אנחנו אסירי תודה ד ר ביירון Caughey (NIH מעבדות הר סלעי) עבור מספקים את פלסמיד חיידקי הביטוי PrP cervid והדרכה. SG נתמך על-ידי התוכנית קנדה מחקר הכיסא. אנו להכיר מימון למחקר זה ס ג מן הגנום קנדה, אלברטה פריון מכון מחקר, אלברטה לחקלאות ויערנות דרך הגנום אלברטה, מאוניברסיטת קלגרי לתמיכה עבודה זו. אנו להכיר במענק מחקר של הקרן גאן מרגרט לחקר בעלי חיים.

המחברים אין לחשוף.

RT-מהר קודם לכן הועסק לזהות CWD prions שתן ותמציות צואה של אייל פרדי לבן זנב, אייל פרדי שחור זנב דרך הפה הנגוע 38. מערכת שמוצג בכתב היד היא שיטה מותאם וזמינותו RT-מהר. צעדים נוספים אוחדו וזמינותו RT-מהר "הקלאסי" כדי לשפר את זיהוי ואת הרגישות של וזמינותו עבור CWD prions בחומר צואה של חיות נגועו?...

פריון מחלות או מדבקות spongiform encephalopathies (TSE) הן הפרעות ניווניות כולל מחלת קרויצפלד - יעקב (מחלת קרויצפלד-. יעקב) בבני אדם, ספגת המוח (BSE), בקר, scrapie כבשים, עיזים, ואת מבזבז כרונית המחלה (CWD) cervids 1,2. TSEs מאופיינים במראה ייחודי spongiform ואובדן של נוירונים במוח. על-פי ההנחה "חלבון בלבד", prions מורכבים בעיקר PrPSc ('Sc' עבור scrapie) 3, isoform misfolded החלבון מקודד מארח את הסלולר פריון, PrPC. PrPSc נובעת ההמרה של PrPC לתוך קונפורמציה מועשר בגליונות ᵦ 4,5,6 אשר יכול לשמש זרע לאגד, להמיר מולקולות אחרות PrPC . מולקולות PrPSc החדש שנוצר משולבים גדל פולימר 7,8 אשר פורץ oligomers קטנים יותר, וכתוצאה מכך מספר גבוה יותר של גרעינים זיהומיות. PrPSc נוטה צבירת והיא עמידה חלקית פרוטאזות 9,10.
CWD משפיע על אייל מעובדים הפראית (Cervus קנדית), אייל פרדי שחור זנב (האייל hemionus), אייל פרדי לבן זנב (WTD; האייל virginianus), מוס (Alces alces), איילים (Rangifer tarandus ב tarandus ב) 11,12,13. היא נחשבת למחלה מדבקת ביותר פריון עם העברה אופקית המועדף על ידי אינטראקציות cervid והתמדה סביבתי של 14,infectivity15. שלא כמו מחלות אחרות פריון איפה PrPSc הצטברות ו infectivity מרותקים אל המוח, ב- CWD אלה מצויים גם רקמות היקפיים של נוזלי הגוף למשל רוק, שתן, צואה 16,17, 18.
אימונוהיסטוכימיה נחשב תקן הזהב לאבחון CWD לזהות PrPSc הפצה ו- spongiform נגעים 19,20. אליסה במקרים נדירים יותר, תספיג המשמשות גם עבור אבחון CWD. לכן, אבחון מחלת פריון הנוכחי מתבסס בעיקר על זיהוי prions ברקמות פוסט-מורטם. המוות. אבחנה CWD זמין על ידי לקיחת השקדים או ביופסיות recto-אנאלי רירית הקשורים רקמת הלימפה (RAMALT); עם זאת, הליך זה הוא פולשני ודורש לכידתו של בעלי החיים. לפיכך, השימוש של דגימות נגיש בקלות, כגון שתן וצואה, תהיה דרך מעשית לזיהוי פריון CWD. עם זאת, הנמל הפרשות האלה נמוך יחסית ריכוזי prions מתחת לגבול זיהוי של שיטות אבחון הנוכחי. כתוצאה מכך, נדרש יותר רגיש וגבוה תפוקה של כלי אבחון. במבחנה המרת מערכות, כגון חלבון misfolding הגברה מחזורית assay (PMCA) 21, עמילואיד זריעה assay, בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר) assay 22,23, 24 הם כלי רב עוצמה כדי לנצל היכולת שמתרבה של PrPSc לחקות במבחנה את תהליך ההמרה של פריון, ובכך להגביר את הנוכחות של כמויות זעירות של PrPSc לרמות לזיהוי 25 ,26. שיטת RT-מהר, עם זאת, מנצל העובדה כי המוצר ההמרה מועשר בβ-גיליון מבנה שניוני באפשרותך לאגוד במיוחד thioflavin T (ה-T). לכן, PrP רקומביננטי (rPrP) בעת הזריעה ההמרה גדל לתוך הסיבים עמילואיד אשר לאגד את ה-T, לכן ניתן להבחין בזמן אמת באמצעות מדידה של זריחה של ה-T לבטא יחידות קרינה פלואורסצנטית היחסי (RFU) לאורך זמן. ברגע תחת פיקוח, RFU יכול לשמש כדי להעריך היחסי זריעה, ופעילויות פרמטרים כמותיים כגון שלב ההשהיה. השלב לג מייצג את הזמן (h) הנדרש כדי להגיע לסף, במהלך rPrP אשר המרה בשלב מוקדם של התגובה הוא מתחת לגבול זיהוי של ה-T זריחה. בסוף שלב ההשהיה לכאורה, והמצוות להיווצרות של גרעין עמילואיד מספיקות (התגרענות/התארכות), מתרחש כאשר קרינה פלואורסצנטית ה-T חורג רמת הסף הופך להיות חיובי. הצמיחה של עמילואיד הסיבים יכול להתגלות בזמן אמת, PrP הראשוניתSc או זריעה פעילות הכלולים במדגם מוגבר על ידי פילוח אשר מפיק יותר זרעים. זרעים אלה לגרום בתורו שלב מעריכי מהירה של סיבי עמילואיד צמיחה.
