 기능과 miRNA의 관련 세포 간 역학에 대한 포괄적 인 이해는 miRNA 기반 질병의 메커니즘을 명확히하고 새로운 전략을 개발하는 데 도움이 될 것입니다. miRNA 치료법. gap junctional coupling의 정도에 따라 세포 간 miRNA 분자의 이동은 매우 신속한 과정이 될 수 있습니다. 따라서, 이들 조절 신호 분자의 빠른 세포 간 이동의 시각화 및 정량화를 가능하게하는 방법론이 요구된다. 일반적으로 작은 RNA 11 , 12 , 13 , 14 의 왕복을 입증하기 위해 유동 세포 계측법과 분자 생물학적 기술이 적용되었습니다. 그러나 FRAP 마이크로와는 달리이러한 접근법은 GJ를 통한 miRNA 교환을 분석 할 때 높은 시간 해상도가 필요하지 않습니다. 더욱이 FRAP 현미경 검사법은 덜 침습적이므로 여러 세포 유형에서 GJ에 의존하는 분자의 교환을 평가하는 강력하고 새로운 생체 ​​영상 기술입니다 15 , 16 , 17 . 여기, 우리는 cardiomyocytes 사이에 miRNA 셔틀을 평가하는 3D - FRAP의 응용 프로그램을 설명하는 자세한 프로토콜을 제시한다. 이 목적을 위해, 형광성으로 표지 된 miRNA로 심근 세포를 형질 감염시켰다. 이 miRNA로 표시된 세포는 광 표백되었고, 인접한 세포로부터 다시 유입되는 gap junctional miRNA는 시간 의존적으로 기록되었다. FRAP 실험의 높은 시간 해상도는 살아있는 세포 사이의 miRNA 및 siRNA의 세포 간 전달을 정확하게 평가하기위한 운동 연구를 수행 할 수있는 가능성을 제공합니다. 모레 오ver., 작은 RNA는 매우 다른 동력학을 가진 다른 메커니즘을 통해 교환 될 수 있기 때문에, FRAP 현미경 검사는 GJ가 각각의 왕복 운동 과정에 얼마나 관여 하는지를 명확히하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 3D-FRAP은 GJ 투과성의 생리 학적 및 병리학 적 변화와 작은 RNA 전이에 미치는 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다 15 , 19 .

<table><tbody><tr><td>neonatal NMRI mice</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>0.1% solution in PBS, sterilized</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;acute;s modified medium</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-03550</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 U/mL, 100&amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3306</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plastic</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88281</td><td>included in primary cardiomyocyte isolation kit</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic</td><td>Dharmacon</td><td>CP-004500-01-05</td><td>dissolve in RNAse free water, stock solution 20&amp;micro;M</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Carl Roth</td><td>T877.2</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Serva</td><td>28305.01</td><td></td></tr><tr><td>Sodium succinate</td><td>Carl Roth</td><td>3195.1</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin/EDTA solution</td><td>Merck</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>4-well- Glass bottom chamber slides</td><td>IBIDI</td><td>80827</td><td>coat with 0.1% gelatin solution</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td></td><td>program G-009 was used for Electroporation&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 system</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-actinin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>Connexin43 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9059</td><td>dilution 1:200</td></tr><tr><td>goat anti-mouse Alexa 594 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11005</td><td>dilution 1:300</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit Alexa 488 antibody</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>dilution 1:300</td></tr><tr><td>Connexin43 siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM16708 ID158724</td><td>final concentration 250 nM</td></tr><tr><td>Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein Red-Orange</td><td>Thermo Scientific</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>DAPI nuclear stain</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of the gap junction-dependent transfer of mirna with 3d-frap microscopy

