3D organoid sistemi fizyolojik olarak 2D tahlillerden daha alakalı kabul edilir ve biyoloji hakkında değerli bilgiler verebilir. Bu, farmakolojik ve genetik manipülasyonları in vivo yaklaşımdan daha az zaman ve önemli ölçüde daha düşük maliyetle test edebileceğimiz uyarlanabilir bir sistemdir. Matris deneme, oda sıcaklığına ulaştığında katılaşıyor gibi işlemek için çok zor.
Sadece sıvı olduğunda bir pipetten geçirilebilir ve buzüzerinde muhafaza edilmelidir. Halkanın bütünlüğünü korumak önemlidir. Yapı bozulursa, bu organoid büyümeyi olumsuz etkileyebilir ve ortamı değiştirirken kolayca malzeme kaybedebilirsiniz.
Metin protokolünde açıklandığı gibi fare bazal ve luminal prostat epitel hücrelerinin hazırlanması ile bu prosedüre başlayın. Fare organoid medya 500 mikrolitre hücre pelet yıkayın, sonra mikrolitre başına 1.000 hücre yoğunluğunda pelet yeniden askıya. Ana karışımları hazırlamak için, medya% 25 hücreleri ve% 75 matris jel içeren son bir karışım oluşturmak için matris jel ile fare organoid ortamda asılı epitel hücreleri karıştırın.
Downstream uygulamasına bağlı olarak, bazal hücreler genellikle 80 mikrolitrebaşına 100 ila 2, 000 hücre konsantrasyonu ile kaplanırken, luminal hücreler 80 mikrolitrede 2, 000 ila 10, 000 hücre konsantrasyonuyla kaplanır. Her hücre karışımı için, 24-iyi bir plaka iyi başına matris jel 80 mikrolitre ekleyin. Pipet poli-hema kaplama ile doğrudan temas kaçınarak kuyunun duvarın alt yarısı üzerine bir damlacık.
Matris jel ekledikten sonra, matris jel hücre karışımı kuyunun kenarı etrafında bir halka oluşturmak için izin vermek için plaka girdap. Matris jelinkısmen sertleşebilmesi için 24 kuyulu plakayı 37 derecelik bir santigrat, %5 C02 kuluçka makinesine 10 dakika kadar yerleştirin. 10 dakika kuluçkaya yattıktan sonra, matris jelinin tamamen sertlemesine izin vermek için 24 kuyulu plakayı ters çevirin ve 50 dakika daha kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, her kuyunun merkezine önceden ısıtılmış fare organoid medya damla-bilge 350 mikrolitre ekleyin. Ortamı ekledikten sonra, 24 kuyulu plakayı kuvöze geri döndürün. Fare organoid ortamını doldurmak için, 24 kuyulu plakayı 45 derecelik bir açıyla yatırın ve matris jel halkasından kaçınırken P1000 pipetkullanarak mevcut ortamı her kuyunun merkezinden nazikçe çıkarın.
Önceden ısıtılmış fare organoid medya 350 mikrolitre ekleyin. Bu organoidler için beş günden daha uzun süre kültürlü medya daha büyük bir hacim eklemek için önemli besin ve büyüme faktörlerinin hızlı tükenmesini önlemek için tavsiye edilir. Ortamı her birinden ve daha önce kaldırın.
Organoidleri toplamak için, tüm halka yerinden çıkarılıncaya kadar, önceden ısıtılmış dispase içeren bir mililitrelik medyayı doğrudan matris jel halkasının üzerine borulandırarak matris jeli tekrar tekrar patlatın. Yerinden çıkan matris jel organoid karışımını 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Metin protokolünde açıklandığı gibi tam sindirim sonrasında, organoid pelet fosfat tamponlu salin ekleyin ve yavaşça flicking tarafından yeniden askıya.
Organoidleri 800 kez G santrifüj ile oda sıcaklığında beş dakika boyunca peletleyin ve mikro pipet kullanarak süpernatantı çıkarın. 10 mikrolitre paketlenmiş hücre hacminde 100 mikrolitre protein lisis tamponu içinde organoid peletleri yeniden askıya alın. Yeniden askıya almak için flick.
Şimdi, organoidleri ıslak buza tüpler batırarak ve sonik dismembrator'un ucunu mikro-santrifüj tüpünün dışına yavaşça uygulayarak sonik olarak sonikolarak sonikleme. Kurulan protokoller ile Batı lekeleme geçmeden önce 20 kilohertz 40 saniye sonicate. 24-iyi plakalar prostat organoidleri toplamak için, her yanı sıra önce medya kaldırın.
Matris jelini 37 derecelik, %5 CO2 kuluçka makinesinde 30 dakika boyunca 500 mikrolitre dispase içeren ortamla kuluçkaya yatırın. Mikro-santrifüj tüpünde sindirilmiş organoid süspansiyon toplayın. Daha sonra, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 800 kez G santrifüj ile organoidler pelet ve supernatant çıkarın.
