Jha laboratuvar onların yararlı tartışma ve Yorumlar için üyeleri teşekkür ediyoruz. S.J. kanser Bilim Enstitüsü of Singapore (R-713-006-014-271), Ulusal Sağlık Ulusal Araştırma Vakfı Singapur ve Singapur Milli Eğitim Bakanlığı, araştırma merkezleri mükemmellik girişimi'nin altında hibe tarafından desteklenmiştir Araştırma Konseyi (CBRG-Zen; BNIG11nov001 ve CS-IRG; R-713-000-162-511), Milli Eğitim Bakanlığı akademik Araştırma Fonu (MOE AcRF Tier 1 T1-2012 Ekim -04). Y.Z., G.S.C. ve C.Y.T. kanser Bilim Enstitüsü Singapur tarafından Singapur Ulusal Üniversitesi layık bir yüksek lisans bursu tarafından desteklendi.

1. hazırlık
<ol><li>MCF10A kültür ortamı hazırlamak: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) / F12 (1:1) % 5 ile ATI serum, 20 ng/mL epitelyal büyüme faktörü, 0,5 mg/mL hidrokortizon, 100 ng/mL kolera toksin ve 10 µg/mL insülin.</li>
	<li>Serum-Alerjik orta hazırlamak: 20 ng/mL epitelyal büyüme faktörü, 0,5 mg/mL hidrokortizon, 100 ng/mL kolera toksin ve 10 µg/mL insülin ile DMEM/F12 (1:1).</li>
	<li>Aşağıdaki siRNA sırasını kullanın: siControl: İleri: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' Ters: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' siTIP60: İleri: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' Ters: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>10 cm hücre kültür yemekleri ve 24-şey tabak kullanın.</li>
</ol>2. geçici TIP60 kullanarak siRNA tükenmesi
<ol><li>Gün 1, aliquot 15 µL transfection reaktif (Örneğin, Lipofectamine RNAiMAX) ve 2 mL serum orta (Örneğin, Opti-MEM) azaltılmış ve bunları sırasıyla her siRNA (10 µM hisse senedi) 10 µL ile karıştırın.</li>
	<li>Karışımı, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>1 x 106 MCF10A hücreleri ile birlikte kültür orta 10 cm tabak içinde 3 mL tohum. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>SiRNA karışımı damla damla 10 cm yemek için ekleyin.</li>
	<li>37 ° C kuluçka makinesi koymadan önce hücreleri eşit dağıtılır sağlamak için çanak sallamak.</li>
	<li>Kuluçka 6 h sonra siRNA içeren Orta 8 mL taze kültür orta ile değiştirin.</li>
	<li>2 günü siRNA karışımları yönteminin hazırlamak ve onları, oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>8 mL 1 gün eklendi kültür ortamının dışarı Aspire edin ve eski yerine koymak o ile 3 mL taze kültür orta.</li>
	<li>SiRNA karışımı ikinci parti yemekleri damla damla ekleyin. Bulaşıkları reaktifleri tam da kuluçka koymadan önce karıştırılır emin olmak için salla.</li>
	<li>6 h sonra siRNA içeren Orta 8 mL taze kültür orta ile değiştirin.</li>
</ol>3. tohum hücreler yara iyileşmesi tahlil için
<ol><li>Günde 3, orta atın ve 2 mL serum fizyolojik (PBS) arabelleği fosfat tamponlu bir kez hücrelerle yıkayın. PBS arabellek atmak.</li>
	<li>SiControl ve siTIP60 tedavi hücreleri plaka 1 mL 1 x tripsin-EDTA arabelleği ekleyerek trypsinize. Kuluçka makinesi 20 dk için geri koydum.</li>
	<li>4 mL tam kültür ortamının her plakasına eklemek, hücreleri pipetting tarafından resuspend ve onları bir 15 mL tüp aktarın.</li>
	<li>5 min için 200 gr, santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
	<li>5 mL serum-Alerjik orta de içeren hücreleri yeniden askıya alma ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.</li>
	<li>Bir hücre süspansiyon olarak 6 x 105 hücre/mL siControl ve siTIP60 için hazırlamak; hücreleri iyi karışık olduğundan emin olun. Hücre süspansiyon 500 µL % 100 confluency emin olmak için bir 24-şey plaka bir şey için ekleyin. 5-6 kuyu her siControl ve siTIP60 için tohum.</li>
	<li>Yavaşça ileri geri plaka ve sonra için bile dağıtım sağlamak için yan sarstı. Dairesel hareketlerle kaçının. Plaka 24 h için kuluçka bırakın.</li>
	<li>TIP60 devirme verimliliğini kontrol etmek için kalan hücreleri hasat. Bunu yapmak için kalan hücre süspansiyon 5 min için 200 gr, santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.</li>
	<li>Ticari bir reaktif kullanarak RNA üreticinin protokolüne yalıtmak ve devirme etkinliğini değerlendirmek için gerçek zamanlı kantitatif PCR için devam edin.</li>
</ol>4. yara oluşturma
<ol><li>Faz kontrast mikroskop altında hücreleri tamamen bağlı emin olmak için denetleyin. Hücreleri mikroskop altında gözlemlemek (4 X, 10 X ve 20 X büyütme) hücreleri tamamen hücrelerinin Konfluent monolayer oluşturmuştur bağlı olduğu sağlamak. Not: siControl hücreleri genellikle daha iyi siTIP60 hücreleri ekleyin. TIP60 tükenmesi hücreleri daha fazla gibi Mezenkimal20yapar çünkü bu bekleniyor. Burada, normal benchtop beyaz ışık faz kontrast mikroskop kullanılır.</li>
	<li>Yara oluşturmak için hafifçe merkezi 200 µL pipet ucu ile iyi arasında düz bir çizgi sıfırdan; oluşturulan yara kuyu çapı aynı uzunluğudur. Tüm kalan kuyular için bu adımı yineleyin. Yeni bir pipet ucu her şey için kullanın.</li>
	<li>Yavaşça kullanarak her de 5 kez serum içermeyen yıkama müstakil hücre kaldırma için orta.</li>
	<li>Her şey için 1 mL serum-Alerjik orta ekleyin ve canlı hücre görüntüleme için devam edin.</li>
</ol>5. Kurulum Canlı hücre görüntüleme
<ol><li>Mikroskobunun açmak ve sıcaklık kontrol en az 1 h canlı oda sıcaklığında 37 ° c ulaştığından emin olmak için görüntüleme hücreli ayarlamadan önce</li>
	<li>Canlı hücre görüntüleme başlamadan önce karbondioksit (CO2) gaz arzı açın. CO2 konsantrasyonu %5 için ayarlayın.</li>
