Yazarlar bu protokol üzerinde translasyonel genomik grubunun üyeleri ve Kathryn J Hanson geri besleme ve gelişmeler için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje araştırma hibe SAF2015-64500-ambulans için "gayri resmi" de Economia y Competitividad tarafından verilen Avrupa Bölgesel Kalkınma fonları içerir R ile gerçekleştirilmiştir.

1. fiksasyon ve reçine katıştırma
<ol><li>Sinekler karbondioksit (CO2) ile veya bir buz Bloğu kullanarak hipotermi ile anestezi. Bir diseksiyon mikroskop (ile bütün anında görmek için düşük büyütme) ve makas bacaklar, kanatlar, baş ve karın sabitleştirici penetrasyon kolaylaştırmak için terminal kısmındaki kaldırmak için kullanın. İskelet dikkatli işleme Toraks ve deformasyon önlemek için bu adıma gerek yoktur. Not: düzgün işlenmiş bireyler yordamının sonunda yeterli sayıda sağlamak için genotip başına en az 12 sinekler başlayalım.</li>
	<li>Mürekkep bir 1,5 mL tüp buz (en fazla 6 kişi tüp başına yerleştirerek) içeren 200 µL çözüm 1 aktarın. Not: Mürekkep çözüm 1 den fazla 20 dakika içinde kalamazsınız.<ol>
<li>Bu birim oranlarda bileşenleri için çözüm 1, mix: ¼ %4 paraformaldehyde, ¼ % 8 oxazolidin, ¼ 0.2 M Na2HPO4 ve ¼ 0.2 M NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çözüm 2 200 µL ekleyin ve buz 30 dk için kuluçkaya.<ol>
<li>Çözüm 2: Mix çözüm 1 ve 1:1 (v/v) orantılı OsO4 . Dikkat: OsO4 son derece zehirlidir. Bir duman başlıklı uygun güvenlik ve elden çıkarma tedbirler ile işleyebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm sıvı kaldırın. Çözüm 2 200 µL ekleyin ve 1-2 h için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm çıkarın ve aşağıdaki gibi bir kademeli etanol dizi örnekleri kurutmak: bir kez içinde % 30, % 50, % 70, % 90'ı ve iki kez içinde mutlak etanol; 5 dak. 1 mL etanol örnekleri kapsayacak şekilde ekleyin. Not: doku % 90 etanol yerleştirilir sonra sonraki adım oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Propilen oksit 10 min için iki kez örneklerinde her kuluçka kuluçkaya. Dikkat: Propilen oksit zehirli, duman mahallede kullanın.</li>
	<li>Propilen oksit epoksi reçine ve propilen oksit 1:1 (v/v) karışımı ile değiştirin ve oda sıcaklığında gecede kuluçkaya. Dikkat: Reçine bir sıvı son derece toksik bir durumdadır. Reçine dört bileşeni (A, B, C ve D) kümesi olarak kullanılabilir.<ol>
<li>Epoksi reçine için tek kullanımlık bir ölçek, reçine (A), 44.5 gram sertleştirici 54 g (B), 2.5 g Hızlandırıcı (C) ve Plastifiyan 10 g (D) ekleyin. Bir duman başlıklı reçine parçaları birleştirmek. Reçine aliquots-20 ° c (için 6 aya kadar) veya-80 ° c (birkaç yıl için) saklayın.</li>
		<li>Katı reçine toksik olmadığı için reçine atmak için bu 24 h için 70 ° C'de pişirin. Çözümler OsO izleri içerebileceği için ağır metaller grubuna göre uygun uluslararası prosedürleri, tüm önceki çözümlerinde atmak4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Önceki karışım % 100 reçine ile değiştirin ve örnekleri 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Mürekkep plastik kalıpları yeni reçine (kalıp her iyi bir karkas) içeren aktarın. Bilenmiş tahta sopa veya iğne transfer ve leşleri Wells yönlendirmek ve reçine gecede 70 ° C'de Pasteur fırında polimerize bırakmak için kullanın Not: arka süsleme ve kesit için iskelet uygun yönlendirme sağlamak için mürekkep onların uzun kenarından, karkas kuyu kenarına çok yakın ön kısmı ile yalan.</li>
</ol>2. kırparak ve kütük parçası-in kesit
<ol><li>Polimerli reçine blok kalıpları kaldırın. Jilet uzağa reçine trim, karkas çevreleyen bir yamuk şekli oluşturmak ve uygun yönelim içinde microtome vermek için kullanın. Tüm leşleri benzer sonuçları elde etmek için çapraz dikiş sonra kesit başlatın. Not: Bölüm doğru örnek kırpmaya DLMs hastanın eksenine dik olması gerekir ( şekil 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Şekil 3 . Yetişkin thoraces reçine gömülü miyotonik Distrofi, dorsoventral bölümlerini model sinekler. (A), örnek kırpma görüntü dorsal sağ bölümünde bölümünde kasları için tamamen enine değildi olarak doğru değildi. Sonuç olarak, üç kas demetleri üst sağ tarafında sol tarafında olanlardan daha büyük görünüyor. Bu hata bir tahmindi kas alanı içinde sonuçlanır. (B) düzgün kesilmiş reçine blok bölümünden. Ölçek çubuğu: 200 µm.
<ol><li>Kalın bir ultramicrotome bölümlerle 1,5 µm kesim ve bölümleri su damlaları gelatinized slaytlar aktarın.<ol>
