Yazarlar bu protokol üzerinde translasyonel genomik grubunun üyeleri ve Kathryn J Hanson geri besleme ve gelişmeler için teşekkür etmek istiyorum. Bu proje araştırma hibe SAF2015-64500-ambulans için "gayri resmi" de Economia y Competitividad tarafından verilen Avrupa Bölgesel Kalkınma fonları içerir R ile gerçekleştirilmiştir.

1. fiksasyon ve reçine katıştırma
<ol><li>Sinekler karbondioksit (CO2) ile veya bir buz Bloğu kullanarak hipotermi ile anestezi. Bir diseksiyon mikroskop (ile bütün anında görmek için düşük büyütme) ve makas bacaklar, kanatlar, baş ve karın sabitleştirici penetrasyon kolaylaştırmak için terminal kısmındaki kaldırmak için kullanın. İskelet dikkatli işleme Toraks ve deformasyon önlemek için bu adıma gerek yoktur. Not: düzgün işlenmiş bireyler yordamının sonunda yeterli sayıda sağlamak için genotip başına en az 12 sinekler başlayalım.</li>
	<li>Mürekkep bir 1,5 mL tüp buz (en fazla 6 kişi tüp başına yerleştirerek) içeren 200 µL çözüm 1 aktarın. Not: Mürekkep çözüm 1 den fazla 20 dakika içinde kalamazsınız.<ol>
<li>Bu birim oranlarda bileşenleri için çözüm 1, mix: ¼ %4 paraformaldehyde, ¼ % 8 oxazolidin, ¼ 0.2 M Na2HPO4 ve ¼ 0.2 M NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çözüm 2 200 µL ekleyin ve buz 30 dk için kuluçkaya.<ol>
<li>Çözüm 2: Mix çözüm 1 ve 1:1 (v/v) orantılı OsO4 . Dikkat: OsO4 son derece zehirlidir. Bir duman başlıklı uygun güvenlik ve elden çıkarma tedbirler ile işleyebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm sıvı kaldırın. Çözüm 2 200 µL ekleyin ve 1-2 h için buz üzerinde kuluçkaya.</li>
	<li>Çözüm çıkarın ve aşağıdaki gibi bir kademeli etanol dizi örnekleri kurutmak: bir kez içinde % 30, % 50, % 70, % 90'ı ve iki kez içinde mutlak etanol; 5 dak. 1 mL etanol örnekleri kapsayacak şekilde ekleyin. Not: doku % 90 etanol yerleştirilir sonra sonraki adım oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Propilen oksit 10 min için iki kez örneklerinde her kuluçka kuluçkaya. Dikkat: Propilen oksit zehirli, duman mahallede kullanın.</li>
	<li>Propilen oksit epoksi reçine ve propilen oksit 1:1 (v/v) karışımı ile değiştirin ve oda sıcaklığında gecede kuluçkaya. Dikkat: Reçine bir sıvı son derece toksik bir durumdadır. Reçine dört bileşeni (A, B, C ve D) kümesi olarak kullanılabilir.<ol>
<li>Epoksi reçine için tek kullanımlık bir ölçek, reçine (A), 44.5 gram sertleştirici 54 g (B), 2.5 g Hızlandırıcı (C) ve Plastifiyan 10 g (D) ekleyin. Bir duman başlıklı reçine parçaları birleştirmek. Reçine aliquots-20 ° c (için 6 aya kadar) veya-80 ° c (birkaç yıl için) saklayın.</li>
		<li>Katı reçine toksik olmadığı için reçine atmak için bu 24 h için 70 ° C'de pişirin. Çözümler OsO izleri içerebileceği için ağır metaller grubuna göre uygun uluslararası prosedürleri, tüm önceki çözümlerinde atmak4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Önceki karışım % 100 reçine ile değiştirin ve örnekleri 4 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Mürekkep plastik kalıpları yeni reçine (kalıp her iyi bir karkas) içeren aktarın. Bilenmiş tahta sopa veya iğne transfer ve leşleri Wells yönlendirmek ve reçine gecede 70 ° C'de Pasteur fırında polimerize bırakmak için kullanın Not: arka süsleme ve kesit için iskelet uygun yönlendirme sağlamak için mürekkep onların uzun kenarından, karkas kuyu kenarına çok yakın ön kısmı ile yalan.</li>
</ol>2. kırparak ve kütük parçası-in kesit
<ol><li>Polimerli reçine blok kalıpları kaldırın. Jilet uzağa reçine trim, karkas çevreleyen bir yamuk şekli oluşturmak ve uygun yönelim içinde microtome vermek için kullanın. Tüm leşleri benzer sonuçları elde etmek için çapraz dikiş sonra kesit başlatın. Not: Bölüm doğru örnek kırpmaya DLMs hastanın eksenine dik olması gerekir ( şekil 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Şekil 3 . Yetişkin thoraces reçine gömülü miyotonik Distrofi, dorsoventral bölümlerini model sinekler. (A), örnek kırpma görüntü dorsal sağ bölümünde bölümünde kasları için tamamen enine değildi olarak doğru değildi. Sonuç olarak, üç kas demetleri üst sağ tarafında sol tarafında olanlardan daha büyük görünüyor. Bu hata bir tahmindi kas alanı içinde sonuçlanır. (B) düzgün kesilmiş reçine blok bölümünden. Ölçek çubuğu: 200 µm.
<ol><li>Kalın bir ultramicrotome bölümlerle 1,5 µm kesim ve bölümleri su damlaları gelatinized slaytlar aktarın.<ol>