	<li>24-şey plaka mikroskop sahnesinde yerini ve görüntüleme için 10 X büyütme ile objektif lens seçin. Kamera yerine göz mercekleri verilmiş ışığına doğrudan ve yara ve çevresindeki hücreleri bulmak için odağı ayarlayın. Not: Bu durum, faz kontrast ile beyaz ışık kullanıldı.</li>
	<li>Her şey yarada konumunu işaretlemek için bir canlı hücre gözlemci sistemi kullanın. Not: Otomatik sahne canlı hücre görüntüleme sisteminin birden çok pozisyonlarda resim alma sağlar. Görüntüleri bir kez her ara her işaretli konumuna alınır.</li>
	<li>Kadar zaman koşul ayarla: 1s aralığına ve 72 h süresi; Bu ayar göre sistem resimler işaretli her konumda her saat 72 h. herhangi bir istenen zaman aralığını ayarlamak için ve izleme dönemi olacak. Not: Bu hücreler 72 h sonra serum serbest ortamda ölmeye başlayacak çünkü burada, bir süre 72 h en iyisi.</li>
</ol>6. tek hücreli hareketleri izleme
<ol><li>72 h. hem JPEG formatında görüntülerin ve AVI formatında videolar olarak verdikten sonra verileri veri verin. Not: ImageJ yazılım sadece AVI formatında videolar tanıyabilir çünkü bu önemlidir. SiTIP60 ve siControl hücreler arasında farklı hücre geçiş hızları videoda açıkça görülebilmektedir.</li>
	<li>AVI video ImageJ yazılımında açın.</li>
	<li>MTrackJ eklentisi (eklenti-gerekir indirilen ve ayrı ayrı yüklü) açın: Eklentiler > MtrackJ.</li>
	<li>Videodan MtrackJ araç çubuğunda "Ekle" sekmesini tıklatarak seçilen tek hücreler için bir parça ekleyin. İnvaziv ön ucunda bir hücre ve kendi kendine geçirebilirsiniz bir hücreyi seçin (tek hücreli geçiş). Seçilen hücreleri hareketini videoda izleyin ve onları iz MtrackJ kullanarak.</li>
	<li>Araç çubuğundaki "ölçü" sekmesine tıklayarak hareketinin uzaklığı ölçmek. Not: Burada, tek hücreleri, birçok siTIP60 hücreleri tek hücre olarak taşındı, ancak zor tek hücreli hareketi, ölçümü yapma siControl neredeyse hiçbir hücrelerde alındı. Ancak, invaziv cephede yer alan hücreleri hareket hala takip ve siControl ve siTIP60 hücreleri hesaplanan.</li>
	<li>AVI formatında parçaları ile video kaydetmek.</li>
</ol>7. cep geçiş yeteneği miktar
<ol><li>Miktar için 0 h, görüntüler ve görüntüleri, "n" h, ya siTIP60 ya da siControl hücreler yara tamamen kapattığından ne zaman nerede "n" için timepoint anlamına gelir seçin. Not: siTIP60 hücreleri yaralarda neredeyse tamamen kapalı olarak burada, 48 h, seçildi.</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak ImageJ kullanarak yüzde geçişi ölçmek: (0 h - alan "n" h, yara yara alan) / alanına yara 0 h x 100.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM.">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li><li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53.">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li><li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Rvb1/Tip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60/NuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage.">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li><li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+functions+of+TIP60.">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li><li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control:+many+tricks+in+one+HAT.">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li><li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity.">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li><li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction.">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li><li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis.">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li><li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration,+metastasis,+and+patient+survival.">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li><li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response.">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li><li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway.">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes.">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li><li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer.">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li><li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E3+ligase+EDD1/UBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60.">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li><li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-cell+invasion+and+migration:+diversity+and+escape+mechanisms.">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li><li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastasis:+from+dissemination+to+organ-specific+colonization.">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li><li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+steps+of+metastasis:+cell+invasion+and+endothelial+transmigration.">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li><li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition.">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li><li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+scratch+assay:+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro.">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program.">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li><li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration.">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li><li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy.">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Bu hücre geçiş sürecinde, her iki hareket yapisan yaprak şeklinde hücreler olabilir bilinmektedir; gevşek kümeleri; ya da tek, izole hücreler. Modu ve hücre işgalinin dinamik bir şartla diğerine değişebilir ve fenotip saat içinde değiştirebilirsiniz. Geleneksel yara iyileşmesi tahlil anlık görüntü resimleri 12 veya 24 s gibi bir uzun zaman aralığı mikroskopla alınan temel alır. Bu yara kapatma dinamik ve hücre hareketlerin desen yakalamak zorlaştırır.