כי זה וזמינותו הוא מסוגל לזהות המתחילים 1 fg PrPSc 24, רגישות גבוהה מסמיך בטכניקה זו כדי להשיג את ההימור המוות או אבחון פולשני על ידי גילוי PrPSc שונים רקמות היקפיים, הפרשות או השני סוגים של הדגימה מחסה רמות נמוכות של infectivity. RT-מהר בהחלט מספק יתרונות אחרים מבחני שלו הפארמצבטית, פרקטיות, במהירות (פחות מ- 50 h), עלויות נמוכות בהשוואה bioassays. זה מונע את המורכבות הטכנית כגון sonication בשימוש PMCA; בנוסף, זה מתבצע ב- microplate הקלטת אטום אשר ממזער את הסיכון של זיהום תרסיס של כל טוב. התבנית מרובת טוב המאפשרת הניתוח של דוגמאות עד 96 אותו ניסוי. כדי לסתור את הבעיה חוזרים ונשנים של תוצאות חיוביות שגויות והמרה ספונטנית של rPrP ב מבחני הגיור במבחנה המימוש של סף (ניתוק) ב- RT-מהר הוא מאוד שימושי. אכן, על סמך התוצאות של הפקד שלילי (ממוצע RFU של דגימות שליליות +5 SD 27), תוכנית בסיסית מוגדר שממנו ניתן לעשות אפליה בין דוגמאות חיוביות ושליליות. השימוש של משכפל 4 עבור כל דגימה כך יכול לסייע להגדרת מדגם חיוביים כאשר לפחות 50% של משכפל הצג סימן חיובי, כלומר לחצות את ניתוק 28. הומולוגיה בין הזרע לבין המצע לא נדרש ב- RT-מהר, כמו למשל במחקר הקודם, אוגר rPrP נמצאה להיות מצע רגיש יותר בהשוואה המצע הומולוגי ב PrP האנושיvCJD נזרע הצאן scrapie נזרע תגובות 29. rPrP chimeric אוגר-כבשים הוצעה גם להיות מצע מתאים היטב יותר מאשר rPrP האנושית לזהות האנושית variant מחלת קרויצפלד-יעקב prions 30. לפיכך, השימוש rPrP סובסטרטים של מינים שונים נפוץ מאוד בזה וזמינותו. Assay זו הוחלה בהצלחה מספר מחלות פריון, כמו "טפטוף" מחלת קרויצפלד-יעקב 31,32,33, מהדור השניפריון etic מחלות 34, BSE 35,36,37, scrapie 23,36, CWD 38,39,40,41, 42. מחקרים באמצעות עיבוד נוזל מוחי שדרתי, דם, רוק, שתן כמו זרעים ב RT-מהר היו כולן מוצלחות כדי לזהות PrPSc 38,39,40,41, 42. לטפח את יכולת זיהוי בדגימות כמו פלזמה שעשויים להכיל מעכבי היווצרות עמילואיד, Orrú et al. (2011) פיתחה אסטרטגיה כדי להסיר מעכבי פוטנציאל היווצרות עמילואיד בסירוק שלב immunoprecipitation (IP) PrPSc ו- RT-QuIC, בשם assay "משופרת QuIC" (eQuIC). בנוסף, צעד החלפת המצע הועסק לאחר ~ 24 שעות של זמן התגובה על מנת לשפר את הרגישות. בסופו של דבר, כמו נמוך כמו 1 ag של PrPSc היה ניתן לגילוי על ידי eQuIC, 30.
על מנת לטהר צואה תמציות ולהסיר assay אפשרי מעכבי בצואה, דגימות צואה שנאסף בשלבים קליניות אייל על זיהום אוראלי ניסיוני היו הומוגני במאגר המכיל חומרי ניקוי, מעכבי פרוטאז. צואה תמציות נוספות הוגשו מתודולוגיות שונות להתרכז PrPSc הדגימות ניצול החלבון משקעים באמצעות סודיום phosphotungstic חומצה (NaPTA) משקעים. שיטת משקעים NaPTA, תיאר לראשונה על ידי צפר. et al. 43, משמש להיכנס למצב של ריכוז PrPSc הבדיקה דוגמאות. הדגירה של NaPTA עם תוצאות המדגם בכמות המשקעים מועדף PrPSc ולא PrPC. עם זאת, מנגנון מולקולרי הוא עדיין לא ברור. שלב זה סייע המכיל ומונעים את ההמרה ספונטנית של rPrP, אשר נצפית במקרים מסוימים. לבסוף, תמציות צואה נבדקו על ידי אופטימיזציה RT-מהר באמצעות העכבר rPrP (aa 23-231) כמו מצע, כולל החלפת המצע בפרוטוקול כדי לשפר את רמת הרגישות של זיהוי.
התוצאות כאן מדגימים כי שיטה משופרת זו ניתן לזהות ריכוזים נמוכים מאוד של CWD prions ומגביר את הרגישות של זיהוי וספציפיות דגימות צואה בהשוואה פרוטוקול ללא החלפה משקעים, המצע NaPTA. שיטה זו פוטנציאל שניתן להחיל על רקמות ו נוזלי גוף אחרים, יכול להיות תועלת רבה למעקב CWD ב cervids בשבי הפראית.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc seringe filters</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml seringe</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning bottle-top vacuum filters</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) broth</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td><td>PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc sealing tapes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor tablet</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Commercial buffers and solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Standards and commercial kits&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Autoinduction System 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment setup&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA protein purification systems FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega microplate reader</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Sofware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MARS Data Analysis</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad software</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