<li>Bölümlere benzer sonuçları elde etmek tüm örnekleri için mesothorax kesiminden elde etmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O buharlaşır kadar 70-80 ° C'de bir Isıtma blokta bölüm içeren slaytlar yerleştirin. Bu noktada, örnekleri ile OsO4 kontrast (şekil 4A) görülebilir.</li>
</ol>3. IFM bölümleri boyama
<ol><li>Bölümleri ile yeterli toluidin yaklaşık 30 için mavi kapak s Isıtma blokta.<ol>
<li>Toluidin blue % 1'i ve boraks H2O. ' % 1'i toluidin blue çözüm için çözmek</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2ile O durulayın ve slaytları su buharlaşır için sıcak bir tabakta bırakın. Kontrast olması gerekiyorsa toluidin ile mavi boyama tekrar (şekil 4B) gelişmiş.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Şekil 4 . Dorsoventral bölümleri farklı kontrast stainings ile yetişkin thoraces reçine gömülü. Her iki panelleri DM1 modeli sinekler Abp1 olduğu gibi şekil 2Bile beslenen görüntülerini göster. (A) bir bölümü OsO4 kontrast görüntüsü. (B) bölümünde toluidin ile mavi lekeli kas demetleri daha iyi görselleştirme sağlar. Ölçek çubuğu: 200 µm.
4. montaj IFM bölümleri
<ol><li>H2O buharlaşır kadar Isıtma blok slaytlarla kuru.</li>
	<li>1 veya 2 damla montaj orta bölümleri ve bir coverslip koydu. Dikkat: Bu adımda bir duman hood montaj orta zehirli olduğundan yürütmek.</li>
</ol>5. resim ve miktar kas alanının edinimi
<ol><li>DLM kaslar tüm kümesi odakta olması düşük büyütme oranında görüntü alabilir. Normalde 10 X kullanın.<ol>
<li>İstatistiksel analiz için sinek başı en az 5 seri fotoğraf çekmek ve deney grubu başına en az 5 sinekler çözümleyebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tüm kasları (şekil 5A) içeren görüntüyü seçin. Eksen veya bölüm yönünü kontrol ve örnekleri sonuçlarını deforme etmek uygunsuz yönlendirmeyle atın (şekil 3A karşılaştırmak / kötü arasında ayırt etmek için 3B'yi ve iyi yönlendirmeli bölümler, sırasıyla).</li>
	<li>ImageJ yazılım sadece DLMs (şekil 5A/5B) içeren bir alanı (piksel cinsinden) seçmek için kullanın. Farklı deneysel grupları arasında karşılaştırma için kullanılmak üzere başvuru alanı her zaman en büyük kas sinek olacaktır. İçinde tüm görüntüleri karşılaştırmak için farklı genotip, DLMs (şekil 5B) başvuru alanına eşit boyutları içeren alanı seçin.</li>
	<li>Resim-J komut görüntülerle binarize: İşlem/ikili/yapmak ikili ve alanları veya faiz (şekil 5C) kaslarının karşılık gelmeyen piksel silin.<ol>
<li>Komutuyla çizim araçları silmek ve kas dışındaki alanlarda artefactual siyah noktalar görünür durumda, silgi sembolü seçin.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Şekil 5 . Görüntü analizi prosedürü kas alan tayini için. (A) miyotonik Distrofi tip 1 modeli enine bölümünü Toraks DLM içeren bir dikdörtgen ile uçmak. (B) sadece dolaylı uçuş kasları ve bağırsak (*) ile seçili alanı. (C) Binarized görüntü. Siyah alanlar faiz kaslarının karşılık gelir. Bağırsak kas alan doğru bir miktar için silindi. Ölçek çubuğu: 200 µm.
<ol start="5"><li>Kas dokusu (siyah piksel) toplam komutu ile dışarı karşılık gelen piksel yüzdesi ölçmek: Analiz/ölçüm ve Seç seçeneği alanı kesir. Bir tahmini her sineğin DLM kas kütlesinin alan bu yüzdesidir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+Drosophila+Development.">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium.">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li><li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications.">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+Dystrophy+Type+1.">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li><li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model.">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind,+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li><li>Garc&#237;a-L&#243;pez, A., Llamus&#237;, B., Orz&#225;ez, M., P&#233;rez-Pay&#225;, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models.">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li><li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature.">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223 (2014).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Drosophila melanogaster görünümünü tarafından karakterize miyotonik Dystrophies de dahil olmak üzere insan nöromüsküler hastalıklar7,10,11, çalışmaya uzun bir faydalı model olduğunu kanıtlanmıştır kas atrofisi. Burada sunulan Protokolü başlangıçlı veya sinek modeli belirli bir hastalık progresyon kaynaklanan kas dejenerasyon miktarının için yararlı bir araçtır. Örneğin, takip etmek ve f...