Öte yandan, live-hücre görüntüleme sistemleri hücre geçiş çok daha kısa bir aralığı (30 dakika veya 1 h) ve el ile çekilen görüntülerde mümkün değil tam olarak aynı konumda izlemek. Sistem otomatik ve araştırmacılar deneyleri sonundaki verilerini vermek yeterlidir. Bu hücre hareket paterni ve gerçek zamanlı olarak yara kapatma sürecini izlemek sağlar. Bu çalışmada, dinamik hücre hareket yakalama, aynı zamanda denetim veya TIP60 tükenmiş hücreler yara kapatma işleminin birleşme deneyleri yara iyileşmesi bir nicel canlı hücre görüntüleme sistemi sağlar. TIP60 tükenmiş hücreleri izole tek hücreler olarak (şekil 3 ve şekil 5) taşındı, ancak canlı hücre görüntüleme sistemi kullanılarak yapılan videodan siControl hücrelerin çoğu yapisan bir levha taşındı.
Hücre çoğalması ve hücre ölümü bir yara iyileşmesi tahlil hücre göç çalışmanın karmaşık. Bu nedenle, yara iyileşmesi tahlil aracı olarak serum serbest hücre çoğalması etkisini en aza indirmek için gerçekleştirilir. Ayrıca, TIP60 nakavt hücre yaşam üzerindeki etkilerini azaltmak için optimize edildi. Ancak, hücre çoğalması ve hücre ölümü yara iyileşmesi deneyleri içinde etkileri ortadan kaldırmak mümkün değildir. Anlık görüntüleri tek yakalama yara kapatma yara kapatma hücre geçiş veya hücre çoğalması nedeniyle olup ayırt etmek imkansız hale belirli bir noktada zaman, olabilir. Canlı hücre görüntüleme hücre göç dinamikleri izler ve tek hücre hareket, araştırmacılar hücre göç hücre çoğalması ve hücre ölümü ayırt etmek için sağlayarak parça. SiControl hücreleri çoğunlukla yaprak şeklinde taşındı iken bu çalışmada, tek hücreli izleme geçiş yolu izole tek hücre siTIP60 durumda ortaya koydu. Canlı hücre görüntüleme sistemi aynı zamanda toplu hücre göç (hücreleri uyumlu bir grup geçirilenYani ) bir artış siControl hücrelere kıyasla siTIP60 hücrelerdeki ele geçirdi. Videolardan MCF10A siTIP60 daha fazla tek hücreli hareketleri ve epitel hücre yaprak siControl (şekil 5) kıyasla daha hızlı geçiş gösterdi.
Bu protokol için kullanılan çeşitli parametreler deneysel hatalarını önlemek için optimize edilmiş olması gerekir. İlk olarak, geçici transfection sonra hücre ölüm sayısı az hücre geçiş üzerindeki etkisini en aza indirmek için % 10 olmalıdır. Bu durumda, TIP60 tükenmesi hücre survival azaltabilir; Bu nedenle, hücre geçiş karmaşık gibi araştırmacılar bu potansiyel fenotip bilmeniz gerekir. Bu sorunu önlemek için araştırmacılar cep telefonu numarasını ve onların hedef gen tüketmek için kullanılan siRNA miktarı optimize etmek. MCF10A için 1 x 106 hücre 20 nM siTIP60 ile yapıldı Bu çalışmada en iyi duruma getirilmiş durumda. İkinci olarak, MCF10A hücreleri kümelenmiş ve saymak zor çoğu kez. Hücre sayımları hataları ilk hücre sayıları önemli bir fark arasında farklı koşulları neden olabilir ve bu yara iyileşmesi deneyleri karıştırıcı bir değişken olabilir. Bu sorunu önlemek için MCF10A hücreler için en az 20 dk. trypsinization durdurmak ve 20 kere kümeleri dağıtmak için ve saymak kolay hale getirmek için yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix Ekle tam büyüme orta trypsinize. Üçüncü olarak, genellikle iyi merkezinde 24-şey plaka numaralı seribaşı sonra hücrelerdir. Hücreleri bile bir dağıtım sağlamak için tohum sonra yeniden askıya alma. Plaka da kuluçka koymadan önce ileri geri ve yan yana sallayın. Dördüncü olarak, TIP60 tükenmesi daha Mezenkimal ve böylece zor eklemek için hücreyi yapar. Bu durumda, plaka da kuluçka makinesine daha uzun bir süre için bırakın. 24 saat sonra hücreleri genellikle eklenir. Hücreleri hala düzgün iliştirilmişse, araştırmacılar hücre tohum için tam büyüme ortamı kullanımı olabilir ve eski yerine koymak o ile orta serum içermeyen hücreleri tamamen eklendiğinde. Bu hücreler genellikle tam orta 12 h sonra eklenir. Beşinci olarak, yara kenarına düzgün olmayabilir. Pürüzsüz kenarlar oluşturmak için tırmalamak hızını artırmak. Altıncı, yara mikroskop kameradan görselleştirmek için çok büyük olabilir. Yara oluşturmak için daha az güç ile 200 µL pipet ipuçlarını kullanın. Alternatif olarak, bir iğne daha küçük bir boşluk oluşturmak için kullanılabilir. Yedinci, tırmalamak sırasında ayrılır bazı hücreler yara nedeniyle yetersiz yıkama için yeniden ekleyebilirsiniz. Wells serum-Alerjik orta yerine PBS ile en az 5 kez yıkayın. Sekizinci, hücreleri birkaç yıkar sonra plaka ayırmak başlayabilir. Ancak, yıkar sayısı müstakil hücreler yara için yeniden atamanız değil da sağlamak için tehlikeye olamaz. Bu durumda, araştırmacılar hücreleri nazikçe 3 kez yıkama ve kuluçka makinesi içinde plaka yıkar geri kalanı için devam etmeden önce sakin hücreleri bildirmek için 1 h en fazla bir süre için bırakın. Dokuzuncu, mikroskop-ebilmek kaybetmek odak ve görüntüleri yarısını deneme bulanık hale gelebilir. Sıcaklık ayarlanan sahne mesafe üzerinde küçük bir etkisi olarak sıcaklık mikroskop çevresinde bir değişiklik neden olabilir. Araştırmacılar mikroskobunun teslim olması gerektiğini ve sıcaklık kontrol en az 1 h kuluçka makinesi hücreleri odaklanmak ayarlamadan önce warmed olduğunu emin olmak için deney başlamadan önce.