טכניקת RT-מהר היא רגיש במבחנה פריון תא ללא הגברה assay בהתבסס בעיקר על הזריעה misfolding צבירה של פריון רקומביננטי לסובסטרט חלבון (PrP) באמצעות זרעים פריון כתבנית עבור ההמרה. RT-מהר היא טכניקה תפוקה גבוהה חדשניים אשר הוא אנלוגי לאופרטור תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת (PCR). זיהוי של צמיחה עמילואיד fibril מבוסס על לצבוע Thioflavin T, אשר שזוהר על אינטראקציה מסוימת עם חלבונים עשיר ᵦ-גיליונות. לפיכך, היווצרות עמילואיד יכול להתגלות בזמן אמת. אנחנו ניסה לפתח אמין לא פולשנית לעבור בדיקה לגילוי כרונית prions המחלה (CWD) מבזבז את תמצית צואה. כאן, אנחנו במפורש הסתגלו הטכניקה RT-מהר כדי לחשוף PrPSc זריעה פעילות צואה של CWD נגוע cervids. בתחילה, הפעילות זריעה של תמציות צואה הכנו היה נמוך יחסית ב- RT-מהר, כנראה עקב פוטנציאליים מעכבי assay בחומר צואה. כדי לשפר את פעילות זריעה של צואה תמציות ולהסיר מעכבי assay פוטנציאליים, אנחנו הומוגני דגימות צואה במאגר המכיל חומרי ניקוי, מעכבי פרוטאז. הגשנו גם את הדוגמאות כדי מתודולוגיות שונות להתרכז PrPSc על בסיס חלבון משקעים באמצעות חומצה phosphotungstic נתרן, ואת כוח צנטריפוגלי. לבסוף, תמציות צואה נבדקו על ידי אופטימיזציה RT-מהר שכלל החלפת המצע בפרוטוקול כדי לשפר את רמת הרגישות של זיהוי. לכן, הקמנו פרוטוקול גילוי רגיש של פריון CWD זריעה פעילות צואה של ניסויים פרה-קליניים ומחקרים קליניים cervids מאת RT-מהר, אשר יכול להיות כלי שימושי לאבחון CWD לא פולשנית.

