Apoptotik ters hücrelerin gerçek popülasyonlarının izolasyonları daha önce bir sorun olmuştur, bu da apoptosis ters sonuçları hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde sınırlatır. Bu protokol bize apoptotik ters hücrelerin saf popülasyonları oluşturmak için izin verir. Bu tekniğin en büyük avantajı, kullanılan malzeme ve ekipmanların farklı kurumda yaygın olarak bulunmasıdır.
Bu teknik kolayca apoptosis ters uğramıştır hücrelerin saf popülasyonları izole etmek için uygulanabilir. Daha önce bildirildiği gibi, normal hücreler de apoptosis ters geçmesi olabilir, meme kanseri hücreleri dışında, farklı kemo hücreleri, yanı sıra normal hücreler, başlatılabilir ve çeşitli apoptotik uyaranlar kullanılabilir. Ters hücre apoptosis ve hızlı sıralama geçti çünkü, iyileşme oranı genellikle düşüktür.
Daha büyük bir başlangıç hücre numarası son verimi artırmak için rekombinant olduğunu. Başlamak için, kültür MCF-7, MDA-MB-231, başlamak için, kültür MCF-7, MDA-MB-231 ve T47D hücreleri, metin protokolüne göre. Bundan sonra hücreleri Iki kez PBS ile yıkayın, sonra MCF-7'ye yüzde 0.05 tripsin-EDTA yüzde 0.05 tripsin-EDTA iki mililitre ekleyin, ve MDA-MB-231 hücreleri, MCF-7 ve MDA-MB-231 hücreleri, ve t47D hücrelerine yüzde 0.25 tripsin-EDTA yüzde 0.25 tripsin-EDTA iki mililitre.
T47D hücrelerine. Hücreleri 5 dakika boyunca 37 santigrat derecede, %5 karbondioksit hücre kültürü kuluçka makinesinde yetiştirin. Hücreler kuluçkaya yatarken, tripsin-EDTA ile aşırı sindirimi önlemek için hücrelerin bir mikroskopla ayrılmasını kontrol edin.
Hücrelerin yüzde 90'ından fazlası ayırıldığında, tabağa tamamlanmış beş mililitre tamamlanmış RPMI ortamı ekleyin ve hücre katmanı yüzeyinin üzerine birkaç kez pipet ekleyin. Sonra, hücreleri 15 mililitrelik konik tüplere aktarın ve santrifüj. Supernatant atın ve 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerde FACS tampon ile pelet yeniden askıya.
Daha sonra, hücreleri birkaç tüpe bölün. Tüpleri bir kez daha santrifüj edin ve süpernatantatın. Daha sonra, örneklere seyreltilmiş Fc bloğu ekleyin.
Numuneleri tekrar santrifüj etmeden önce, karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, supernatant atın. Daha sonra, insan CD44 karşı florokrom konjuge monoklonal antikorlar ekleyin, ve CD24, insan CD44 karşı, ve CD24, bir ila 40, ve 1-10 seyreltme, sırasıyla, çift boyama gruplarına.
Pozitif kontroller için, olumlu kontroller için CD44 antikorları ekleyin, MDA-MB-231 hücrelerine CD44 antikorları, MDA-MB-231 hücrelerine CD24 antikorları ekleyin ve MCF-7 hücrelerine CD24 antikorları ve MCF-7 hücrelerine CD24 antikorları sırasıyla 40'a kadar ve 1 ila 10 seyreltme ekleyin. PerCP-Cy5.5 Fare IgG2b Kappa, PerCP-Cy5.5 Fare IgG2b Kappa, CD44 antikorları için bir izotop kontrolü olarak hücrelere bir ila 40 oranında seyreltilmiş ekleyin. Sonra, PE Mouse IgG2a Kappa ekleyin, Sonra, PE Mouse IgG2a Kappa ekleyin, CD24 antikorlar için bir izotop kontrolü olarak hücrelere bir ila 10 oranında seyreltilmiş.
Numuneleri karanlıkta 4 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra, örnekleri 300 g's Then'de santrifüj edin, örnekleri 300 g'de santrifüj edin ve dört santigrat dereceyi beş dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve PBS 500 mikro litre pelet iki kez yıkayın.
Daha sonra, daha önce açıklandığı gibi santrifüj tekrarlayın. PBS 0,5 mililitre pelet yeniden askıya ve 40 mikrometre naylon örgü ile süspansiyon filtre. Daha sonra süspansiyonu floresan tarafından aktive edilmiş bir hücre ayırıcısı aracılığıyla çalıştırın.
CD44 negatif hücreleri ve bir mililitre toplama ortamı içeren yuvarlak alt tüplerde CD24 pozitif belirteçleri toplayın. Sonra tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı atın. Daha sonra, daha fazla kültür için taze toplama ortamı içeren bir kültür çanak sıralanmış meme olmayan kök kanser hücreleri plaka.
İlk olarak, DMSO bir millimolar staurosporine kullanın, metin protokolüne göre, orta 2.5 mikro-molar staurosporin hazırlamak için. Ardından, kültür ortamını hücrelerden çıkarın. Bir kez PBS iki mililitre ile hücreleri yıkayın, bundan sonra, MSF-7 hücrelerine altı saat boyunca staurosporin e-mililitre ekleyin, apoptoz neden, hücreler yüzde 70 confluent olduğunda.