Meyve sineği Toraks işlevsel olarak, fizyolojik ve anatomik olarak ayrı olan uçuş kaslarının iki farklı sınıflar içerir. Bu kaslar: dorso-boyuna (DLM) ve dorso-ventral (DVM) kasları (şekil 1) ve zaman uyumlu uçuş oluşan dolaylı uçuş kasları (IFM), kontrol kas1,2. Bu kaslar birlikte uçmak için gerekli yüksek mekanik gücü oluşturmak. Boyutu, dağıtım ve IFMs rostro Kaudal bırakılmasını enine parça3 (şekil 2A) için kolay bir yönlendirme sağlar. Bu nedenle, biz bu kaslar kas atrofi Drosophila melanogasteriçinde çalışmaya seçtiniz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Şekil 1. Diyagram dolaylı uçuş kasları (IFMs) düzenleme gösterilen meyve sineği Toraks. (Solda) bir lateral görünüm ve (sağ) bir kesit Toraks ve temsil eder. IFMs (kırmızı) Dorso-boyuna (DLM) kasları oluşur ve Dorso-ventral (DVM) (yeşil) kaslar.
Doku yapısı ve histolojik kesitler yönünü dorso-ventral ekseni kontrolünü korunması kas kesit alanı uygun değerlendirme sağlamak için kritiktir. Tomlinson ve ark. değiştiren bir fiksasyon karışımı kullanılan Kas yapısını korumak için 4 . Kaslar iç doku olduğu için Ayrıca, Drosophila' ın ezilecektir sızdırmazlık bir fiksasyon karışımları hedef dokulara nüfuz edemez olarak sorundur. Bu sorunu aşmak için sinek baş, bacaklar, kanatları ve son iki parça girmek fiksasyon karışımı izin delik oluşturmak için karın kaldırıldı. Biz tedavi ile yoğun yağ düzeltmek için onun yetenek nedeniyle kullanılan, Osmiyum tetroxide (OsO4)5, dahil fiksasyon protokolünün parçası olarak trigliserid de dahil olmak üzere. OsO4 çoğu yapıları son derece iyi, özellikle saytolojik düzeyinde korur ve aynı zamanda görüntünün kontrast sağlar. Fiksasyon sonra Drosophila thoraces reçine enine yarı ince parça (1,5 µm) için gömülü. Geliştirilmiş kontrast için doku Ayrıca toluidin ile mavi Boyanabilen. Tam thoraces görüntüleri 10 X alındı ve kas alan görüntüler (boyutlarının eşit) binarizing ve yüzde toplam, ImageJ yazılımı ile dışarı kas dokusu (siyah piksel) karşılık gelen piksel miktarının sayılabilir.
Değişikliklere doku hazırlık ve fiksasyon karışımları, bu protokol için tanıttı OsO4 ve oxazolidin çözüm, konsantrasyon artış olarak üzerinde benzersiz kas dokusunun korunması izin. Bunun nedeni protokol bozulması ve deformasyon bile son derece atrofik koşullarında nöromüsküler dejeneratif hastalıklar gibi miyotonik Distrofi (DM) ile ilişkili posterior analiz örnekleri daha güvenilir hale dokusunun önler. Daha yaygın şekliyle, DM tip 1, genişletilmiş CUG tekrarlar miyotonik Distrofi protein kinaz (DMPK) Tutanaklar içinde tarafından bu nadir genetik bozukluk getirdiği. Mutant DMPK RNA Muscleblind gibi nükleer RNA bağlanıcı proteinler (MBNL1-3; çekilmek formu ribonuclear foci toplar Muscleblind (Mbl) Drosophila)6. Miyotonik Distrofi Drosophila modelinin 250 CTG tekrarlar kas myosin ağır zincir organizatörü (Mhc-Gal4) altında ifade ederek oluşturulan. Modeli sinekler ile tipik 'kanat' up düzenlenen fenotip uçamayan ve ciddi kas atrofi onların IFMs (şekil 2B) vardı. Önceki çalışmalarda bizim laboratuarda gerçekleştirilen IFMs kas alanının belirlenmesi bu modeli sinekler7kas atrofi, farklı kimyasal ve genetik değiştirici etkilerini ölçmek için güvenilir bir yöntem olduğunu göstermiştir. Örneğin, 250 CTG ifade sinekler C'de kas içinde tekrarlar Mbl izoformu overexpression elde kas alanının bir kurtarma Mbl tükenmesi haciz tarafından DM1 Patogenez8 (şekil 2C) tetikleyici faktör olduğu gibi. Abp1, bir hexapeptit kanıtlanmış anti-DM1 etkinlik9 (şekil 2B) ile DM modeli besleme uçar kas alanı da kurtarıldı.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Şekil 2. Miktar'dorsoventral yetişkin thoraces reçine gömülü bölümlerinden. (A-D) dolaylı uçuş kaslarının Drosophila melanogaster belirtilen ilgili genotip ile. (A) denetim (yw) uçar. (B) ifade CTG kodlamayan 250 tekrarlar kas (UAS-CTG(250)x) bir azalma kas alan DLMs içinde denetim sinekler ile karşılaştırıldığında neden oldu. (C) bu kas atrofi fenotip Muscleblind (MblC) overexpression tarafından kurtarıldı (UAS-CTG (250) UAS MblC x) ve (D) beslenme modeli sinekli hexapeptit Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). Tüm görüntüleri üst dorsal ve takımıdır. Transgenes bir Myosin ağır zinciri organizatörü (Mhc) kullanarak kas için tahrik-Gal4. (E) denetim sinekler göre kas alanının yüzdesi miktar farkları önemli olduğunu doğruladı. Histogram gösterir anlamına gelir ± S.E.M. **p< 0,01 ve * p < 0,05 (Student´s t-Testi). Ölçek çubuğu: 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Rapor burada yöntem kas geliştirme, bakım ve yaşlanma, hastalık patoloji ve kas dokusu endojen ve dış faktörler nasıl yanıt vereceğini hakkında güvenilir bilgi sağlar gibi uyuşturucu testi odaklanarak araştırmacılar için ilgi olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image-J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ6</td>
			<td>Bright field technique.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71970</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision World</td>
			<td>14003</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fluka (Sigma)</td>
			<td>49624</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>0972A</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resin (Durcupan)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44611-44614</td>
			<td>Carcinogenic when it is unpolymerized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>251176</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant Medium (DPX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44581</td>
			<td>Dangerous.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Harmful.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>122507</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>121677</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>3052</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical cross-sectional muscle area determination of drosophila melanogaster adult indirect flight muscles

