אנחנו אסירי תודה ד ר ביירון Caughey (NIH מעבדות הר סלעי) עבור מספקים את פלסמיד חיידקי הביטוי PrP cervid והדרכה. SG נתמך על-ידי התוכנית קנדה מחקר הכיסא. אנו להכיר מימון למחקר זה ס ג מן הגנום קנדה, אלברטה פריון מכון מחקר, אלברטה לחקלאות ויערנות דרך הגנום אלברטה, מאוניברסיטת קלגרי לתמיכה עבודה זו. אנו להכיר במענק מחקר של הקרן גאן מרגרט לחקר בעלי חיים.

המחברים אין לחשוף.

RT-מהר קודם לכן הועסק לזהות CWD prions שתן ותמציות צואה של אייל פרדי לבן זנב, אייל פרדי שחור זנב דרך הפה הנגוע 38. מערכת שמוצג בכתב היד היא שיטה מותאם וזמינותו RT-מהר. צעדים נוספים אוחדו וזמינותו RT-מהר "הקלאסי" כדי לשפר את זיהוי ואת הרגישות של וזמינותו עבור CWD prions בחומר צואה של חיות נגועו?...

פריון מחלות או מדבקות spongiform encephalopathies (TSE) הן הפרעות ניווניות כולל מחלת קרויצפלד - יעקב (מחלת קרויצפלד-. יעקב) בבני אדם, ספגת המוח (BSE), בקר, scrapie כבשים, עיזים, ואת מבזבז כרונית המחלה (CWD) cervids 1,2. TSEs מאופיינים במראה ייחודי spongiform ואובדן של נוירונים במוח. על-פי ההנחה "חלבון בלבד", prions מורכבים בעיקר PrPSc ('Sc' עבור scrapie) 3, isoform misfolded החלבון מקודד מארח את הסלולר פריון, PrPC. PrPSc נובעת ההמרה של PrPC לתוך קונפורמציה מועשר בגליונות ᵦ 4,5,6 אשר יכול לשמש זרע לאגד, להמיר מולקולות אחרות PrPC . מולקולות PrPSc החדש שנוצר משולבים גדל פולימר 7,8 אשר פורץ oligomers קטנים יותר, וכתוצאה מכך מספר גבוה יותר של גרעינים זיהומיות. PrPSc נוטה צבירת והיא עמידה חלקית פרוטאזות 9,10.
CWD משפיע על אייל מעובדים הפראית (Cervus קנדית), אייל פרדי שחור זנב (האייל hemionus), אייל פרדי לבן זנב (WTD; האייל virginianus), מוס (Alces alces), איילים (Rangifer tarandus ב tarandus ב) 11,12,13. היא נחשבת למחלה מדבקת ביותר פריון עם העברה אופקית המועדף על ידי אינטראקציות cervid והתמדה סביבתי של 14,infectivity15. שלא כמו מחלות אחרות פריון איפה PrPSc הצטברות ו infectivity מרותקים אל המוח, ב- CWD אלה מצויים גם רקמות היקפיים של נוזלי הגוף למשל רוק, שתן, צואה 16,17, 18.
אימונוהיסטוכימיה נחשב תקן הזהב לאבחון CWD לזהות PrPSc הפצה ו- spongiform נגעים 19,20. אליסה במקרים נדירים יותר, תספיג המשמשות גם עבור אבחון CWD. לכן, אבחון מחלת פריון הנוכחי מתבסס בעיקר על זיהוי prions ברקמות פוסט-מורטם. המוות. אבחנה CWD זמין על ידי לקיחת השקדים או ביופסיות recto-אנאלי רירית הקשורים רקמת הלימפה (RAMALT); עם זאת, הליך זה הוא פולשני ודורש לכידתו של בעלי החיים. לפיכך, השימוש של דגימות נגיש בקלות, כגון שתן וצואה, תהיה דרך מעשית לזיהוי פריון CWD. עם זאת, הנמל הפרשות האלה נמוך יחסית ריכוזי prions מתחת לגבול זיהוי של שיטות אבחון הנוכחי. כתוצאה מכך, נדרש יותר רגיש וגבוה תפוקה של כלי אבחון. במבחנה המרת מערכות, כגון חלבון misfolding הגברה מחזורית assay (PMCA) 21, עמילואיד זריעה assay, בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר) assay 22,23, 24 הם כלי רב עוצמה כדי לנצל היכולת שמתרבה של PrPSc לחקות במבחנה את תהליך ההמרה של פריון, ובכך להגביר את הנוכחות של כמויות זעירות של PrPSc לרמות לזיהוי 25 ,26. שיטת RT-מהר, עם זאת, מנצל העובדה כי המוצר ההמרה מועשר בβ-גיליון מבנה שניוני באפשרותך לאגוד במיוחד thioflavin T (ה-T). לכן, PrP רקומביננטי (rPrP) בעת הזריעה ההמרה גדל לתוך הסיבים עמילואיד אשר לאגד את ה-T, לכן ניתן להבחין בזמן אמת באמצעות מדידה של זריחה של ה-T לבטא יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (RFU) לאורך זמן. ברגע תחת פיקוח, RFU יכול לשמש כדי להעריך היחסי זריעה, ופעילויות פרמטרים כמותיים כגון שלב ההשהיה. השלב לג מייצג את הזמן (h) הנדרש כדי להגיע לסף, במהלך rPrP אשר המרה בשלב מוקדם של התגובה הוא מתחת לגבול זיהוי של ה-T זריחה. בסוף שלב ההשהיה לכאורה, והמצוות להיווצרות של גרעין עמילואיד מספיקות (התגרענות/התארכות), מתרחש כאשר קרינה פלואורסצנטית ה-T חורג רמת הסף הופך להיות חיובי. הצמיחה של עמילואיד הסיבים יכול להתגלות בזמן אמת, PrP הראשוניתSc או זריעה פעילות הכלולים במדגם מוגבר על ידי פילוח אשר מפיק יותר זרעים. זרעים אלה לגרום בתורו שלב מעריכי מהירה של סיבי עמילואיד צמיחה.
