Name: real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material
Uploaded: 2017-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material at JoVE.com

Eğitim ve cervid PrP bakteriyel ifade plazmid sağlamak için Dr Byron Caughey (NIH kayalık dağ laboratuvarları) için minnettarız. SG Kanada araştırma sandalye program tarafından desteklenir. Genom Kanada, Alberta Prion Araştırma Enstitüsü ve Alberta tarım ve Ormancılık genom Alberta ve University of Calgary Bu eser destek için SG bu araştırma için fon kabul. Bir araştırma hibe hayvan araştırma için Margaret Gunn temelden anıyoruz.

1. kullanarak RT zlı fekal madde <ol><li><ol><li>yapmak cervid dışkı hazırlanması ayıklar fekal homogenate 10 mL olarak dışkı fekal madde 1 g ekleyerek ayıklamak arabellek (20 mM sodyum fosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, % 0.05 ara 20, 1 mM PMSF ve 1 x tamamlamak proteaz inhibitörleri, EDTA içermeyen) bir son konsantrasyonu % 10 (w/v) vermek. Homojenizasyon tampon kullanımı öncesinde hazırlanan ve depolanan -20 ° c</li>
		<li>Homogenize dışkı granül (1 g) ve proteinler için oda sıcaklığında 1 dk. için üretici önceden belirlenmiş bir program ile bir dissociator kullanarak arabellek (10 mL) tüpler (örneğin, gentleMACS M tüpler). 2-3 kez dışkı örnekleri tamamen arabellekte homojenize kadar bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Parafilm tüplerini mühür ve oda sıcaklığında 1 h kuluçka için sallanan bir platform veya rotary shaker üzerine koyun.</li>
		<li>Oda sıcaklığında 5 min için 18.000 x g de tüpler santrifüj kapasitesi.</li>
		Protein içeren supernatants <li>toplamak ayıklar ve aliquot onları içine 1,5 mL tüpler. Aliquots daha fazla uygulamalar için-80 ° C'de depolanan.</li>
	</ol></li> <li>Konsantrasyon PrP Sc dışkı ayıklar Not: böylece tarafından RT zlı, algılama hassasiyeti artırma dışkı ayıklayın örneklerinde CWD Prionlar konsantre için protein yağış adım eklenir iletişim kuralı için.
	<ol><li>NaPTA yağış yöntemi</li> <li>eklemek 250 µL % 10 (w/v) dışkı protein 1 ml N-loril sarcosinate (sarkosyl) hulâsa sarkosyl % 2 (v/v) son bir konsantrasyon vermek.</li>
		<li>Parafilm ile örnekleri içeren ve bir thermomixer 1400 rpm sabit sallayarak altında 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya tüpler mühür.</li>
		<li>Dışkı protein özü ve sarkosyl karışımı ile sodyum phosphotungstic asit ve magnezyum klorür, pH %7,4 0,3 (w/v) sodyum phosphotungstic asit örneklerde son bir konsantrasyon elde etmek için 170 mM (w/v) % 10 içeren bir hisse senedi çözüm ayarlamak.</li>
		<li>Örnekleri için 2 h 37 ° C'de sabit 400 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.</li>
		<li>İçin 15,800 x g., 30 dk çıkarmak supernatants dikkatle örnekleri 14 ° C'de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Granül yıkama yıkama arabellekte resuspending tarafından (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, % 0.5 Triton-X 100, 10 mM EDTA, % 0.5 sodyum deoxycholate (w/v) ve % 0,1 sarkosyl (w/v)).</li>
		<li>İçin 15,800 x g., 15 dk çıkarmak supernatants dikkatle örnekleri 14 ° C'de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Resuspend granül 100 µL (1/10 orijinal hacminin dışkı protein özü) RT zlı seyreltme arabelleği. 
		Not: RT zlı seyreltme arabellek (20 mM sodyum fosfat, pH 6,9, 130 mM NaCl, % 0,1 SDS (w/v) ve 1 X N2 ek) kullanımı önce hazırlanır. 10 mL toplam hacmi bir Ģırınga kullanarak 0.2 µm acrodisc şırınga filtreden filtre ve kadar kullanmak-20 ° C'de depolanan.</li>
		<li>RT zlı tahlil kullanan kadar tedavi NaPTA örnekleri-20 ° C'de depolayın.</li>
	</ol></li> <li>RT zlı tahlil <ol><li>taze 10 mM Th-T stok çözüm (0,032 g Th-t Çift Kişilik distile H 2 O 10 mL) hazırlayın.</li>
		<li>1:10 Th-t çift hisse senedi çözümde distile Th-T 1 mm son bir konsantrasyon 0.2 µm acrodisc şırınga aracılığıyla filtre kullanarak filtre yapmak için H 2 O bir seyreltme olun.</li>