miRNA 및 siRNA와 같은 작은 안티센스 RNA는 세포 생리학 및 병리학에서 중요한 역할을하며, 또한 여러 질병의 치료에서 치료제로 사용될 수 있습니다. miRNA / siRNA 치료를위한 새롭고 혁신적인 전략의 개발은 근본적인 메커니즘에 대한 광범위한 지식을 기반으로합니다. 최근의 데이터는 작은 RNA가 갭 접합부 (gap junction-dependent) 방식으로 세포들 사이에서 교환 됨으로써 수용 세포에서 유전자 조절 효과를 유도 함을 시사한다. 분자 생물학적 기법과 유동 세포 계측 분석은 일반적으로 miRNA의 세포 간 교환을 연구하는 데 사용됩니다. 그러나, 이러한 방법은 높은 시간 해상도를 제공하지 못하며, 이것은 분자의 갭 접합 플럭스를 연구 할 때 필요하다. 따라서 miRNA / siRNA가 세포 간 신호 전달 분자로서의 영향을 조사하기 위해서는 이러한 작은 RNA를 세포 수준에서 분석 할 수있는 새로운 도구가 필요합니다. 현재의 프로토콜은 ap(3 차원 - FRAP) 현미경 검사 후 3 차원 형광 복구의 plication은 심장 세포 사이의 갭 접합 - 의존적 인 miRNA 분자의 교환을 해명합니다. 중요한 것은,이 간단하고 비 침습적 인 라이브 셀 이미징 접근 방식은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 형광 표지 된 작은 RNA의 갭 접합 셔틀 링의 시각화 및 정량화를 허용합니다. 3D-FRAP에서 얻은 데이터는 작은 RNA가 세포 간 네트워크 내에서 신호 분자로 작용하는 세포 간 유전자 조절의 새로운 경로를 확인합니다.