כי זה וזמינותו הוא מסוגל לזהות המתחילים 1 fg PrPSc 24, רגישות גבוהה מסמיך בטכניקה זו כדי להשיג את ההימור המוות או אבחון פולשני על ידי גילוי PrPSc שונים רקמות היקפיים, הפרשות או השני סוגים של הדגימה מחסה רמות נמוכות של infectivity. RT-מהר בהחלט מספק יתרונות אחרים מבחני שלו הפארמצבטית, פרקטיות, במהירות (פחות מ- 50 h), עלויות נמוכות בהשוואה bioassays. זה מונע את המורכבות הטכנית כגון sonication בשימוש PMCA; בנוסף, זה מתבצע ב- microplate הקלטת אטום אשר ממזער את הסיכון של זיהום תרסיס של כל טוב. התבנית מרובת טוב המאפשרת הניתוח של דוגמאות עד 96 אותו ניסוי. כדי לסתור את הבעיה חוזרים ונשנים של תוצאות חיוביות שגויות והמרה ספונטנית של rPrP ב מבחני הגיור במבחנה המימוש של סף (ניתוק) ב- RT-מהר הוא מאוד שימושי. אכן, על סמך התוצאות של הפקד שלילי (ממוצע RFU של דגימות שליליות +5 SD 27), תוכנית בסיסית מוגדר שממנו ניתן לעשות אפליה בין דוגמאות חיוביות ושליליות. השימוש של משכפל 4 עבור כל דגימה כך יכול לסייע להגדרת מדגם חיוביים כאשר לפחות 50% של משכפל הצג סימן חיובי, כלומר לחצות את ניתוק 28. הומולוגיה בין הזרע לבין המצע לא נדרש ב- RT-מהר, כמו למשל במחקר הקודם, אוגר rPrP נמצאה להיות מצע רגיש יותר בהשוואה המצע הומולוגי ב PrP האנושיvCJD נזרע הצאן scrapie נזרע תגובות 29. rPrP chimeric אוגר-כבשים הוצעה גם להיות מצע מתאים היטב יותר מאשר rPrP האנושית לזהות האנושית variant מחלת קרויצפלד-יעקב prions 30. לפיכך, השימוש rPrP סובסטרטים של מינים שונים נפוץ מאוד בזה וזמינותו. Assay זו הוחלה בהצלחה מספר מחלות פריון, כמו "טפטוף" מחלת קרויצפלד-יעקב 31,32,33, מהדור השניפריון etic מחלות 34, BSE 35,36,37, scrapie 23,36, CWD 38,39,40,41, 42. מחקרים באמצעות עיבוד נוזל מוחי שדרתי, דם, רוק, שתן כמו זרעים ב RT-מהר היו כולן מוצלחות כדי לזהות PrPSc 38,39,40,41, 42. לטפח את יכולת זיהוי בדגימות כמו פלזמה שעשויים להכיל מעכבי היווצרות עמילואיד, Orrú et al. (2011) פיתחה אסטרטגיה כדי להסיר מעכבי פוטנציאל היווצרות עמילואיד בסירוק שלב immunoprecipitation (IP) PrPSc ו- RT-QuIC, בשם assay "משופרת QuIC" (eQuIC). בנוסף, צעד החלפת המצע הועסק לאחר ~ 24 שעות של זמן התגובה על מנת לשפר את הרגישות. בסופו של דבר, כמו נמוך כמו 1 ag של PrPSc היה ניתן לגילוי על ידי eQuIC, 30.
על מנת לטהר צואה תמציות ולהסיר assay אפשרי מעכבי בצואה, דגימות צואה שנאסף בשלבים קליניות אייל על זיהום אוראלי ניסיוני היו הומוגני במאגר המכיל חומרי ניקוי, מעכבי פרוטאז. צואה תמציות נוספות הוגשו מתודולוגיות שונות להתרכז PrPSc הדגימות ניצול החלבון משקעים באמצעות סודיום phosphotungstic חומצה (NaPTA) משקעים. שיטת משקעים NaPTA, תיאר לראשונה על ידי צפר. et al. 43, משמש להיכנס למצב של ריכוז PrPSc הבדיקה דוגמאות. הדגירה של NaPTA עם תוצאות המדגם בכמות המשקעים מועדף PrPSc ולא PrPC. עם זאת, מנגנון מולקולרי הוא עדיין לא ברור. שלב זה סייע המכיל ומונעים את ההמרה ספונטנית של rPrP, אשר נצפית במקרים מסוימים. לבסוף, תמציות צואה נבדקו על ידי אופטימיזציה RT-מהר באמצעות העכבר rPrP (aa 23-231) כמו מצע, כולל החלפת המצע בפרוטוקול כדי לשפר את רמת הרגישות של זיהוי.
התוצאות כאן מדגימים כי שיטה משופרת זו ניתן לזהות ריכוזים נמוכים מאוד של CWD prions ומגביר את הרגישות של זיהוי וספציפיות דגימות צואה בהשוואה פרוטוקול ללא החלפה משקעים, המצע NaPTA. שיטה זו פוטנציאל שניתן להחיל על רקמות ו נוזלי גוף אחרים, יכול להיות תועלת רבה למעקב CWD ב cervids בשבי הפראית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc seringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UCF901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 ml seringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA75846-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS M Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ML9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OD100C34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tapes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>232702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>7910-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>496626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9410-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial buffers and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugBuster Master Mix</td>
			<td>Nogagen</td>
			<td>71456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Life Technoligies</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards and commercial kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express Autoinduction System 1</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71300-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA protein purification systems FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-25.50</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism6</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