İsraf, kas kütlesi kas atrofi bilinen ortak bir fenotip Drosophila modelleri nöromüsküler hastalıklar olduğunu. Biz (IFMs) dolaylı uçuş kaslarının sinekler, özellikle dorso-boyuna kaslar (DLM), ölçü birimi tarafından farklı genetik nedenler atrofik fenotip getirdiği tabi deneysel olarak kullanmışlardır. Bu protokol için biz yarı ince kesit için sinek göğüs kasları katıştırmak, kas ve çevreleyen doku arasında iyi bir kontrast elde etmek ve yarı otomatik ölçülebilir veri edinimi için optik mikroskop görüntüleri işlemek anlatan ve analiz. Biz metodolojik boru hattı üç belirli uygulamaları açıklanmaktadır. İlk olarak, biz yöntemi miyotonik Distrofi sinek manken kas dejenerasyon ölçmek için nasıl uygulanabilir göstermek; İkinci olarak, kas kesit alanı ölçüm teşvik veya kas atrofi ve/veya kas dejenerasyonu önlemek genlerin tanımlamak için yardımcı olabilir; Üçüncü olarak, bu iletişim kuralı bir aday bileşik önemli bir hastalığa neden olan mutasyon bağlı belirli bir atrofik fenotip değiştirmek mümkün olup olmadığını belirlemek için uygulanabilirveya bir çevre tetikleyicisi tarafından.