Histon ve sigara Histon proteinleri1,2acetylate bir lisin asetiltransferaz HIV Tat etkileşimli protein 60 kDa (TIP60) olduğunu. Fonksiyonları transkripsiyon, DNA-hasar onarım ve Apoptozis1,3,4,5,6, de dahil olmak üzere birden çok sinyal yollar, uygulamaları bulunmaktadır bulundu 7 , 8. Ayrıca, TIP60 kez downregulated kanserleri ve onun downregülasyon kanser metastaz ile ilişkilidir ve zavallı hayatta kalma oranları9,10,11,12, 13,14. Tümör metastazı kanserle ilgili ölüm başlıca nedenidir. Çok adımlı bir işlemdir ve geçiş ve tümör hücreleri işgali bitişik dokularda15,16içine metastaz ilk adım içerir. Bunu yapmak için tümör hücreleri ilk birincil tümör kitle, ya topluca işgal bir hücre levha şeklinde gelen ayırmanız gerekir veya müstakil olarak tek hücreleri17. Bu işlem sırasında tümör hücreleri kez Mezenkimal geçiş (EMT), morfoloji ve hücre yapışma yeteneği17,18değişimler sonuçta epitel tabi.
Birkaç teknik geçiş eğitim için geliştirilmiştir ve vitroişgali yetenek tümör hücreleri. Bunlar arasında en verimli ve ekonomik19yara iyileşmesi tahlil olduğunu. İlk olarak, bu yöntem Konfluent monolayer hücre, böylece hücrelerin göç ve boşluğu kapatmak izin üzerinde yapay bir boşluğu oluşturulmasını içerir. İkinci olarak, görüntüleri eksikliklerin başlangıç ve deneme sonunda yakalanabilir. Son olarak, bir karşılaştırma boşluğu kapatma hücre geçiş hızını belirlemek için kullanılır. Faz kontrast mikroskop genellikle geleneksel yara iyileşmesi deneyleri için görüntüleri yakalamak için kullanılır. Başka bir yara iyileşmesi tahlil vivo içinde tümör hücre göç kısmen benzer avantajdır. Benzer şekilde vivo içinde tümör metastazı için yara iyileşmesi deneyleri hücre göç epitel sayfaları toplu göç ve müstakil tek hücre geçiş gösterir.
Ancak, hücre göç dinamik olarak bilinir ve hücre gerçek zamanlı olarak hareket belgelemek için bir ihtiyaç vardır. Örneğin, geleneksel bir yara iyileşmesi tahlil tek hücreli hareket analiz etmek bir araştırmacı izin vermez. Öte yandan, yara iyileşmesi deneyleri için kültürlü hücreleri çoğu kez hücre çoğalması etkisizleştirmek için serum aç. Bu boşluğu kapatma nedeniyle hücre çoğalması olasılığını ekarte için yapılır. Yine de, hala olacak bazı yayılması ve hücre ölümü ve faz kontrast görüntüler önce ve deneme sonra ikisi arasında ayrım yapamaz.
Canlı hücre görüntüleme tekniği konvansiyonel yara iyileşmesi deneyleri bu sınırlama giderir. Canlı görüntüleme mikroskop kullanarak bir CO2 kuluçka ve uygun sıcaklık kontrolü ile birlikte, araştırmacılar boşluk boyutu ölçebilirsiniz ve aktif olarak göç hareketi izleme hücreleri iken zamanla kapatılması hızını kendi bulunan uçları invaziv açık. Bu nedenle, canlı hücre hücre geçiş izlemek için Imaging uygulanması yalnızca hücre göç daha iyi görselleştirme vermez ama aynı zamanda hücre göç ve Hücre proliferasyonu, böylece bir daha sağlayan ayırt imkanı sağlayacak hücre göç güvenilir analizi.
Bu çalışmada, MCF10A meme epitel hücreleri yara iyileşmesi tahlil ve canlı hücre hücre göç TIP60 rolü eğitim için Imaging göstermek için kullanılmıştır. MCF10A hücreleri artan göç yeteneklerine TIP60 tükenmesi sonuçlanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="874">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">MCF10A cell</td>
			<td style="width:211px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-10317TM</td>
			<td style="width:257px;">Breast epithelial cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">DMEM/F12 media (1:1)</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Epithelial growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:211px;">Peprotech</td>
			<td style="width:119px;">AF-100-15</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cholera Toxin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C-8052</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-0888</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Insulin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I-1882</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">House serum</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">16050-122</td>
			<td>Supplements for MCF10A culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trypsin</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td>For MCF10A detach from plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">267110</td>
			<td>For counting cell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Opti-MEM reduced serum media</td>
			<td style="width:211px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td>For siRNA mixture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">56532</td>
			<td>Transfect reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15596-026</td>
			<td>For mRNA extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-8891</td>
			<td>For cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:211px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">172-5125</td>
			<td>For real time qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">7500 Fast Real Time PCR system</td>
			<td style="width:211px;">Biosystems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Real time qPCR mechine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">10-cm dish</td>
			<td style="width:211px;">Greiner bio-one</td>
			<td style="width:119px;">664160</td>
			<td>For Knockdown experiment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">24-well plate</td>
			<td style="width:211px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td>For wound healing assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siControl siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">siTIP60 siRNA</td>
			<td style="width:211px;">Self designed</td>
			<td style="width:119px;">Self designed</td>
			<td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Live cell observer</td>
			<td style="width:211px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Zeiss inverted Cell Observer for live cell experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-imaging of breast epithelial cell migration after the transient depletion of tip60