טכניקת RT-מהר היא רגיש במבחנה פריון תא ללא הגברה assay בהתבסס בעיקר על הזריעה misfolding צבירה של פריון רקומביננטי לסובסטרט חלבון (PrP) באמצעות זרעים פריון כתבנית עבור ההמרה. RT-מהר היא טכניקה תפוקה גבוהה חדשניים אשר הוא אנלוגי לאופרטור תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (PCR). זיהוי של צמיחה עמילואיד fibril מבוסס על לצבוע Thioflavin T, אשר שזוהר על אינטראקציה מסוימת עם חלבונים עשיר ᵦ-גיליונות. לפיכך, היווצרות עמילואיד יכול להתגלות בזמן אמת. אנחנו ניסה לפתח אמין לא פולשנית לעבור בדיקה לגילוי כרונית prions המחלה (CWD) מבזבז את תמצית צואה. כאן, אנחנו במפורש הסתגלו הטכניקה RT-מהר כדי לחשוף PrPSc זריעה פעילות צואה של CWD נגוע cervids. בתחילה, הפעילות זריעה של תמציות צואה הכנו היה נמוך יחסית ב- RT-מהר, כנראה עקב פוטנציאליים מעכבי assay בחומר צואה. כדי לשפר את פעילות זריעה של צואה תמציות ולהסיר מעכבי assay פוטנציאליים, אנחנו הומוגני דגימות צואה במאגר המכיל חומרי ניקוי, מעכבי פרוטאז. הגשנו גם את הדוגמאות כדי מתודולוגיות שונות להתרכז PrPSc על בסיס חלבון משקעים באמצעות חומצה phosphotungstic נתרן, ואת כוח צנטריפוגלי. לבסוף, תמציות צואה נבדקו על ידי אופטימיזציה RT-מהר שכלל החלפת המצע בפרוטוקול כדי לשפר את רמת הרגישות של זיהוי. לכן, הקמנו פרוטוקול גילוי רגיש של פריון CWD זריעה פעילות צואה של ניסויים פרה-קליניים ומחקרים קליניים cervids מאת RT-מהר, אשר יכול להיות כלי שימושי לאבחון CWD לא פולשנית.

תמציות צואה CWD מוכן ב-10% (w/v) הצליחו זרע התגובה RT-מהר, אך הרגישות של זיהוי היה נמוך 27. באמצעות מאגר ספציפי עבור המגון צואה היה צעד קריטי כדי להימנע רקע זריחה ב- RT-מהר תגובות והמצוות לשימוש בעכבר rPrP המצע במקום rPrP הצבאים אשר אפשרה להגיע ספציפי יותר תוצאות 2...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material at JoVE.com

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור טכניקה פשוטה, מהירה ויעילה פריון הגברה, השיטה בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר).

בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Views.  University of Calgary. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור טכניקה פשוטה, מהירה ויעילה פריון הגברה, השיטה בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר).

Video: Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

הדמית חיה בזמן אמת של T-תא איתות גיבוש קומפלקס

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

בעקבות בזמן אמת השפעת גורמי דלקת ריאות ארסיים בעכבר דלקת ריאות דגם אקוטי באמצעות חיידקי Bioluminescent

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological malignancies such as childhood acute lymphocytic leukemia. Efforts are currently underway to extend this promising therapy to solid tumors in addition to other hematological cancers. Here, we describe the development and production of potent CAR T cells targeting antigens with unique or preferential expression on solid and liquid tumor cells. The in vitro potency of these CAR T cells is then evaluated in real-time using the highly sensitive impedance-based xCELLigence assay. Specifically, the impact of different costimulatory signaling domains, such as glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (TNFR)-related protein (GITR), on the in vitro potency of CAR T cells is examined. This report includes protocols for: generating CAR T cells for preclinical studies using lentiviral gene transduction, expanding CAR T cells, validating CAR expression, and running and analyzing xCELLigence potency assays.

We describe a quantitative real-time in vitro cytolysis assay system to evaluate the potency of chimeric antigen receptor T cells targeting liquid and solid tumor cells. This protocol can be extended to assess other immune effector cells, as well as combination treatments.

שיטת העוצמה בזמן אמת עבור שצ אנטיגן קולטן התאים T המיקוד תאים מוצק המטולוגי סרטן

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

הפאן-lyssavirus בזמן אמת RT-PCR לאבחון כלבת

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician and the patient. A culture is also prone to false negative results from random loss of viability during specimen handling, overgrowth of other fecal flora, and poor growth of several pathogenic Campylobacter species on traditional media. These problems can confound clinical decisions on patient treatment and have limited the field from answering fundamental questions on Campylobacter growth and infections. We describe a procedure that estimates the lower limit of bacterial numbers that can be detected by a culture and a method for quantifying survival of C. jejuni in media used for transport of this fragile organism. Knowing this information, it becomes possible to set clinically relevant detection thresholds for diagnostic tests and address unstudied issues of whether non-symptomatic colonization is prevalent, if co-infection with other enteric pathogens is common, or if bacterial load correlates with symptoms or serious sequelae. The study also included testing of 1,552 prospectively collected patient diarrheal fecal specimens that were initially classified by conventional culture and further tested by a new enzyme immunoassay. Positive and discrepant specimens were then screened by four molecular methods to assign true-positive or true-negative status. The 5 non-culture methods showed complete agreement on all 48 positive and discrepant specimens, while the culture mis-identified 14 (28%). The specimens that were incorrectly identified by culture included 13 false negative and 1 false positive sample. This basic protocol can be used with multiple Campylobacter spp. and will allow the numbers of Campylobacter bacteria that produce symptoms of gastroenteritis in humans to be determined and for prevalence rates to be updated.

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Although stool culture for Campylobacter is imprecise, it is still considered the gold standard for identification. Methods to determine the limit of detection and survival in transport media of C. jejuni in human stool are described and compared with a new immunoassay with better accuracy.

שיטות התרבות כדי לקבוע את הגבלת הגילוי וההישרדות במדיית התחבורה של קמפילובקטר Jejuni האדם בצואה

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Fecal (micro) RNA Isolation

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs from fecal samples of animal and human subjects. The aim is to isolate total RNA with high purity and quantity for downstream analyses such as RNA sequencing, RT-PCR, and micro-array. The advantages of this optimized protocol in the miRNA isolation are capabilities of isolating highly purified RNA products with additional washing steps described, increased quantity of RNA obtained with an improved method in the resuspension of sample, and important tips of decontamination. One limitation is the inability to process and purify larger sample of more than 200 mg as these sample sizes would cause a difficulty in the clear formation of the interphase. Consequently, the large sample size may contaminate the aqueous phase to be extracted as described in the protocol with organic matters that affect the quality of RNA isolated in the end. However, RNA isolates from a sample of up to 200 mg are sufficient for most of downstream analyses.

Fecal micro RNA Isolation

This protocol isolates high quality total RNA from fecal samples of animal and human subjects. A commercial miRNA isolation kit is used with significant adaption to isolate pure RNA with optimized quantity and quality. The RNA isolates are good for most downstream RNA assays such as sequencing, micro-array, and RT-PCR.

צואה (מיקרו) בידוד RNA

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...