Prostat organoidlerinin tam monte immünoresan boyama gerçekleştirmek için, ilk PBS% 4 paraformaldehit 500 mikrolitre ekleyin. Organoidleri oda sıcaklığında hafif çesitli sallayarak iki saat kuluçkaya yatırın. Metin protokolünde açıklandığı gibi pelet yıkadıktan sonra, engelleme çözeltisine mililitre başına bir mikrogram DAPI lekesi ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın.
Bu adımdan kuluçka sırasında numuneyi ışıktan koruyun. Daha önce olduğu gibi organoidlerin santrifüj sonra, bloklama çözeltisi birincil antikor ekleyin ve nazik sallayarak dört derece santigrat gecede kuluçka. Tekrar organoidler pelet, ve nazik sallayarak 15 dakika pbs bir militer ile pelet yıkayın.
Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Sonra engelleme çözeltisi ikincil antikor ekleyin ve nazik sallayarak dört derece santigrat gecede kuluçka. Kuluçkadan sonra, organoidler pelet, ve ek iki kez pelet yıkayın.
PBS'de bir mililitre %30 sakaroz ilave edin % 1 Triton X-100 peletli organoidlere. Sonra hafif sallayarak oda sıcaklığında iki saat kuluçka. Tekrar organoidler peletleme sonra, % 1 Triton X-100 ile PBS% 45 sakaroz bir milimetre ekleyin ve yavaşça oda sıcaklığında iki saat sallayın.
Daha sonra, pbs%60 sakaroz bir mililitre eklemek dışında, prosedürü tekrarlayın 1%Triton X-100. Organoidleri 800 kez G'de oda sıcaklığında üç dakika boyunca santrifüj ile peletleyin ve süpernatantın %95'ini çıkarın. Supernatant çıkarılması sırasında kayıp olmadığını doğrulamak için UV ışığı altında pelet gözlemleyin.
Sakaroz konsantrasyonu arttıkça pelet daha gevşek hale gelir. Kalan süspansiyonun 10 ila 20 mikrolitresini odalı bir kapak kaymasına aktarın ve konfokal mikroskopiye devam edin. Bazal ve luminal hücreler farklı morfolojileri olan organoidler oluştururlar.
Bazal kaynaklı organoidlerin çoğu kültürde yedi gün sonra boyut olarak benzer olmakla birlikte, luminal kaynaklı organoidler önemli heterojenlik sergilerler. Ayrıca, çoğu bazal kaynaklı organoidler çok katmanlı epitel ile çevrili lümenler içerir, luminal kaynaklı organoidler tek katmanlı epitel ile içi boş morfolojide aralığı ise kanalları olmayan hücrelerin çok katmanlı kabloları ile katı. Batı blot analizi, bazal ve luminal kaynaklı organoidlerin bazal ve luminal primer hücrelerle ilişkili özellikleri koruduğunu ortaya koymuştur.
Bazal kaynaklı organoidler bazal marker sitokeratin 5'in daha yüksek düzeylerini ifade ederken, luminal türetilmiş organoidler luminal marker sitokeratin 8'in daha yüksek düzeylerini ifade eder. Hem bazal hem de luminal belirteçler toplu popülasyonda bazal ve luminal türetilmiş organoidlerde saptandı, belki de farklılaşma düşündürücü. Bazal kaynaklı organoidler çok katmanlı epitel içerir, dış tabakalar bazal marker p63 yüksek düzeyde ifade, ve iç katmanları tespit edilemez düzeylere sahip.
Dış tabakalar da luminal marker sitokeratin orta düzeyde ifade 8, ve iç katmanları yüksek düzeyde. Tek katmanlı luminal kaynaklı organoidler tüm hücreler sitokeratin 8 için pozitif leke iken, sadece belirli hücreler nükleer p63 içeriyordu. Matris jeli kullanırken, hücreleri organoid kültüre kaplamadan önce sertleşmediğinden emin olmak için dikkatli olunmalıdır.
Mikroskopiiçin kullanılan DAPI cilt tahrişine neden olabilir. UV ışığı da zararlı olabilir. Yeterli kişisel koruyucu ekipman esastır.
RNA dizilimi yapmak için organoidlerden RNA toplayabiliriz, bu da bize gen ekspresyonu profillerinin organoid oluşumu sırasında veya manipülasyona yanıt olarak nasıl değiştiğini anlatır. Bu model, prostat alanının epitel biyolojisinin temel yönlerini incelemek ve gelişim ve farklılaşmadüzenleyicilerini belirlemek için tekrarlanabilir bir ex vivo tsay'a sahip olmasını sağlamıştır.