		<li>Buz üzerinde-80 ° C'de depolanan fare rekombinant PrP (rPrP, aa 23-231) substrat (10 µg/mL RT zlı tepki başına) çözme</li>
		<li>RPrP substrat 100 kDa boyutu dışlama filtresi mikrotüpler içine bir anda ve 14.000 x g, santrifüj (bir tüp/filtre ilâ iki kere kullanılabilir) oda sıcaklığında 5 min için yük 500 µL.</li>
		<li>Eluted substrat steril 1,5 mL tüp içine aktarmak ve 4 ° C'de kullanımda kadar devam.</li>
		<li>-20 depolanan çözülme RT-zlı seyreltme arabellek ° C.</li>
		<li>Yapmak dilutions RT zlı içinde tohum (fekal protein özü) seyreltme arabellek: 
		Su katılmamış örnek: su katılmamış dışkı protein özü kullanın 2 x 10 -1 seyreltilmiş 2 x 10 -2 seyreltilmiş 2 x 10 -3 seyreltilmiş</li> <li>hisse senedi çözümleri için RT zlı tepki karışım hazırlamak: fosfat tamponlu tuz () PBS): 5 X NaCl: 2 M Çift Kişilik distile H 2 ' O. hazırlanan NaCl çözeltisi stok 
		EDTA: 100 mM EDTA içinde çift hazırlanan stok çözeltisi distile H 2 O.</li>
		<li>Tüm çözümleri (Adım 1.3.8) kullanımı önce her çözüm ayrı ayrı bir Ģırınga kullanarak 0.2 µm acrodisc şırınga filtreden filtre ve oda sıcaklığında steril tutmak.</li>
		<li>RT zlı tepki karışımı (örnek başına bir tepki 98 µL hacmi ve dört örnek çoğaltır) örnek sayısına göre toplam hacmi yeterli karışım bütün tepkiler var emin olmak için bu birim yüzde 10'u kullanılacak hazır olun.
		RT zlı tepki karışım hazırlamak için <ol><li>kullanımı 15 mL tüp (20 mM sodyum fosfat, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µg/mL rPrP substrat ve Çift Kişilik distile su rPrP son konsantrasyonu tepki olarak ayarlamak için) hisse senedi sol kullanarak utions.</li>
			<li>De bir pipet ile filtre ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetting tarafından tüm çözümler karıştırın. Mümkün olduğu kadar girdap kaçının.</li>
			<li>50 mL tek kullanımlık pipetting rezervuar karışımı dökmek.</li>
			<li>98 µL RT zlı tepki karışımı bir 96-şey optik alt plaka her kuyunun içine yüklemek için bir çok kanallı pipet kullanın.</li>
		</ol></li> <li>Her RT zlı tepki 2 µL, su katılmamış veya 10 kat seri olarak seyreltilmiş dışkı protein özü ekleme. Her örnek içinde dört çoğaltır sınama. 
		Not: her deneyde CWD-negatif ve doğrulanmış CWD-pozitif hayvanların dışkı örnekleri (--dan su katılmamış için 2 x 10 -3 arasında değişen) seri dilutions negatif ve pozitif denetim, sırasıyla kullanılır.</li>
		<li>Bir plaka okuyucu için yinelenen döngüleri 1 min Çift Kişilik yörünge (700 rpm) sallayarak ve 1 dk. kuluçka dinlenme ile 25 h 42 ° C'de kuluçka önce sızdırmazlık bandı ile plaka mühür.</li>
		<li>Tanımla Floresans ölçüm ayarlarını: 
		Uyarma: 450 nm emisyon: 480 nm okumak, alt sayısını basması: 20 el ile kazanç: 1000 (makineye bağlıdır) entegrasyon zaman: 20 µs</li> <li>plaka okuyucu 25 h. sonundaki plaka kaldırmak</li>
		<li>Plaka 3000 x g kuyular arasında potansiyel kirlenmesini önlemek için 3 dakika için de aşağı spin.</li>
		<li>Mühür plaka kaldırmak.</li>
		<li>RT zlı tepki karışımı taze substrat ve taze Floresans içeren 90 µL boya Th-T 1.3.1-1.3.6 bölümünde açıklandığı gibi ekleyerek yeni bir 96-şey tabak hazırlamak.</li>
		<li>De ilk plaka her kuyudan transfer 10 µL yeni hazırlanan 96 plakalı.</li>
		<li>Yeni plaka mühür ve RT zlı tahlil için ek 50 h 1.3.13 adımda anlatılan adımları izleyerek devam edin. Bu ek adım 50 h / toplam reaksiyon süresi 75 h yapacak 
		Not: RT zlı testin tüm prosedürleri altında Biyogüvenlik kabini yapılır.</li>
		<li>Veri toplayabilir.
		<ol><li>Okuma ve belge her şey her 15 dk. Th-T Floresans sinyalinin</li>
			<li>Toplamak veri transferi bir elektronik tabloya ve veri analizi yazılımı quadruplicate tepki ortalamasıyla kullanarak toplam döngüleri.</li>
			<li>Veri Ortalamalar arsa. X ekseni için reaksiyon süresi, RT-zlı (h) karşılık gelen ve y ekseni göreli Floresans birimleri (RFU) karşılık gelir. Her eğrinin bilinen bir örnek bir seyreltme için karşılık gelen.</li>
			<li>Negatif kontrol en yüksek ortalama değerlerini hesaplayarak her deneyde, bir eşik ayıran artı 5 standart sapmalar akım açıklandığı gibi Yayınlanan edebiyat 41. 