<li>Bölümlere benzer sonuçları elde etmek tüm örnekleri için mesothorax kesiminden elde etmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O buharlaşır kadar 70-80 ° C'de bir Isıtma blokta bölüm içeren slaytlar yerleştirin. Bu noktada, örnekleri ile OsO4 kontrast (şekil 4A) görülebilir.</li>
</ol>3. IFM bölümleri boyama
<ol><li>Bölümleri ile yeterli toluidin yaklaşık 30 için mavi kapak s Isıtma blokta.<ol>
<li>Toluidin blue % 1'i ve boraks H2O. ' % 1'i toluidin blue çözüm için çözmek</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2ile O durulayın ve slaytları su buharlaşır için sıcak bir tabakta bırakın. Kontrast olması gerekiyorsa toluidin ile mavi boyama tekrar (şekil 4B) gelişmiş.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Şekil 4 . Dorsoventral bölümleri farklı kontrast stainings ile yetişkin thoraces reçine gömülü. Her iki panelleri DM1 modeli sinekler Abp1 olduğu gibi şekil 2Bile beslenen görüntülerini göster. (A) bir bölümü OsO4 kontrast görüntüsü. (B) bölümünde toluidin ile mavi lekeli kas demetleri daha iyi görselleştirme sağlar. Ölçek çubuğu: 200 µm.
4. montaj IFM bölümleri
<ol><li>H2O buharlaşır kadar Isıtma blok slaytlarla kuru.</li>
	<li>1 veya 2 damla montaj orta bölümleri ve bir coverslip koydu. Dikkat: Bu adımda bir duman hood montaj orta zehirli olduğundan yürütmek.</li>
</ol>5. resim ve miktar kas alanının edinimi
<ol><li>DLM kaslar tüm kümesi odakta olması düşük büyütme oranında görüntü alabilir. Normalde 10 X kullanın.<ol>
<li>İstatistiksel analiz için sinek başı en az 5 seri fotoğraf çekmek ve deney grubu başına en az 5 sinekler çözümleyebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm kasları (şekil 5A) içeren görüntüyü seçin. Eksen veya bölüm yönünü kontrol ve örnekleri sonuçlarını deforme etmek uygunsuz yönlendirmeyle atın (şekil 3A karşılaştırmak / kötü arasında ayırt etmek için 3B'yi ve iyi yönlendirmeli bölümler, sırasıyla).</li>
	<li>ImageJ yazılım sadece DLMs (şekil 5A/5B) içeren bir alanı (piksel cinsinden) seçmek için kullanın. Farklı deneysel grupları arasında karşılaştırma için kullanılmak üzere başvuru alanı her zaman en büyük kas sinek olacaktır. İçinde tüm görüntüleri karşılaştırmak için farklı genotip, DLMs (şekil 5B) başvuru alanına eşit boyutları içeren alanı seçin.</li>
	<li>Resim-J komut görüntülerle binarize: İşlem/ikili/yapmak ikili ve alanları veya faiz (şekil 5C) kaslarının karşılık gelmeyen piksel silin.<ol>
<li>Komutuyla çizim araçları silmek ve kas dışındaki alanlarda artefactual siyah noktalar görünür durumda, silgi sembolü seçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Şekil 5 . Görüntü analizi prosedürü kas alan tayini için. (A) miyotonik Distrofi tip 1 modeli enine bölümünü Toraks DLM içeren bir dikdörtgen ile uçmak. (B) sadece dolaylı uçuş kasları ve bağırsak (*) ile seçili alanı. (C) Binarized görüntü. Siyah alanlar faiz kaslarının karşılık gelir. Bağırsak kas alan doğru bir miktar için silindi. Ölçek çubuğu: 200 µm.
<ol start="5"><li>Kas dokusu (siyah piksel) toplam komutu ile dışarı karşılık gelen piksel yüzdesi ölçmek: Analiz/ölçüm ve Seç seçeneği alanı kesir. Bir tahmini her sineğin DLM kas kütlesinin alan bu yüzdesidir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+Drosophila+Development.">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium.">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li><li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications.">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+Dystrophy+Type+1.">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li><li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model.">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind,+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li><li>Garc&#237;a-L&#243;pez, A., Llamus&#237;, B., Orz&#225;ez, M., P&#233;rez-Pay&#225;, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models.">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li><li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature.">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223 (2014).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Drosophila melanogaster görünümünü tarafından karakterize miyotonik Dystrophies de dahil olmak üzere insan nöromüsküler hastalıklar7,10,11, çalışmaya uzun bir faydalı model olduğunu kanıtlanmıştır kas atrofisi. Burada sunulan Protokolü başlangıçlı veya sinek modeli belirli bir hastalık progresyon kaynaklanan kas dejenerasyon miktarının için yararlı bir araçtır. Örneğin, takip etmek ve f...