Sonra, DMSO bir milimolar paclitaxel hazırlamak. Sonra, 12.5 mikro-litre ekleyin Sonra, 15 mililitre konik tüp 10 mililitre son bir hacim makyaj T47D hücrelerinin tamamlanmış orta 1 milimolar paclitaxel 12,5 mikro-litre ekleyin. Kültür ortamını hücrelerden çıkarın ve hücreleri 2 mililitre PBS ile yıkayın.
Daha sonra, hücreler yüzde 70 kesişme ulaştığında apoptosis neden 10 saat apoptosis indüklemek için 10 saat boyunca hücrelere paclitaxel orta ekleyin. Bundan sonra, solvent le tedavi edilen MCF-7 grubundan ortayı çıkarın ve iki mililitre PBS ile yıkayın. Sonra, 10 mililitre ekleyin 0.25 yüzde DMSO orta Sonra, staurosporine için çözücü kontrolü olarak altı saat boyunca yüzde 0,25 DMSO orta 10 mililitre ekleyin.
Kültür ortamını çözücü olarak işlenmiş T47D grubundan çıkarın ve hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın. Sonra, 0.05 yüzde DMSO orta 10 mililitre ekleyin Sonra, paklele için çözücü kontrolü olarak 10 saat boyunca yüzde 0,05 DMSO orta 10 mililitre ekleyin. Sonra, hücreyi lekeleyin ve %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Tedavi edilen hücrelerin morfolojik değişikliklerini gözlemlemek için 60 kez konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Leke hem apoptotic indükleyici ve solvent tedavi MCF-7 ve T47D hücreleri ve solvent tedavi MCF-7 ve T47D hücreleri karanlıkta 30 dakika boyunca 37 derece santigrat yüzde beş karbondioksit inkübatör. Floresan aktive hücre ayırıcı kullanarak, toplama orta bir mililitre içeren yuvarlak alt tüplerin indükleyici tedavi gruplardan pozitif hücreleri toplamak.
Daha sonra, tüpleri daha önce açıklandığı gibi santrifüj edin ve süpernatant atın. Bir mililitre toplama ortamı ile yuvarlak alt tüplerde solvent ile tedavi edilen gruplardan negatif hücreleri toplayın. Tüpleri santrifüj edin ve süpernatantatın.
Bundan sonra, taze toplama ortamında sıralanmış hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri 12 kuyulu doku kültür plakalarına yerleştirin ve apoptoz ters ilerliği için yedi gün boyunca kültür. Yüzde 0.05 tripsin-EDTA ile hem indükleyici hem de solvent le tedavi edilen gruplarda ters MCF-7 hasat edin.
yüzde 0.05 tripsin-EDTA ile. Daha sonra, her iki indükleyici t47D hücreleri hasat Sonra, hem indükleyici hem de solvent tedavi gruplarda T47D hücreleri hasat 0.25 yüzde tripsin-EDTA. Hücreleri insan CD44 ve CD24'e karşı florokrom konjuge monoklonal antikorlarla lekelendirin.
Hücreler leke iken, daha önce gösterildiği gibi isotip kontrolleri hazırlamak. Son olarak, hücreleri akış sitometresi üzerinde çalıştırın ve CD44 pozitif ve CD24 negatif belirteçleri olan hücrelerin yüzdesini algıla. Bu protokolde, meme kök dışı kanser hücrelerinden meme CSC benzeri hücrelere geçiş gözlenmiştir.
Kök olmayan kanser hücrelerinin izolasyonu ilk olarak MCF-7 hücrelerinde yapıldı. Apoptotik indükleyiciler eklendikten sonra tipik morfolojik değişiklikler gözlendi ve ilaç çekilmesi nden sonra benzer morfolojisi olan apoptozdan kurtarılan hücreler. Kaart aktive edilmiş hücreler, caspace aktivasyonu olmayan hücrelere göre daha yüksek floresan yoğunluğuna göre etiketlendi ve sıralandı.
Apoptotik indüksiyon işlemi sırasında, çözücü, olguprosedürünün veya çözücünün kendisinin geçiş nedeni olduğu ihtimalini dışlamak için kullanıldı. Apoptotik-indükleyici tedavi gruplarındaki kaart-aktive edilmiş hücrelerin neksin beş pozitif ve PI negatif olduğu saptadı ve bu hücreler apoptotik hücreler olduklarını düşündürdü. Apoptotik hücreler, çözücü olarak tedavi edilen gruplarla karşılaştırıldığında, iyileşme künyesinde toplanmış ve kültürlenmiştir, akış sitometrik analizi, cd44 pozitif ve CD24 negatif kadranda ters meme kök dışı kanser hücre popülasyonunda görünen hücreler olduğunu göstermiştir.
Gaging akış analizi ve hücre sıralama önemlidir, yeterli kontrol laboratuarlarda hazırlanmalıdır. Bu in vitro apoptoz ters işlem saf apoptotik kanser hücrelerini izole yana, in vivo tümörigenez varlıkları gibi deneyler hücreleri gerçek ters sonuçlarını anlamak için yapılabilir. Bu teknik kanser nüks nedeni ışık tutuyor, bu nedenle, potansiyel kanser hastalarında tekrar oluşumunu önlemek için araştırılabilir.
Lütfen kurumunuzda ki biyogüvenli seviye düzenlemelerine göre hücre kültürü deneyleri yaparken kendinizi düzgün bir şekilde korumayı unutmayın.