여기, 신생아 cardiomyocytes 이내 형광 miRNA의 간격 junctional 셔틀을 연구 비 침습적 인 기술로 3D - FRAP 현미경을 제시합니다. 분리 된 심근 세포는 전형적으로 흘린 α- 액티 닌 패턴을 나타내었고, 세포 간 경계 ( 그림 1A , 흰 화살촉)를 따라 Cx43의 큰 플라크를 포함하여 분자간의 높은 세포 간 플럭스를 허용했다. 단리 된 심근 세포의 순도는 α-actinin 양성 세포의 현미경 적 정량으로 평가 하였다. 일부 비 - 심근 세포 (α- 악티닌 - 음성 세포)가 배양 물에 존재 하였지만, 신생아의 심근 세포는 분리 후 주요 세포 유형을 나타내었다 (79.62 ± 3.68 %, 도 1B ). miRNA의 gap junctional exchange를 조사하기 위해 세포를 형광 표지 된 miRNA로 형질 감염시켰다. 엘ctroporation은 높은 형질 감염 효율과 transfection 된 화합물의 균질 한 분포를 보장하기 때문에 세포에 miRNA 분자를 전달하기위한 선택 방법이며, 이는 FRAP 분석에 필수적입니다. 우리 실험 설정에서, 우리는 유동 세포 계측법 ( 그림 2A )에 의해 결정, ~ 45 %의 transfection 효율을 달성했습니다. FRAP에 대한 cardiomyocytes의 준비는 문화 플레이트에서 분리, electroporation, 그리고 챔버 슬라이드에 다시 첨부가 포함됩니다. Flow cytometric live / dead assay는 대다수의 세포가 높은 생존력을 나타냄을 보여 주었으며, gap junctional communication ( 그림 2B )을 분석 할 때 중요합니다. 또한, 세포 밀도는 FRAP 결과에 영향을 미치는 중요한 매개 변수입니다. 최적의 FRAP 측정을 위해서는 세포 클러스터의 형성과 세포 간의 기능적 갭 접합부의 형성을 고려하여 ~80 %의 밀도로 세포를 파종해야합니다 ( 그림2C). FRAP 분석을 위해 표적 세포는 세포 클러스터 내에서 선택되고 100 % 레이저 출력으로 광표백되어 선택된 세포에서 감소 된 miRNA 형광을 유도합니다 ( 그림 3A , 표백제). 결과적으로, 형광 복구는 표백 된 영역에 인접한 세포에서 miRNA의 전송을 시각화하기 위해 기록됩니다. 형광 회복의 고원 단계가 13 분 후에 도달했기 때문에,이 시간 범위는 FRAP 실험에서 이미지 획득에 사용되었다. 수집 된 데이터의 정량 분석 ​​및 표준화는 평균 20 %의 회복을 나타냅니다. 이 데이터는 또한 FRAP 현미경 검사로 높은 시간 해상도로 miRNA 셔틀을 신속하게 기록 할 수 있음을 입증했습니다. 염료 특성에 따라 획득 매개 변수를 변경하여 시간 해상도를 추가로 높일 수 있습니다. 3D-FRAP을 사용하면다른 조건 하에서의 miRNA에 대한 GJ 투과성의 비교. 이를 증명하기 위해 Cx43의 siRNA 매개 knockdown을 유도하여 단백질 발현을 감소시키고 ( 그림 3C ) gap junctional communication의 억제를 유도했습니다. 결과적으로 형광 회수율이 50 % 이상 감소하여 miRNA 전이 효율이 세포 간 갭 접합 결합 정도에 크게 의존한다는 것을 나타냅니다 ( 그림 3B , Cx43 knockdown). 형광 복구가 분리 Dy547 - 태그 대신에 형광으로 표지 된 miRNA의 통과를 반영하는지 확인하기 위해, 우리는 또한 calcein 염료에 대한 FRAP 데이터를 획득했습니다 ( 그림 3D ). Calcein은 Dy547에 필적하는 분자량을 가지며 따라서 유사한 전달 역학을 보유합니다. Dy547- 표지 된 miRNA의 형광 회수와 대조적으로, 칼 세인은 증가 된 갭 접합 교환을 나타내며, 이는 Dy547 태그 imiRNA 분자로부터 분리되지 않았습니다 ( 그림 3D ). 안정된 초점 조건은 특히 장기 측정을 수행 할 때 FRAP 실험 전반에 걸쳐 필수적입니다. 2D 애플리케이션에 비해 3D-FRAP은 잠재적 인 포커스 드리프트를 보완 할 수 있습니다. 그림 4 에서 볼 수 있듯이 약간의 초점 변경만으로도 단일 2D 레이어가 FRAP 실험에 사용되는 경우 miRNA의 형광 신호 감지에 영향을 미칩니다 ( 그림 4B ). 대조적으로, 3D-FRAP의 경우, 표적 세포의 전체 z- 스택이 기록되고 최대 투사가 데이터 분석을 받게됩니다 ( 그림 4A ). 포커스 드리프트가 표준화 된 형광 - 세기 곡선에 미치는 영향은 도 4c 에 묘사된다. 형광 복구가 3D-FRAP에서 시간이 지남에 따라 꾸준히 증가하는 반면, 2D-FRAP 획득은 감소 함 of 형광 신호. 초점 변화에 대한 보상과 더불어 3D-FRAP은 또한 miRNA의 gap junctional exchange의 공간 데이터를 제공합니다. 그림 5 는 FRAP 실험의 3D 표면 렌더링을 보여줍니다. 최대 투영과 비교하여, z- 스택의 획득은 세포 내 miRNA의 위치 및 이동성을 조사하기 위해 3D 재구성을 생성하는 데 사용될 수 있습니다 ( 그림 5 ). 세포 기관과 공동 표지하면 miRNA 전달에서 다른 세포 구성 요소의 관련성을 조사 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55870/55870fig1.jpg" /> 그림 1 : 고립 된 신생아 Cardiomyocytes의 대표 현미경 이미지. ( A ) 구조 조명 현미경 검사는 Cx43의 높은 발현을 보여 주며, 이것은 큰 p세포 - 세포 경계 (화살촉)에 laques. 인접한 세포와의 GJ 형성의 발음은 miRNA를 포함한 작은 분자의 광범위한 교환을 가능하게합니다. 스케일 바 = 20 μm ( B ) 분리 된 심근 세포의 순도. α-actinin 표지는 격리 후 주요 세포 유형을 나타내는 것으로 나타났습니다. 스케일 바 = 50 μm. 