Meyve sineği Toraks işlevsel olarak, fizyolojik ve anatomik olarak ayrı olan uçuş kaslarının iki farklı sınıflar içerir. Bu kaslar: dorso-boyuna (DLM) ve dorso-ventral (DVM) kasları (şekil 1) ve zaman uyumlu uçuş oluşan dolaylı uçuş kasları (IFM), kontrol kas1,2. Bu kaslar birlikte uçmak için gerekli yüksek mekanik gücü oluşturmak. Boyutu, dağıtım ve IFMs rostro Kaudal bırakılmasını enine parça3 (şekil 2A) için kolay bir yönlendirme sağlar. Bu nedenle, biz bu kaslar kas atrofi Drosophila melanogasteriçinde çalışmaya seçtiniz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Şekil 1. Diyagram dolaylı uçuş kasları (IFMs) düzenleme gösterilen meyve sineği Toraks. (Solda) bir lateral görünüm ve (sağ) bir kesit Toraks ve temsil eder. IFMs (kırmızı) Dorso-boyuna (DLM) kasları oluşur ve Dorso-ventral (DVM) (yeşil) kaslar.
Doku yapısı ve histolojik kesitler yönünü dorso-ventral ekseni kontrolünü korunması kas kesit alanı uygun değerlendirme sağlamak için kritiktir. Tomlinson ve ark. değiştiren bir fiksasyon karışımı kullanılan Kas yapısını korumak için 4 . Kaslar iç doku olduğu için Ayrıca, Drosophila' ın ezilecektir sızdırmazlık bir fiksasyon karışımları hedef dokulara nüfuz edemez olarak sorundur. Bu sorunu aşmak için sinek baş, bacaklar, kanatları ve son iki parça girmek fiksasyon karışımı izin delik oluşturmak için karın kaldırıldı. Biz tedavi ile yoğun yağ düzeltmek için onun yetenek nedeniyle kullanılan, Osmiyum tetroxide (OsO4)5, dahil fiksasyon protokolünün parçası olarak trigliserid de dahil olmak üzere. OsO4 çoğu yapıları son derece iyi, özellikle saytolojik düzeyinde korur ve aynı zamanda görüntünün kontrast sağlar. Fiksasyon sonra Drosophila thoraces reçine enine yarı ince parça (1,5 µm) için gömülü. Geliştirilmiş kontrast için doku Ayrıca toluidin ile mavi Boyanabilen. Tam thoraces görüntüleri 10 X alındı ve kas alan görüntüler (boyutlarının eşit) binarizing ve yüzde toplam, ImageJ yazılımı ile dışarı kas dokusu (siyah piksel) karşılık gelen piksel miktarının sayılabilir.
Değişikliklere doku hazırlık ve fiksasyon karışımları, bu protokol için tanıttı OsO4 ve oxazolidin çözüm, konsantrasyon artış olarak üzerinde benzersiz kas dokusunun korunması izin. Bunun nedeni protokol bozulması ve deformasyon bile son derece atrofik koşullarında nöromüsküler dejeneratif hastalıklar gibi miyotonik Distrofi (DM) ile ilişkili posterior analiz örnekleri daha güvenilir hale dokusunun önler. Daha yaygın şekliyle, DM tip 1, genişletilmiş CUG tekrarlar miyotonik Distrofi protein kinaz (DMPK) Tutanaklar içinde tarafından bu nadir genetik bozukluk getirdiği. Mutant DMPK RNA Muscleblind gibi nükleer RNA bağlanıcı proteinler (MBNL1-3; çekilmek formu ribonuclear foci toplar Muscleblind (Mbl) Drosophila)6. Miyotonik Distrofi Drosophila modelinin 250 CTG tekrarlar kas myosin ağır zincir organizatörü (Mhc-Gal4) altında ifade ederek oluşturulan. Modeli sinekler ile tipik 'kanat' up