			NOT: Tanımlanmış eşiğin geçti bütün çoğaltır pozitif olarak kabul edilir. En az iki dört çoğaltır çapraz, örnek sonra pozitif kabul edilir.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Arıtma rekombinant Prion protein (rPrP) <ol><li>bakteriyel hisse senedi ve ifade rPrP büyüme Not: Escherichia coli (e.coli) zorlanma vektör evde beslenen hayvan-24 kodlama ile dönüştürülmüş Rosetta (DE3) fare PrP (artıkları 23-231) rPrP hazırlamak için kullanıldı.
	<ol><li>Gliserol stokunun buzun üstünde evde beslenen hayvan-24 mPrP(23-231) ile dönüştürülmüş Rosetta (DE3) çözme</li>
		<li>Çizgi LB (Luria Bertani) olarak 50 µg/mL sefaloridin son bir konsantrasyon ile tabaklar ve gecede 37 ° C kuluçka makinesine kuluçkaya. Tabakları baş aşağı nem yoğunlaşma bakteri içeren katı medya önlemek için olduğundan emin olun. Büyüme en az bir iki tabak var emin olmak için iki tabak hazırlayın.</li>
		<li>1 L LB ve basınçlı kap hazırlamak bu steril başaramayacak.</li>
		<li>Özel sayı: 1 L ile 1 mL sefaloridin (50 mg/mL) ve kloramfenikol (34 mg/mL), 1 mL steril LB medya.</li>
		<li>Sefaloridin ve kloramfenikol içeren LB orta 3 mL aşılamak için bir tek kullanımlık aşılama döngü kullanarak her plaka bir koloni seçin.</li>
		<li>Yer bir kuluçka 37 ° C'de sabit 5-6 h. için 225 rpm'de sallayarak ile mini kültürlerde</li>
		<li>Mini-kültürler LB medya ile birlikte Autoinduction sistem 1 hızlı indüksiyon protein ifade için orijinal 1 litre geri kalanını ekleyin.</li>
		<li>Yer 2 lt şişeye, veya daha büyük bir kuluçka 37 ° C'de 20-24 h. için 200 devirde sabit sallayarak ile Kültür</li>
		<li>1 L kültür 4 x 250 mL santrifüj tüpler içine split.</li>
		<li>Kültür 3.750 x g oda sıcaklığında 20 dakika için de içeren tüpler aşağı spin.</li>
		<li>Süpernatant atmak ve 50 mL santrifüj tüpleri bakteriyel granül toplamak, sonra bunları daha fazla işleme kadar-80 ° C'de dondurmak. Elde edilen granül iyi protein verim için 3-4 g tartılır.</li>
	</ol></li> <li>Dahil vücut hazırlanması <ol><li>donmuş Pelet (3-4 g) kaç dakika 37 ° C'de erimek.</li>
		<li>-80 ° C'de 10 dakika için bir kez daha Pelet donma ve yeniden çözülme. Dondurma ve iki kez daha çözdürme bu adımı yineleyin.</li>
		<li>Resuspend bakteriyel Pelet 1 X lizis reaktif (örneğin BugBuster Master Mix) tarafından iyice pipetting. 5 mL reaktif bakteriyel Pelet 1 g için kullanın. Tamamen homojenize mix emin olun.</li>
		<li>Homogenate bir rock'çı, oda sıcaklığında 20 dakika için üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Homogenate 16.000 x g için oda sıcaklığında 20 dk, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde kapalı dökme tarafından supernatants atmak</li>
		<li>Granül 1 önceki adımda kullanılan lizis reaktif X aynı birimdeki homojenize.</li>
		<li>Homogenate 15 dakika oda sıcaklığında bir rocker üzerinde kuluçkaya.</li>
		<li>Eklemek yeterli hacim 1:10 (0.1 x) lizis reaktif 40 mL toplam homogenate hacmi elde etmek için. Karıştırmak yanında inversiyon de homojenize emin olmak için.</li>
		<li>Homogenate 7,900 x g 15dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>Dikkatle onu dökme tarafından süpernatant atmak</li>
		<li>Pelet 40 ml 0.1 x lizis reaktif resuspend.</li>
		<li>Homogenate 16.000 x g 15dk için de 4'te santrifüj kapasitesi ° C.</li>
		<li>Süpernatant dikkatle bu dökerek atmak ve başka işleme kadar dahil organları-20 ° C'de içeren Pelet depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Protein arıtma <ol><li>dahil cesetleri oda sıcaklığında erimek.</li>
		<li>Dağıtılması çözdürülen dahil cesetleri 14 ml 8 M guanidin-HCL (38 g guanidin hidroklorür 0.1 M NaPO 4 pH 8.0 ve dolgu ile H 2 O 50 ml; süspansiyon, nihai çözüm pH ayarlama değil) proteinler solubilize için.</li>
		<li>De yukarı ve aşağı pipetting homojenize emin olun.</li>
		<li>Incubate lysate bir rock'çı, oda sıcaklığında 50 dakika süreyle üzerinde</li>