세포를 항 Cx43 (녹색) 및 항 -α- 액티 닌 항체 (적색)로 염색 하였다. 핵은 DAPI (파란색)를 사용하여 가시화되었습니다. 구조 조명 현미경 및 면역 학적 표지에 대한 설명은 이전의 간행물 20 에서 제공됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55870/55870fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55870/55870fig2.jpg" /> 도표 2 : Transfection 효율성, 생존 능력<html> , 신생아 심근 세포 배양의 세포 밀도. ( A ) 유동 세포 계측법은 miR547 일렉트로 포 레이션이 ~ 45 %의 형질 감염 효율을 나타냄을 보였다. ( B ) FRAP에 사용되는 cardiomyocytes의 세포 생존 능력. 분리, 전기 천공 및 재 부착 후, 심근 세포는 살아있는 세포 및 죽은 세포의 염색을 실시하여 높은 세포 생존력을 보였다. FRAM 현미경 검사를 위해 준비된 mir547 - transfected cardiomyocytes의 현미경 이미지 ( C ). 80-90 %의 세포 밀도는 갭 접합 세포 - 세포 접촉의 현저한 형성을 보장한다. 스케일 바 = 50 μm. 트랜 스펙 션 효율 및 생존력 염색의 유동 세포 계측 분석 방법은 이전의 공보 20 , 21 에 언급되어있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55870/55870fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> ontent &quot;fo : keep-together.within-page =&quot;1 &quot;&gt; <img alt="그림 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55870/55870fig3.jpg" /> 그림 3 : 신생아 심근 세포에서 miRNA의 GJ 의존적 교환. ( A ) FRAP 실험의 대표 이미지. 표지 된 miRNA로 형질 감염시킨 후 세포 클러스터 내의 표적 세포를 강한 레이저 펄스 (표백제 대 표백제)로 표백합니다. 간격 결합 결합의 정도에 따라, 인접한 세포로부터 miRNA의 갭 접합 유입은 표백 된 표적 세포 (표백제 t = 3, 6, 9 및 13 분)에서 증가 된 형광 강도를 초래한다. Scale bar = 20 μm ( B ) 획득 된 FRAP 데이터의 정량 분석은 13 분 후에 20 %의 형광 회복을 보여줍니다. miRNA의 세포 내 전달에 관여 GJ를 확인하기 위해 cx43 knockdown이 수행되어 형광 복구 (50 %)가 크게 감소했습니다. ( C ) 항 -Cx43을 이용한 면역 염색항체 및 후속 공 촛점 현미경 검사는 단백질 수준에서 Cx43 넉다운 효율을 입증합니다. 스케일 바 = 50 μm. ( D ) miR547 및 calcein 염료의 FRAP 데이터의 비교는 다른 전달 역학을 보여줍니다. calcein의 분자량이 작을수록 dy547- 표지 된 miRNA 분자에 비해 형광 회수가 증가했습니다. FRAP 곡선은 평균 ± SEM으로 나타낸 n≥56 세포의 데이터를 요약합니다. 통계 분석은 양방향 ANOVA와 Bonferroni post-hoc test (* P &lt;0.05, ** P &lt;0.01, *** P &lt;0.001)를 사용하여 수행되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55870/55870fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55870/55870fig4.jpg" /> 그림 4 : 3D-FRAP 현미경을 이용한 초점 표류 보정. ( <strong&gt; A 및 B ) photobleached 세포 (빨간색 선)의 대표 이미지는 3D 및 2D - FRAP 실험 중 형광 강도에 초점 표류의 영향을 보여줍니다. ( A ) 3D-FRAP에서 z-stack은 각 시점에 대해 기록되고 최대 투영은 데이터 드리프트에 사용되며 포커스 드리프트를 수정합니다. 스케일 바 = 20 μm. ( B ) 반대로 2D-FRAP의 경우 단 하나의 2D 레이어 만 데이터 분석을 받게됩니다. 따라서 전체 형광 강도는 초점 변화에 의해 크게 감소합니다. 스케일 바 = 20 μm. ( C ) 3D 및 2D-FRAP 실험의 대표 표준화 형광 강도 곡선은 초점 회복의 형광 이동에 대한 강한 영향을 나타내며 세포 간 miRNA 왕복 운동을 연구 할 때 3D 획득의 이점을 보여줍니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55870/55870fig4large.jpg" target="_blank">th의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>숫자입니다. <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55870/55870fig5.jpg" /> 그림 5 : 3D-FRAP 실험의 3D 표면 렌더링. (왼쪽) FRAP 측정의 최대 투영입니다. photobleached 세포 (빨간색 프레임)는 인접 세포에서 miRNA 전송으로 인해 형광 강도의 증가를 보여줍니다. (오른쪽) 같은 photobleached 세포 (빨간색)의 인수 z - 스택은 miRNA의 공간적 분포를 시각화하기 위해 3D 표면 렌더링을 받았다. 스케일 바 = 20 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55870/55870fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy at JoVE.com