düzenlenen fenotip uçamayan ve ciddi kas atrofi onların IFMs (şekil 2B) vardı. Önceki çalışmalarda bizim laboratuarda gerçekleştirilen IFMs kas alanının belirlenmesi bu modeli sinekler7kas atrofi, farklı kimyasal ve genetik değiştirici etkilerini ölçmek için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir. Örneğin, 250 CTG ifade sinekler C'de kas içinde tekrarlar Mbl izoformu overexpression elde kas alanının bir kurtarma Mbl tükenmesi haciz tarafından DM1 Patogenez8 (şekil 2C) tetikleyici faktör olduğu gibi. Abp1, bir hexapeptit kanıtlanmış anti-DM1 etkinlik9 (şekil 2B) ile DM modeli besleme uçar kas alanı da kurtarıldı.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Şekil 2. Miktar'dorsoventral yetişkin thoraces reçine gömülü bölümlerinden. (A-D) dolaylı uçuş kaslarının Drosophila melanogaster belirtilen ilgili genotip ile. (A) denetim (yw) uçar. (B) ifade CTG kodlamayan 250 tekrarlar kas (UAS-CTG(250)x) bir azalma kas alan DLMs içinde denetim sinekler ile karşılaştırıldığında neden oldu. (C) bu kas atrofi fenotip Muscleblind (MblC) overexpression tarafından kurtarıldı (UAS-CTG (250) UAS MblC x) ve (D) beslenme modeli sinekli hexapeptit Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). Tüm görüntüleri üst dorsal ve takımıdır. Transgenes bir Myosin ağır zinciri organizatörü (Mhc) kullanarak kas için tahrik-Gal4. (E) denetim sinekler göre kas alanının yüzdesi miktar farkları önemli olduğunu doğruladı. Histogram gösterir anlamına gelir ± S.E.M. **p< 0,01 ve * p < 0,05 (Student´s t-Testi). Ölçek çubuğu: 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Rapor burada yöntem kas geliştirme, bakım ve yaşlanma, hastalık patoloji ve kas dokusu endojen ve dış faktörler nasıl yanıt vereceğini hakkında güvenilir bilgi sağlar gibi uyuşturucu testi odaklanarak araştırmacılar için ilgi olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Image-J software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>Bright field technique.</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>World Precision World</td><td>14003</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Embedding molds</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70900</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Extremely toxic.</td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Extremely toxic.</td></tr><tr><td>resin (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Carcinogenic when it is unpolymerized.</td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Mountant Medium (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Dangerous.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Harmful.</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>0.2 M dilution.</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>0.2 M dilution.</td></tr><tr><td>Borax</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>Toxic.</td></tr></tbody></table>