		<li>Hazırlamak 18 g Ni-NTA reçine (18 g için 3-4 g bakteriyel pelet) boncuk; 100 mL vakum ve 100 mL 0,22 µm şişe en iyi filtre kullanarak su ile yıka.
		<ol><li>Ni-NTA reçine boncuk 18 g 50 mL tüp içinde yerleştirin ve son hacim yapmak için arabellek (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidin hidroklorür, pH 8) denaturing, yeterli hacim katmak ilâ 50 mL.</li>
			<li>Boncuk oda sıcaklığında bir rocker üzerinde 50 dk denaturing tampon equilibrate.</li>
		</ol></li> <li>Lysate 16.000 x g çözünmez enkaz kaldırmak 5 min için de eklenmesi vücut santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dengelenmiş boncuk ekleyin ve granül atın.</li>
		<li>Bir rock'çı protein bağlayıcı Ni-NTA reçine için izin vermek için oda sıcaklığında 40 min için mix giy. 
		Not: Nikel chelate boncuk, nikel benzeşimi tarafından PrP arındırmak için kullanılır. PrP histidin zengini N-terminal bölgesi benzeşimi için nikel iyonları onun herhangi bir etiketi olmadan bağlamak protein sağlar nickel(II) işler.</li>
		<li>Su ile yıkama her iki çizgileri (A ve B) temizlemek için FPLC.</li>
		<li>Denaturing arabellek (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M guanidin hidroklorür, pH 8) her iki hatları (A ve B) (sütun henüz eklenir.) sistem Prime üzerinden çalıştırmak</li>
		<li>Reçine sütuna yerleştirin. Hava kabarcıkları en aza indirmek emin olun.</li>
		<li>İçin FPLC sütun eklemek ve arabellek denaturing % 0 ve %100 yanında belgili tanımlık son arabellek refolding için arabellek A denaturing % 100 ve % 0 refolding arabelleği B (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, pH 8.0) başta doğrusal gradyan çalıştırın. Bu kademeli değişim 0.75 mL/dak 240 min için akış hızında çalıştırmak ve uygun PrP katlama için gereklidir. 
		Not: Kromatografik arıtma işlemi sırasında denatüre PrP ilk yavaş yavaş bağlı denaturing tampon yerine refolding arabelleği doğrusal gradyan uygulayarak refolded. Bu adım, aynı zamanda chaotropic guanidin-HCl kaldırır.</li>
		<li>% 100 refolding arabellek sütunu için 0.75 mL/dak., ek bir 30 dk boyunca akmaya devam ediyor emin olun</li>
		<li>Durulama hat A elüsyon arabellek (100 mM sodyum fosfat, 10 mM Tris, 500 mM imidazole, pH 5,8) tarafından takip su ile sütun yan yol. Bu şimdi elüsyon arabellek tarafından AKTA sistemdeki yerini almıştır denaturing tampon temizlemek.</li>
		<li>Elute protein tampon B ve %0 elüsyon tampon A ilk 0 tampon ve % 100 elüsyon tampon refolding % refolding % 100'den 40 min için doğrusal gradyan çalıştırarak 2 mL/dk. 
		Not: PrP imidazole elüsyon arabelleği yüksek yoğunlukta yarışacak &#39; nickel(II) s bağlama. Birincil protein zirve yaklaşık 1/3'ü geçişin yoldan elute başlayacaktır.
		<ol><li>İzle Kromatografik artırmak OD 280 nm için.</li>
		</ol></li> <li>Sadece büyük tepe ortasındaki protein içeren tüpler toplamak. 
		Not: 2 mL eluted kesirler 15 mL tüpler içine toplanır.</li>
		<li>Diyaliz arabellek (10 mM sodyum fosfat, pH 5,8) yaklaşık 1/3 cilt (1 mL) hemen tüplerini içerdiği protein sulandırmak.</li>
		<li>Hemen buz üzerine boruları yerleştirin</li>
		<li>Eluted protein tüplerde bulunan havuz.</li>
		<li>Zavallı diyaliz kaset (moleküler ağırlık kesme 10 kDa) protein.</li>
		<li>Kaset 4 ° C'de 2 h için önceden soğutulmuş diyaliz arabellek (3.6 M) koymak, sonra kasetleri bir taze diyaliz arabelleğe (3.6 M) gece için transfer. Yapmak Diyaliz tampon altında sürekli ajitasyon olduðundan emin.</li>
		<li>Filtre protein diyaliz sonra bir Ģırınga kullanarak 0.2 µm acrodisc şırınga filtreden.</li>
		<li>Bir BCA protein tahlil kit kullanarak protein konsantrasyonu ölçmek.</li>
		<li>Konsantre veya protein konsantrasyonu 0.3 mg/ml ayarlamak gerekirse sulandırmak. 
		Not: SDS-sayfa ve Coomassie boyama mavi saflık onaylayın.</li>
		<li>1 mL aliquots protein microcentrifuge tüplerde yapıp hemen-80 ° C'de RT zlı protokolünde açıklandığı gibi daha fazla kullanmak kadar saklamak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