תמציות צואה CWD מוכן ב-10% (w/v) הצליחו זרע התגובה RT-מהר, אך הרגישות של זיהוי היה נמוך 27. באמצעות מאגר ספציפי עבור המגון צואה היה צעד קריטי כדי להימנע רקע זריחה ב- RT-מהר תגובות והמצוות לשימוש בעכבר rPrP המצע במקום rPrP הצבאים אשר אפשרה להגיע ספציפי יותר תוצאות 2...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material at JoVE.com

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור טכניקה פשוטה, מהירה ויעילה פריון הגברה, השיטה בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר).

בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.6K Views.  University of Calgary. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתיאור טכניקה פשוטה, מהירה ויעילה פריון הגברה, השיטה בזמן אמת רועד מפחד-induced ההמרה (RT-מהר).

Video: Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

ניטור החיסונית תאים פלורסנט סחר Prion שעות לאחר ההדבקה מוטות intraperitoneal

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

הגברה מחזורית misfolding חלבון של פריונים

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

נהלים לזיהוי פריוני זיהומיות לאחר המעבר דרך מערכת העיכול של מינים עופות

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

הערכת מחסומי transmissible מינים ספגו מוח עם<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay המרת חלבון הפריון

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Medicine

Quantitation of Rabies Virus in Various Bovine Brain Structures

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major zoonotic risk. Here, our objective was to utilize a laboratory protocol to determine the relative copy number of the rabies virus (RABV) genome in different bovine brain anatomical structures using quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). qRT-PCR quantifies the specific number of gene copies present in a sample based on fluorescence emitted after amplification that is directly proportional to the amount of target nucleic acid present in the sample. This method is advantageous owing to its short duration, reduced risk of contamination, and potential to detect viral nucleic acids in different samples more easily compared to other techniques. The brains of six rabid animals were divided into six anatomical structures, namely the Ammon&#8217;s horn, cerebellum, cortex, medulla, pons, and thalamus. All brains were identified as positive for RABV antigens based on a direct immunofluorescence test. The same anatomical structures from the brains of four RABV-negative bovines were also assessed. RNA was extracted from each structure and used for qRT-PCR. An assay was performed to determine the copy numbers of RABV genes using an in vitro transcribed nucleoprotein gene. The standard curve used to quantify viral RNA exhibited an efficiency of 100% and linearity of 0.99. Analysis revealed that the cortex, medulla, and thalamus were the ideal CNS portions for use in RABV detection, based on the observation that these structures possessed the highest levels of RABV. The test specificity was 100%. All samples were positive, no false positives were detected. This method can be used to detect RABV in samples that contain low levels of RABV during diagnosis of BPR.

This protocol presents a qRT-PCR-based approach for determining the rabies virus nucleoprotein (N) gene copy number within various bovine brain anatomical structures using in vitro transcription.

כמויות של וירוס כלבת במבני מוח שור שונים

Bovine paralytic rabies (BPR) is a form of viral encephalitis that is of substantial economic importance throughout Latin America, where it poses a major ...

Prion Safety Laboratory Swipe Test

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to prion-contaminated laboratory tools. Prions cause disease by the templated misfolding of the normal cellular form of the prion protein, PrPC, into the misfolded and pathogenic form PrPSc and are invariably fatal. Reducing iatrogenic and occupational prion transmission is challenging. First, prions can bind to and persist on surfaces for long periods of time. Second, prions are highly resistant to inactivation. Given this, surfaces can retain infectivity for long periods of time following ineffective decontamination. Not only can this pose a potential occupational risk for prion laboratory workers, but it could potentially cross-contaminate laboratory experiments utilizing sensitive prion amplification techniques. The protocol described here for a prion safety laboratory swipe test includes steps for the identification and documentation of high-traffic laboratory areas, recommended swabbing controls to ensure the validity of results, steps to identify proper responses to positive surface swabbing sites, representative results from prion swipe testing, as well as potential artifactual results. Overall, the prion safety laboratory swipe test can be implemented as part of a broader prion safety program to assess decontamination of surfaces, monitor common spaces for prion contamination, and implement the documentation of prion decontamination status.