Yara iyileşmesi tahlil etkilidir ve bir hücre göç içinde vitroçalışma için en ekonomik yolu. Geleneksel, görüntüleri başlangıç ve faz kontrast mikroskop kullanarak bir deney sonunda alınır ve hücreleri geçiş yeteneklerini yaraların kapatılması tarafından değerlendirilir. Ancak, hücre hareketi dinamik bir olgudur ve geleneksel bir yöntem tek hücreli hareketi izlemek için izin vermez. Geçerli yara iyileşmesi deneyleri artırmak için biz canlı hücre görüntüleme teknikleri hücre göç gerçek zamanlı olarak izlemek için kullanın. Bu yöntem takip sistemi bir hücreyi temel alarak hücre geçiş hızını belirlemek için bize izin verir ve hücre göç ve Hücre proliferasyonu arasında net bir ayrım sağlar. Burada, yara iyileşmesi deneyleri meme epitel hücreleri TIP60 varlığı ile etkiledi farklı geçiş yeteneklerini çalışmaya görüntülemede canlı hücre kullanımını göstermektedir. Hücre hareketliliği son derece dinamik olduğu için bizim yöntem yara yara kapatma yara iyileşmesi deneyleri için kullanılan geleneksel görüntüleme teknikleri ile çekilen fotoğrafını daha iyileşme süreçleri daha fazla ilgili bilgiler sağlar.