RT zlı daha önce idrar ve dışkı özleri sözlü olarak enfekte Ak kuyruklu geyik ve katır geyiği 38CWD Prionlar algılamak için istihdam edildi. Bu el yazması gösterilen sistem RT zlı tahlil adapte bir yöntemdir. Ek adımlar algılama ve tahlil CWD Prionlar enfekte hayvanların dışkı malzeme için duyarlılığını artırmak için "klasik" RT zlı tahlil içine dahil edilmiştir.
Algılama dışkı özleri ile düşük duyarlılık bizi RT zlı protokol ...

Prion hastalıkları veya bulaşıcı spongiform Encephalopathy (TSE) insanlarda, bovine spongiform encephalopathy (BSE) içinde sığır, koyun ve keçi ve kronik boşa büyük nörodejeneratif hastalıklar Creutzfeldt - Jakob hastalığı (CJD) dahil olmak üzere çoğu hastalığı (CWD) cervids 1,2. TSE'ler ayırt edici spongiform görünüm ve beyindeki nöronların kaybı ile karakterizedir. "Sadece protein" hipotezi göre Prionlar esas olarak PrPSc (büyük için ' Sc') 3/, ev sahibi olarak kodlanmış hücresel prion protein, PrPCmisfolded izoformu oluşmaktadır. PrPSc PrPC dönüştürme bağlamak ve diğer PrPC molekülleri dönüştürmek için bir çekirdek hareket edebilir ᵦ-yaprak 4,5,6 zenginleştirilmiş bir uyum içine kaynaklanır. Yeni oluşturulan PrPSc moleküllerin daha küçük reaksiyonlar, bulaşıcı çekirdekleri daha yüksek sayıda sonuçlanan bölen bir büyüyen polimer 7,8 içine dahil edilmiştir. PrPSc toplamak için eğilimli ve proteaz 9,10' a kısmen dayanıklıdır.
CWD etkiler vahşi ve çiftlik geyik (Cervus canadensis), katır geyiği (Odocoileus hemionus), Ak kuyruklu geyik (WTD; Odocoileus virginianus), geyik (Alces alces) ve Ren geyiği (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Bu yatay şanzıman cervid etkileşimleri ve çevre sebat infektivite 14,15ile en bulaşıcı deli dana hastalığı kabul edilir. Nerede PrPSc birikimi ve infektivite beyne sınırlı olan diğer prion hastalıkları CWD içinde bunlar da periferik doku ve vücut sıvıları örneğin tükürük, idrar ve dışkı 16,17, bulunur 18.
İmmünhistokimya PrPSc dağıtım ve süngerimsi lezyonlar 19,20algılamak CWD tanısı için altın standart olarak kabul edilir. ELISA ve daha nadir olarak, Batı leke de CWD teşhis için kullanılır. Böylece, geçerli deli dana hastalığı tanı çoğunlukla Prionlar içinde post-mortem doku tespit üzerinde temel alır. Ante-mortem tanı için CWD bademcikler veya recto anal mukoza ilişkili lenfoid doku (RAMALT) biyopsi alarak mevcuttur; Bununla birlikte, bu yordamı invaziv ve hayvanların yakalanması gerekir. Böylece, idrar ve dışkı, gibi kolayca erişilebilir örneklerin kullanımı CWD prion algılama için pratik bir yol olacaktır. Ancak, bu salgılarının liman nispeten Prionlar geçerli tanı yöntemleri algılama sınırın altındaki konsantrasyonları düşük. Sonuç olarak, daha hassas ve yüksek üretilen iş tanı aracı gereklidir. Döngüsel amplifikasyon misfolding protein gibi vitro Dönüşüm Sistemleri (PMCA) 21, tahlil ve gerçek zamanlı dönüşüm (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı tahlil 22,23, tohum amiloid tahlil 24 deli dana dönüştürme işleminin vitro taklit etmek için PrPSc kendi kendine yayılıyor yeteneği yararlanmak ve böylece dakika PrP algılanamaz düzeyleri 25Sc miktarda varlığı yükseltmek için çok güçlü araçlar vardır ,26. RT zlı yöntemi, ancak, β-yapraklık ikincil yapısında zenginleştirilmiş dönüşüm ürün özellikle thioflavin T (Th-T) bağlayabilirsiniz aslında yararlanır. Bu nedenle, rekombinant PrP (rPrP) numaralı seribaşı dönüşüm üzerine Th-T bağlamak ve böylece gerçek zamanlı olarak Th-T (RFU) göreli Floresans birimler zaman içinde ifade Floresans ölçerek tespit edilebilir amiloid liflerinde içine büyür. Bir kez izlenen, RFU göreli tohumlama faaliyetleri ve gecikme faz gibi nicel parametreleri değerlendirmek için kullanılabilir. Gecikme faz sırasında hangi rPrP erken aşamada tepki Th-T Floresans algılama sınırın altına dönüştürmedir eşik ulaşmak için gereken süreyi (h) temsil eder. Eşlik eden yeterli amiloid çekirdeği (çekirdekleşme/uzama) oluşumuna belirgin gecikme faz sonu Th-T Floresans eşik düzeyini aşıyor ve olumlu olur oluşur. Amiloid liflerinde gerçek zamanlı ve ilk PrPSc veya aşağıdaki örnekte yer alan tohumlama aktivite tespit edilebilir büyüme daha fazla tohum üreten bölümleme tarafından güçlendirilmiş. Bu tohumlar sırayla hızlı üssel faz amiloid fiber büyüme teşvik.