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

여기, 우리는 miRNA의 갭 접합 종속 셔틀 (gap junction-dependent shuttling) 분석을위한 광 표백 (photobleaching) 후 3 차원 형광 복구 (3D-FRAP)의 응용을 기술한다. 일반적으로 적용되는 방법과는 달리, 3D-FRAP은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 작은 RNA의 세포 간 전달을 정량화합니다.

3D-FRAP 현미경을 이용한 miRNA의 gap junction 의존적 전달 분석

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

analysis-gap-junction-dependent-transfer-mirna-with-3d-frap

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K 조회수.  Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC).  여기, 우리는 miRNA의 갭 접합 종속 셔틀 (gap junction-dependent shuttling) 분석을위한 광 표백 (photobleaching) 후 3 차원 형광 복구 (3D-FRAP)의 응용을 기술한다. 일반적으로 적용되는 방법과는 달리, 3D-FRAP은 높은 시공간 해상도로 실시간으로 작은 RNA의 세포 간 전달을 정량화합니다. 

비디오: Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

연구

생화학

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

생체공학

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

교양 뉴런의 막 단백질의 측면 보급과 Exocytosis은 형광 복구 및 형광 손실 Photobleaching를 사용하여 평가

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

신경과학

Measurement of Force-Sensitive Protein Dynamics in Living Cells Using a Combination of Fluorescent Techniques

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called mechanotransduction. A crucial step in mechanotransduction is the transmission of forces between the external and internal environments. To transmit forces, there must be a sustained, unbroken physical linkage created by a series of protein-protein interactions. For a given protein-protein interaction, mechanical load can either have no effect on the interaction, lead to faster disassociation of the interaction, or even stabilize the interaction. Understanding how molecular load dictates protein turnover in living cells can provide valuable information about the mechanical state of a protein, in turn elucidating its role in mechanotransduction. Existing techniques for measuring force-sensitive protein dynamics either lack direct measurements of protein load or rely on the measurements performed outside of the cellular context. Here, we describe a protocol for the F&#246;rster resonance energy transfer-fluorescence recovery after photobleaching (FRET-FRAP) technique, which enables the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells. This technique is potentially applicable to any FRET-based tension sensor, facilitating the study of force-sensitive protein dynamics in variety of subcellular structures and in different cell types.

Here, we present a protocol for the simultaneous use of F&#246;rster resonance energy transfer-based tension sensors to measure protein load and fluorescence recovery after photobleaching to measure protein dynamics enabling the measurement of force-sensitive protein dynamics within living cells.

살아있는 세포 형광 기술의 조합을 사용 하 여 힘에 민감한 단백질 역학의 측정

Cells sense and respond to physical cues in their environment by converting mechanical stimuli into biochemically-detectable signals in a process called ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

생물학

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

휴대 통신 분석을위한 단일 세포 미세 주입

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

3 차원 히드로 겔의 이미지를 FRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

기능 이미징 3D 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 바이러스 성 녹음 방송 공장

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how fluorescent recovery after photobleaching (FRAP) and photoactivation techniques can be used to study the spatiotemporal dynamics of proteins in subcellular locations. We also show how these techniques enable straightforward determination of various parameters linked to actin cytoskeletal regulation and cell motility. Moreover, the microinjection of cells is additionally described as an alternative treatment (potentially preceding or complementing the aforementioned photomanipulation techniques) to trigger instantaneous effects of translocated proteins on cell morphology and function. Micromanipulation such as protein injection or local application of plasma membrane-permeable drugs or cytoskeletal inhibitors can serve as powerful tool to record immediate consequences of a given treatment on cell behavior at the single cell and subcellular level. This is exemplified here by immediate induction of lamellipodial cell edge protrusion by the injection of recombinant Rac1 protein, as established a quarter-century ago. In addition, we provide a protocol for determining the turnover of enhanced green fluorescent protein (EGFP)-VASP, an actin filament polymerase prominently accumulating at lamellipodial tips of B16-F1 cells, employing FRAP and including associated data analysis and curve fitting. We also present guidelines for estimating the rates of lamellipodial actin network polymerization, as exemplified by cells expressing EGFP-tagged &#946;-actin. Finally, instructions are given for how to investigate the rates of actin monomer mobility within the cell cytoplasm, followed by actin incorporation at sites of rapid filament assembly, such as the tips of protruding lamellipodia, using photoactivation approaches. None of these protocols is&#160;restricted to components or regulators of the actin cytoskeleton, but can easily be extended to explore in analogous fashion the spatiotemporal dynamics and function of proteins in various different subcellular structures or functional contexts.

We describe how micro- and photomanipulation techniques such as FRAP and photoactivation enable the determination of motility parameters and the spatiotemporal dynamics of proteins within migrating cells. Experimental readouts include subcellular dynamics and turnover of motility regulators or of the underlying actin cytoskeleton.