Canlı hücre hücre görüntüleme tabanlı geçiş testin genel şeması Şekil 1A bu protokol bir şemadır. MCF10A hücreler tipik epitel Morfoloji gösterdi siControl ile transfected. TIP60 tükenmesi sonra MCF10A hücreleri kontrol hücreleri (şekil 1B) kıyasla daha Mezenkimal.
TIP60 devirme verimliliği incelenmesi Şekil 2 TIP60 devirme verimliliği gösterir. TIP60 ifade düzey siTIP60 tedaviden sonra önemli ölçüde azalmıştır. TIP60 ek olarak, ifade geçirmeyle ilgili birkaç hücre proteinlerin de muayene20edildi. Örneğin, epitel bir işaretleyicidir, epitel adezyon molekülü (EpCAM), ifade, oysa azalma ifadeler fibronektin (FN1) ve SNAIL2 (SNAI2), her iki EMT sürücü olan artış üzerine TIP60 tükenmesi. Bu verileri canlı hücre görüntüleme için kullanılan MCF10A hücre TIP60 seviyelerinde yeterince azaltıldı göstermektedir.
Dinamik hücre göç TIP60 tükenmesi değiştirir Şekil 3 videoları için siControl ve siTIP60 hücreleri alınan gösterir. Videolar için siControl göre siTIP60 daha hızlı bir hücre göç açıkça gösteriyor. Bunun dışında hücre göç siControl ve siTIP60 hücreler arasında dinamik bir fark da (daha fazla tek hücreli hareketi siTIP60 hücrelerde gözlendi, ancak bir levha taşındıYani, siControl hücreleri) gözlenmiştir.
Hücre Migration TIP60 devirme sonra artış Şekil 4 siControl ve siTIP60 hücrelerin hücre göçü miktar gösterir. Geçirilen hücrelerin yüzdesi TIP60 tükenmesi sonra önemli ölçüde arttı.
TIP60 Tükenmesi hücre göç desenini değiştirir. Şekil 5 videoları izleme tek hücreli hareketi gösterir. En siTIP60 hücreleri tek hücre geçiş gösterdi, ancak siControl hücrelerin çoğu hücre çarşaf ve gösterdi sadece iki hücreleri tek hücre göç, parçası olarak topluca göç. Hücre geçiş desen değişimler tükenmiş TIP60 hücrelerle daha Mezenkimal fenotip gösteriyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56248/56248fig1.jpg"> Şekil 1: deneysel genel bakış ve temsilcisi görüntüler. Protokolü'nün(a)şema. (B) temsilcisi görüntüleri MCF10A hücre siControl veya siTIP60 ile transfected. MCF10A hücreleri daha Mezenkimal Morfoloji TIP60 tükenmesi sonra gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56248/56248fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56248/56248fig2.jpg"> Resim 2: TIP60 verimli bir şekilde siTIP60 transfection sonra tükenmiş. Gerçek zamanlı kantitatif PCR TIP60, EpCAM, FN1ve SNAI2ifade düzeyini kontrol etmek için kullanıldı. Toplam RNA üretimi'nın protokol sonrası Trizol reaktif kullanarak izole edildi. her örneğinin toplam RNA'ın 2 µg cDNA yapmak için kullanıldı. Sonuçları kat-değişiklik olarak temsil edilir. Aktin bir iç denetimi olarak kullanıldı. Hata çubuğu en az 3 bağımsız deneyler standart sapma gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56248/56248fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56248/56248fig3.jpg"> Şekil 3: siControl ve siTIP60 hücrelerinin canlı hücre görüntüleme klipleri göstermek farklı desenler hücre hareketinin. Zaman aralığı için 1 h kuruldu ve süresi 72 h için yapıldı. Video Zeiss canlı hücre gözlemci kullanarak çekildi. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56248/Figure_3.zip">Bu video indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56248/56248fig4.jpg"> Şekil 4: miktar hücre geçiş yüzdesi. (A)temsilcisi görüntüleri canlı hücre görüntüleme videolardan elde. 0 h ve 48 h çekilmiş olan fotoğraflar kullanıldı. (B) miktar 48 saat içinde hücre geçiş yüzdesi yapıldı aşağıdaki formülü kullanarak ImageJ yazılımı kullanarak: (0 h - alan "n" h, yara yara alan) / alanına yara 0 h x 100. Hata çubuğu en az üç bağımsız deneyler standart sapma gösterir. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56248/56248fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56248/56248fig5.jpg"> Şekil 5: Live-hücre görüntüleme klipleri göstermek tek hücreli hareket takibi. Renkli çizgiler her izole tek hücrenin göçmen izini göster. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56248/Figure_5.zip">Bu video indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60 at JoVE.com