Çünkü bu tahlil 1 düşük tespit edebilmektedir fg PrPSc 24yüksek hassasiyet nitelendirir ante öldükten sonra ya da non-invaziv tanı çeşitli periferik dokulara, salgılarının veya diğer PrPSc tespit ederek elde etmek için bu tekniği numune infektivite seviyesinin düşük yataklık tür. RT zlı kesinlikle avantajları diğer deneyleri tekrarlanabilirlik, pratiklik, hız (az 50 h) ve BİYOANALİZLER için karşılaştırıldığında düşük maliyetleri sağlar. O PMCA içinde kullanılan sonication gibi teknik karmaşıklığı önler; Ayrıca, hangi her şey aerosol bulaşma riskini en aza indirgemek bir bant mühürlü Mikroplaka içinde gerçekleştirilir. Çok iyi biçimi aynı deneyi 96 örnekleri çözümleme sağlar. Tekrarlayan sorunun yanlış pozitif ve rPrP vitro dönüşüm deneyleri içinde spontan dönüşüm karşı bir eşik (cut-off) RT zlı uygulanması çok yararlıdır. Nitekim, negatif kontrol (ortalama RFU negatif örnekler + 5 SD 27) sonuçlarına göre bir temel hangi-ebilmek kılınmak ayrımcılık pozitif ve negatif örnekleri arasında ayarlanır. Dört çoğaltır kullanım örnekleri için böylece çoğaltır en az % 50 olumlu bir sinyal gösterdiğinizde bir örnek pozitif tanımlamak için yardımcı olabilir, Yani çapraz kesme 28. Örneğin bir önceki çalışmada, hamster rPrP insan PrPvCJD homolog substrat kıyasla daha duyarlı bir substrat olmak tohumlari ve koyun büyük tepkiler numaralı seribaşı tespit edildi gibi homoloji arasında tohum ve substrat RT içinde zlı, gerekli değildir 29. hamster-koyun chimeric rPrP da insan varyant CJD Prionlar 30algılamak için insan rPrP daha daha iyi uygun bir substrat olmasını önerdi. Böylece, farklı türlerden rPrP yüzeylerde kullanımı bu tahlil çok yaygındır. Bu tahlil sporadik CJD 31,32,33, gen gibi birkaç prion hastalıkları için başarıyla uygulandıETIC prion hastalıkları 34, BSE 35,36,37, büyük 23,36ve CWD 38,39,40,41, 42. RT zlı içinde tohum PrPSc 38,39,40,41, tespit etmek için tüm başarılı olduğu gibi çalışmalar kullanarak beyin omurilik sıvısı, tam kan, tükürük ve idrar işlenen 42. örneklerinde inhibitörleri Amiloid Dil oluşumu içerebilir kan plazması gibi algılama yeteneği teşvik etmek için Orrú ve ark. (2011) Amiloid Dil oluşumu potansiyel inhibitörleri PrPSc immunoprecipitation (IP) adım ve RT-QuIC tarama ile kaldırmak için bir strateji geliştirdi, tahlil (eQuIC) "QuIC gelişmiş" adında. Buna ek olarak, bir yüzey yedek adım duyarlılığını artırmak için reaksiyon süresi ~ 24 h sonra istihdam edildi. Sonuçta, olarak düşük 1 ag PrPSc eQuIC 30tarafından algılanabilir.
Dışkı özleri arındırmak ve olası tahlil inhibitörleri dışkı çıkarmak için dışkı örnekleri preklinik ve klinik aşamalarında elk deneysel oral enfeksiyon üzerine toplanan deterjanlar ve proteaz inhibitörleri içeren arabellekte homojenize. Dışkı özleri daha fazla protein yağış ile sodyum phosphotungstic asit (NaPTA) yağış kullanan örnekler PrPSc konsantre için farklı yöntemler için sunuldu. Önce Safar vd tarafından açıklanan NaPTA yağış yöntemi 43, PrPSc test örneklerinde konsantre için kullanılır. NaPTA kuluçka PrPCyerine PrPSc tercihli yağış örnek sonuçlarını içeren. Ancak, moleküler mekanizma hala belli değildir. Bu adımı da içeren ve bazı durumlarda görülmektedir rPrP spontan dönüşüm önleme yardım etti. Son olarak, dışkı özleri en iyi duruma getirilmiş RT-fare rPrP (aa 23-231) bir substrat kullanarak ve yüzey yedek iletişim kuralında dahil algılama hassasiyeti artırmak için zlı tarafından test edildi.
Sonuçlar burada geliştirilmiş bu yöntem çok düşük konsantrasyonlarda CWD Prionlar algılayabilir ve algılama ve özgüllük dışkı örneklerinde NaPTA yağmur damlaları ve yüzey yedek olmadan bir iletişim kuralına göre hassasiyeti artar gösterilmektedir. Bu yöntem potansiyel olarak diğer doku ve vücut sıvıları uygulanabilir ve vahşi ve esir cervids CWD gözetimi için büyük kullanım olabilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc seringe filters</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml seringe</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc sealing tapes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablet</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Commercial buffers and solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Standards and commercial kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Autoinduction System 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA protein purification systems FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega microplate reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sofware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MARS Data Analysis</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