MblC overexpression veya Abp1 yönetim miyotonik Distrofi sinek modeli atrofik fenotip içinde herhangi bir etkisi vardı olup olmadığını ölçmek için IFMs (şekil 1) parçası olan DLMs üzerinde duruldu. Biz model sinekler, 250 kodlamayan CTG tekrarlar Myosin ağır zincir Düzenleyici (Mhc) tarafından tahrik kas boyunca ifade kararlı-Gal4, kas alan sinekler denetlemek için karşılaştırıldığında % 50 azalma vardı. Buna ek olarak, M...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles at JoVE.com

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi

Biz kas kütlesi Drosophila erişkinlerde belirlemek için dolaylı bir yöntemidir kas alanı ölçmek için bir yöntem raporu. Miyotonik Distrofi hastalığı Drosophila modelinde metodolojimiz dolaylı uçuş analiz tarafından uygulanması kaslar göstermektedir.

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

8.9K Görüntüleme.  University of Valencia. Biz kas kütlesi Drosophila erişkinlerde belirlemek için dolaylı bir yöntemidir kas alanı ölçmek için bir yöntem raporu. Miyotonik Distrofi hastalığı Drosophila modelinde metodolojimiz dolaylı uçuş analiz tarafından uygulanması kaslar göstermektedir.

Video: Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Biyoloji

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Drosophila Uçuş sırasında Görme aracılığı Koku Takibi

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

İnsülin Enjeksiyon ve Yetişkin İnsülin Hassasiyet Tedbir hemolimf Ekstraksiyon Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

In ömrü ölçümü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Bir bakımı<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Nüfus Kafes

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Drosophila Melanogaster yetişkin dolaylı uçuş kaslarının optik kesitsel kas alanı belirlenmesi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Drosophila melanogaster Larvaların MSS diseksiyonu

Yetişkin Drosophila melanogaster Locomotion Yüksek Çözünürlüklü Video Takip

Drosophila Uçuş sırasında Görme aracılığı Koku Takibi

Yetişkin gelen Oenocytes diseksiyonu Drosophila melanogaster

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

İzolasyonu Drosophila melanogaster Testisler

İnsülin Enjeksiyon ve Yetişkin İnsülin Hassasiyet Tedbir hemolimf Ekstraksiyon Drosophila melanogaster

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

In ömrü ölçümü

Bir bakımı