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Meme epitel hücre göç TIP60 geçici tükenmesi sonra canlı görüntüleme

Burada, hücre göç TIP60 tükenmiş MCF10A meme epitel hücreleri kullanarak bir yara iyileşmesi tahlil gerçek zamanlı izleme mevcut. Canlı hücre görüntüleme teknikleri bizim protokolündeki uygulanması bize analiz ve tek hücreli hareket içinde gerçek zaman ve zaman içinde görmenize olanak sağlar.

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

live-imaging-breast-epithelial-cell-migration-after-transient

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

6.8K Görüntüleme.  National University of Singapore. Burada, hücre göç TIP60 tükenmiş MCF10A meme epitel hücreleri kullanarak bir yara iyileşmesi tahlil gerçek zamanlı izleme mevcut. Canlı hücre görüntüleme teknikleri bizim protokolündeki uygulanması bize analiz ve tek hücreli hareket içinde gerçek zaman ve zaman içinde görmenize olanak sağlar.

Video: Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Kanser Araştırmaları

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast cancer metastasis, and results in poor outcomes with median survival rates of only 4.8 - 15 months. Current rodent models of breast cancer metastasis, including primary tumor cell xenograft and spontaneous tumor models, rarely metastasize to the liver. Intracardiac and intrasplenic injection models do result in liver metastases, however these models can be confounded by concomitant secondary-site metastasis, or by compromised immunity due to removal of the spleen to avoid tumor growth at the injection site. To address the need for improved liver metastasis models, a murine portal vein injection method that delivers tumor cells firstly and directly to the liver was developed. This model delivers tumor cells to the liver without complications of concurrent metastases in other organs or removal of the spleen. The optimized portal vein protocol employs small injection volumes of 5 - 10 &#956;l, &#8805; 32 gauge needles, and hemostatic gauze at the injection site to control for blood loss. The portal vein injection approach in Balb/c female mice using three syngeneic mammary tumor lines of varying metastatic potential was tested; high-metastatic 4T1 cells, moderate-metastatic D2A1 cells, and low-metastatic D2.OR cells. Concentrations of &#8804; 10,000 cells/injection results in a latency of ~ 20 - 40 days for development of liver metastases with the higher metastatic 4T1 and D2A1 lines, and &#62; 55 days for the less aggressive D2.OR line. This model represents an important tool to study breast cancer metastasis to the liver, and may be applicable to other cancers that frequently metastasize to the liver including colorectal and pancreatic adenocarcinomas.

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Embriyonik Zebra balığı İnsan Kanser Hücrelerinin İnvazif Davranış

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move within tissues in a tightly orchestrated manner. During tumor development, this equilibrium is disturbed, and tumor cells leave the epithelium of origin to invade the local microenvironment, to travel to distant sites, and to ultimately form metastatic tumors at distant sites. The dot assay is a simple, two-dimensional unconstrained migration assay, to assess the net movement of cell sheets into a cell-free area, and to analyze parameters of cell migration using time-lapse imaging. Here, the dot assay is demonstrated using a human invasive, lung colony forming breast cancer cell line, MCF10CA1a, to analyze the cells' migratory response to epidermal growth factor (EGF), which is known to increase malignant potential of breast cancer cells and to alter the migratory phenotype of cells.

Cell migration is essential for development, tissue maintenance and repair, and tumorigenesis, and is regulated by growth factors, chemokines, and cytokines. This protocol describes the dot assay, a two-dimensional, unconstrained migration assay to assess the migratory phenotype of attached, cohesive cell sheets in response to microenvironmental cues.

Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

Canlı hücre görüntüleme deneyleri için çalışma Glioblastoma Beyin tümör kök hücre göç ve işgali

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon named apoptosis reversal leads to increased tumorigenicity in various cell models under different stimuli. Previous studies have been focused on tracking this process in vitro and in vivo; however, the isolation of real reversed cells has yet to be achieved, which limits our understanding on the consequences of apoptosis reversal. Here, we take advantage of a Caspase-3/7 Green Detection dye to label cells with activated caspases after apoptotic induction. Cells with positive signals are further sorted out by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for recovery. Morphological examination under confocal microscopy helps confirm the apoptotic status before FACS. An increase in tumorigenicity can often be attributed to the elevation in the percentage of cancer stem cell (CSC)-like cells. Also, given the heterogeneity of breast cancer, identifying the origin of these CSC-like cells would be critical to cancer treatment. Thus, we prepare breast non-stem cancer cells before triggering apoptosis, isolating caspase-activated cells and performing the apoptosis reversal procedure. Flow cytometry analysis reveals that breast CSC-like cells re-appear in the reversed group, indicating breast CSC-like cells are transited from breast non-stem cancer cells during apoptosis reversal. In summary, this protocol includes the isolation of apoptotic breast cancer cells and detection of changes in CSC percentage in reversed cells by flow cytometry.

Here, we present a protocol to isolate apoptotic breast cancer cells by fluorescence-activated cell sorting and further detect the transition of breast non-stem cancer cells to breast cancer stem cell-like cells after apoptosis reversal by flow cytometry.

Apoptozis ters sonra yeni kurulan meme kanser kök hücre benzeri hücre akış sitometrik algılama

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Differentiation of Mouse Breast Epithelial HC11 and EpH4 Cells

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction of differentiation of two mouse breast epithelial cell lines, HC11 and EpH4, and their use to study complementary stages of mammary gland development and neoplastic transformation.
The HC11 mouse breast epithelial cell line originated from the mammary gland of a pregnant Balb/c mouse. It differentiates when grown to confluence attached to a plastic Petri dish surface in medium containing fetal calf serum and Hydrocortisone, Insulin and Prolactin (HIP medium). Under these conditions, HC11 cells produce the milk proteins &#946;-casein and whey acidic protein (WAP), similar to lactating mammary epithelial cells, and form rudimentary mammary gland-like structures termed &#34;domes&#34;.
The EpH4 cell line was derived from spontaneously immortalized mouse mammary gland epithelial cells isolated from a pregnant Balb/c mouse. Unlike HC11, EpH4 cells can fully differentiate into spheroids (also called mammospheres) when cultured under three-dimensional (3D) growth conditions in HIP medium. Cells are trypsinized, suspended in a 20% matrix consisting of a mixture of extracellular matrix proteins produced by Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma cells, plated on top of a layer of concentrated matrix coating a plastic Petri dish or multiwell plate, and covered with a layer of 10% matrix-containing HIP medium. Under these conditions, EpH4 cells form hollow spheroids that exhibit apical-basal polarity, a hollow lumen, and produce &#946;-casein and WAP.
Using these techniques, our results demonstrated that the intensity of the cadherin/Rac signal is critical for the differentiation of HC11 cells. While Rac1 is necessary for differentiation and low levels of activated RacV12 increase differentiation, high RacV12 levels block differentiation while inducing neoplasia. In contrast, EpH4 cells represent an earlier stage in mammary epithelial differentiation, which is inhibited by even low levels of RacV12.

We describe techniques for differentiation induction of two breast epithelial lines, HC11 and EpH4. While both require fetal calf serum, insulin, and prolactin to produce milk proteins, EpH4 cells can fully differentiate into mammospheres in three-dimensional culture. These complementary models are useful for signal transduction studies of differentiation and neoplasia.

Fare Meme Epitel HC11 ve EpH4 Hücrelerinin Farklılaşması

Cadherins play an important role in the regulation of cell differentiation as well as neoplasia. Here we describe the origins and methods of the induction ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

Organoid Kültürü Kullanarak Fare Prostat Epitel Hücrelerinin Ayırt Etme Kapasitesinin Değerlendirilmesi

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary epithelium using transplantation techniques takes advantage of the hormonal environment provided by the adolescent rodent host. These studies are ideally suited to explore the impact of various biological manipulations on mammary gland development and dissect many aspects of mammary gland biology. A common, but limiting, feature is that transplanted epithelial cells are strongly influenced by the surrounding stroma and outcompeted by endogenous epithelium; to utilize native mammary tissue, the abdominal-inguinal white fat pad must be cleared to remove host mammary epithelium prior to the transplantation. A major obstacle when using the rat model organism is that clearing the developing mammary tree in post-weaned rats is not efficient. When transplanted into gland-free fat pads, donor epithelial cells can repopulate the cleared host fat pad and form a functional mammary gland. The interscapular fat pad is an alternative location for these grafts. A major advantage is that it lacks ductal structures yet provides the normal stroma that is necessary to promote epithelial outgrowth and is easily accessible in the rat. Another major advantage of this technique is that it is minimally invasive, because it eliminates the need to cauterize and remove the growing endogenous mammary tree. Additionally, the interscapular fat pad contains a medial blood vessel that can be used to separate sites for grafting. Because the endogenous glands remain intact, this technique can also be used for studies comparing the endogenous mammary gland to the transplanted gland. This paper describes the method of mammary epithelial cell transplantation into the interscapular white fat pad of rats.

This article describes a transplantation method to graft donor rat mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of recipient animals. This method can be used to examine host and/or donor effects on mammary epithelium development and eliminates the need for pre-clearing, thereby extending the usefulness of this technique.

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...