Esas numaralı seribaşı misfolding ve rekombinant prion protein (PrP) substrat prion tohum dönüştürme için bir şablon olarak kullanarak toplama göre hassas vitro boş hücre deli dana amplifikasyon tahlil RT zlı tekniğidir. RT zlı gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) benzer bir roman yüksek üretilen iş tekniği kullanıyor. Amiloid Fibriller büyüme tespiti üzerine ᵦ sayfalık zengin proteinler ile spesifik etkileşime fluoresces Thioflavin T boya temel alır. Böylece, Amiloid Dil oluşumu gerçek zamanlı olarak tespit edilebilir. Kronik israf hastalığı (CWD) Prionlar dışkı hulâsa içinde algılamak için bir güvenilir non-invaziv tarama testi geliştirmek çalıştı. Burada, özellikle CWD dışkısı etkinliğinde tohum PrPSc cervids enfekte ortaya çıkarmak için RT zlı tekniği adapte olması. Başlangıçta, hazırladığımız dışkı özleri tohumlama etkinliği RT içinde zlı, nispeten düşük potansiyel tahlil inhibitörleri fekal malzeme nedeniyle oldu. Dışkı özleri tohumlama etkinliğini artırmak ve olası tahlil inhibitörleri kaldırmak için deterjanlar ve proteaz inhibitörleri içeren bir arabellek dışkı örneklerinde homojenize. Biz de örnekleri PrPSc sodyum phosphotungstic asit ve merkezkaç kuvveti kullanan protein yağış temelinde konsantre için farklı yöntemler için gönderilmektedir. Son olarak, dışkı özler tarafından en iyi duruma getirilmiş RT-yüzey yedek algılama hassasiyeti artırmak için iletişim kuralında dahil zlı test edildi. Böylece, bir protokol CWD deli dana önceden klinik ve klinik cervids tarafından RT-non-invaziv CWD tanı için kullanışlı bir araç olabilir zlı, dışkısı etkinliğinde tohum hassas algılanması için kurduk.