A method to assess commonly used areas in laboratory settings for prion contamination and effective decontamination is lacking. The protocol described here provides key fundamentals for implementing a laboratory prion safety swipe test that can easily be modified to meet the individual needs of specific laboratories.

בדיקת החלקה של מעבדת בטיחות פריון

Transmission of iatrogenic prion disease has occurred from contaminated neurosurgical tools, transplant materials, and occupational exposure to ...

Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). These neurodegenerative diseases affect humans and several animal species and include scrapie, zoonotic bovine spongiform encephalopathy (BSE), chronic wasting disease of cervids (CWD), and the newly identified camel prion disease (CPD). Diagnosis of TSEs relies on immunodetection of PrPSc by application of both immunohistochemistry (IHC) and western immunoblot methods (WB) on encephalon tissues, namely, the brainstem (obex level). IHC is a widely used method that uses&#160;primary antibodies (monoclonal or polyclonal) against antigens of interest in cells of a tissue section. The antibody-antigen binding can be visualized by a color reaction that remains localized in the area of the tissue or cell where the antibody was targeted. As such, in prion diseases, as in other fields of research, the immunohistochemistry techniques are not solely used for diagnostic purposes but also in pathogenesis studies. Such studies involve detecting the PrPSc patterns and types from those previously described to identify the new prion strains. As BSE can infect humans, it is recommended that biosafety laboratory level-3 (BSL-3) facilities and/or practices are used to handle cattle, small ruminants, and cervid samples included in the TSE surveillance. Additionally, containment and prion-dedicated equipment are recommended, whenever possible, to limit contamination. The PrPSc IHC procedure consists of a formic acid epitope-demasking step also acting as a prion inactivation measure, as formalin-fixed and paraffin-embedded tissues used in this technique remain infectious. When interpreting the results, care must be taken to distinguish non-specific immunolabeling from target labeling. For this purpose, it is important to recognize artifacts of immunolabeling obtained in known TSE-negative control animals to differentiate those from specific PrPSc immunolabeling types, which can vary between TSE strains, host species, and prnp genotype, further described herein.

Immunolabeling abnormal prion protein using immunohistochemistry protocols requires specific sample and anti-PrP antibody preparation methodologies. The present protocol describes the key steps in epitope demasking to ensure proper PrP immunolabeling and to minimize non-specific background staining. Also, this approach considers biosafety measures when conducting immunohistochemistry studies with the prion-infected tissues.

זיהוי של חלבון פריון חריג על ידי אימונוהיסטוכימיה

Abnormal prion proteins (PrPSc) are the disease-associated isoform of cellular prion protein and diagnostic markers of transmissible spongiform ...

Neuroscience

Detecting Abnormal Prion Proteins in Brain Tissue Using Immunohistochemistry

Source: Orge, L., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64560">Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates a technique to detect misfolded prion protein in brain sections using immunohistochemistry. Upon treating the brain section with formic acid to denature prions and minimize infection risk, as well as unmasking the prion aggregates using heat-induced epitope retrieval, the sections are immunolabeled for the misfolded prion protein aggregates and observed under a microscope.

איתור חלבוני פריון חריגים ברקמת המוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה

1. Tissue sectioning and slide preparation

	Cut sections of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues at 3-5 &#181;m thickness using a microtome.
	...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

Detection of Misfolded Prion Protein Aggregates in Mouse Brain Tissue Using Western Blotting

Take tissue homogenate from a mammalian brain that contains both normal prion proteins and misfolded prion aggregates responsible for neurodegenerative diseases.
Incubate with a proteolytic enzyme to digest the normal prions, leaving the resistant aggregates intact.
Treat the aggregates with a denaturing buffer at a high temperature to linearize the proteins and impart a uniform negative charge.
Load the sample onto an electrophoresis gel and separate the proteins into bands, which confirms the presence of aggregates.
Using an electric field, transfer the separated proteins onto a membrane.
Incubate the membrane in a blocking solution to mask non-specific binding sites.
Incubate with peroxidase enzyme-tagged antibodies, which bind specifically to the prion aggregates.
Wash the membrane to remove unbound antibodies, minimizing non-specific signals.
Add a chemiluminescent substrate and an oxidizing agent, enabling the peroxidase to oxidize the substrate and produce light.
Measure the light intensity to quantify misfolded prions in the homogenate.

בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

Summary

Explore More Videos