optical cross-sectional muscle area determination of drosophila melanogaster adult indirect flight muscles

İsraf, kas kütlesi kas atrofi bilinen ortak bir fenotip Drosophila modelleri nöromüsküler hastalıklar olduğunu. Biz (IFMs) dolaylı uçuş kaslarının sinekler, özellikle dorso-boyuna kaslar (DLM), ölçü birimi tarafından farklı genetik nedenler atrofik fenotip getirdiği tabi deneysel olarak kullanmışlardır. Bu protokol için biz yarı ince kesit için sinek göğüs kasları katıştırmak, kas ve çevreleyen doku arasında iyi bir kontrast elde etmek ve yarı otomatik ölçülebilir veri edinimi için optik mikroskop görüntüleri işlemek anlatan ve analiz. Biz metodolojik boru hattı üç belirli uygulamaları açıklanmaktadır. İlk olarak, biz yöntemi miyotonik Distrofi sinek manken kas dejenerasyon ölçmek için nasıl uygulanabilir göstermek; İkinci olarak, kas kesit alanı ölçüm teşvik veya kas atrofi ve/veya kas dejenerasyonu önlemek genlerin tanımlamak için yardımcı olabilir; Üçüncü olarak, bu iletişim kuralı bir aday bileşik önemli bir hastalığa neden olan mutasyon bağlı belirli bir atrofik fenotip değiştirmek mümkün olup olmadığını belirlemek için uygulanabilirveya bir çevre tetikleyicisi tarafından.

MblC overexpression veya Abp1 yönetim miyotonik Distrofi sinek modeli atrofik fenotip içinde herhangi bir etkisi vardı olup olmadığını ölçmek için IFMs (şekil 1) parçası olan DLMs üzerinde duruldu. Biz model sinekler, 250 kodlamayan CTG tekrarlar Myosin ağır zincir Düzenleyici (Mhc) tarafından tahrik kas boyunca ifade kararlı-Gal4, kas alan sinekler denetlemek için karşılaştırıldığında % 50 azalma vardı. Buna ek olarak, M...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles at JoVE.com

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi

Biz kas kütlesi Drosophila erişkinlerde belirlemek için dolaylı bir yöntemidir kas alanı ölçmek için bir yöntem raporu. Miyotonik Distrofi hastalığı Drosophila modelinde metodolojimiz dolaylı uçuş analiz tarafından uygulanması kaslar göstermektedir.

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

8.9K Görüntüleme.  University of Valencia. Biz kas kütlesi Drosophila erişkinlerde belirlemek için dolaylı bir yöntemidir kas alanı ölçmek için bir yöntem raporu. Miyotonik Distrofi hastalığı Drosophila modelinde metodolojimiz dolaylı uçuş analiz tarafından uygulanması kaslar göstermektedir.

Video: Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetik

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Gelişim Biyolojisi

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Biyoloji

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Drosophila'da Tek mRNA Moleküllerinin Tespiti ve Miktar Tayini

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

Yazar Spotlight: Drosophila Kas Dokusunda mRNA Mekansal Dağılımının Araştırılması 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Tanımlanmış Bir Motor Nöron için Nöromüsküler Kavşaktaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Drosophila Yetişkin Bacağının Diseksiyonu ve İmmünhistokimyası

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Nörobilim

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Omics Yaklaşımlar için Drosophila melanogaster Uçuş Kasları Diseksiyon

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila

Canlı görüntüleme ve Drosophila embryo kas kasılmaları Analizi

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Tanımlanmış Bir Motor Nöron için Nöromüsküler Kavşaktaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Drosophila Yetişkin Bacağının Diseksiyonu ve İmmünhistokimyası

Drosophila Hazırlama ve Optik Koherens Mikroskobu Kullanımı In Vivo Kalp Fonksiyonu Boyuna Görüntüleme (OCM)