%10 (w/v) hazırlanan CWD dışkı özleri RT zlı tepki tohum başardık, henüz algılama hassasiyeti düşük 27oldu. Dışkı homojenizasyon için belirli bir arabellek kullanarak yüksek arka plan Floresans reaksiyonlarda RT zlı eşlik eden kullanmak için fare rPrP substrat, önlemek için önemli bir adımdı yerine daha özel almak için izin geyik rPrP 27sonuç. NaPTA yağış ilavesi rPrP RT-zlı (şekil 1</st...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material at JoVE.com

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Burada, bir basit, hızlı ve verimli prion amplifikasyon tekniği, gerçek zamanlı dönüştürme (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı yöntemi açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K Görüntüleme.  University of Calgary. Burada, bir basit, hızlı ve verimli prion amplifikasyon tekniği, gerçek zamanlı dönüştürme (RT zlı) gökyüzünden kaynaklı yöntemi açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

İntraperitoneal Enfeksiyon sonra Bağışıklık Hücreleri Ticareti Floresan Prion Çubuklar Saat İzlenmesi

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Prionlar protein misfolding Döngüsel Amplifikasyon

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

Bir Kuş Türlerinin Sindirim Sistemi geçtikten sonra Bulaşıcı prions belirlenmesi için prosedürler

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

Bir ile Bulaşıcı Süngerimsi Ensefalopati Türler Engelleri değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Prion Proteini Dönüştürme Deneyi

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Tıp

Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in research laboratories, as well as for molecular diagnosis, because of its sensitivity, specificity, and convenience. However, in most cases, the quantitative PCR (qPCR) assay generally used to detect virus infection has relied on the purification of viral nucleic acid prior to the PCR step. In this study, the fluorescence-based reverse transcription qPCR (RT-qPCR) assay is developed through the combination of a processing buffer and a one-step RT-PCR reagent so that the whole process, from the harvest of the culture supernatant of virus-infected cells until real-time detection, can be performed without viral RNA purification. The established protocol enables the quantification of a wide range of RNA concentrations of dengue virus (DENV) within 90 min. In addition, the adaptability of the direct RT-qPCR assay to the evaluation of an antiviral agent is demonstrated by an in vitro experiment using a previously reported DENV inhibitor, mycophenolic acid (MPA). Moreover, other RNA viruses, including yellow fever virus (YFV), Chikungunya virus (CHIKV), and measles virus (MeV), can be quantified by direct RT-qPCR with the same protocol. Therefore, the direct RT-qPCR assay described in this report is useful for monitoring RNA virus replication in a simple and rapid manner, which will be further developed into a promising platform for a high-throughput screening study and clinical diagnosis.

Real-time quantitative polymerase chain reaction analysis combined with reverse transcription (RT-qPCR) has been widely used to measure the level of RNA virus infections. Here we present a direct RT-qPCR assay, which does not require an RNA purification step, developed for the quantification of several RNA viruses, including dengue virus.

Dang virüs RNA kültür süpernatant gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu tarafından enfekte hücre içinde ölçme

At present, real-time polymerase chain reaction (PCR) technology is an indispensable tool for the detection and quantification of viral genomes in ...

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major zoonotic risk. Here, our objective was to utilize a laboratory protocol to determine the relative copy number of the rabies virus (RABV) genome in different bovine brain anatomical structures using quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). qRT-PCR quantifies the specific number of gene copies present in a sample based on fluorescence emitted after amplification that is directly proportional to the amount of target nucleic acid present in the sample. This method is advantageous owing to its short duration, reduced risk of contamination, and potential to detect viral nucleic acids in different samples more easily compared to other techniques. The brains of six rabid animals were divided into six anatomical structures, namely the Ammon&#8217;s horn, cerebellum, cortex, medulla, pons, and thalamus. All brains were identified as positive for RABV antigens based on a direct immunofluorescence test. The same anatomical structures from the brains of four RABV-negative bovines were also assessed. RNA was extracted from each structure and used for qRT-PCR. An assay was performed to determine the copy numbers of RABV genes using an in vitro transcribed nucleoprotein gene. The standard curve used to quantify viral RNA exhibited an efficiency of 100% and linearity of 0.99. Analysis revealed that the cortex, medulla, and thalamus were the ideal CNS portions for use in RABV detection, based on the observation that these structures possessed the highest levels of RABV. The test specificity was 100%. All samples were positive, no false positives were detected. This method can be used to detect RABV in samples that contain low levels of RABV during diagnosis of BPR.

This protocol presents a qRT-PCR-based approach for determining the rabies virus nucleoprotein (N) gene copy number within various bovine brain anatomical structures using in vitro transcription.

Çeşitli Sığır Beyin Yapılarında Kuduz Virüsünün Nicelliği

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Biyoloji

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

İç Pozitif Kontrol ile Kantitatif Recombinase Polimeraz Amplifikasyon Testi Geliştirme

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

Prion Güvenlik Laboratuvarı Kaydırma Testi

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

Gerçek zamanlı depremin dönüşüm tahlil CWD Prionlar fekal madde olarak algılanması için kaynaklı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler