Wir sind dankbar, Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) für die Ausbildung und das Cervid PrP bakterielle Expressionsplasmid. SG wird vom Canada Research Chair Programm unterstützt. Wir anerkennen die Fördermittel für diese Forschung zu SG Genome Kanada, Alberta Prion Research Institute und Alberta Land- und Forstwirtschaft durch Genom Alberta und der University of Calgary zur Unterstützung dieser Arbeit. Wir erkennen ein Forschungsstipendium von der Margaret Gunn Foundation for Animal Research.

1. RT QuIC mittels fäkal Material <ol><li><ol><li>machen Aufstellungdes Cervid Kot extrahiert fäkale Homogenat durch Zugabe von 1 g fäkal Material bis 10 mL von Kot extrahieren Puffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7,1, 130 mM NaCl, 0,05 % Tween 20, 1 mM PMSF und 1 X komplette Protease-Inhibitoren, EDTA-frei), eine Endkonzentration von 10 % (w/V) zu geben. Der Homogenisierung Puffer kann vor der Nutzung vorbereitet und bei-20 ° c</li>
		<li>Homogenize fäkale Pellets (1 g) und Puffer (10 mL) in Tuben (z. B. GentleMACS M Rohre) mit einem Dissociator mit einem vorgegebenen Programm vom Hersteller für Proteine für 1 min bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei-bis dreimal, bis die Stuhlproben im Puffer vollständig homogenisiert werden.</li>
		<li>Abdichtung der Rohre mit Parafilm und legen Sie sie auf einem schaukelnden Plattform oder Rotary Shaker für eine 1 h Inkubation bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zentrifugieren der Rohre bei 18.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Sammeln die Überstände enthält das Protein extrahiert und aliquoten in 1,5 mL Röhrchen. Aliquote bei-80 ° C für weitere Anwendungen gespeichert werden können.</li>
	</ol></li> <li>Konzentration von PrP Sc im Kot extrahiert Hinweis: um CWD Prionen in den Kot Extrakt Proben, wodurch die Nachweisempfindlichkeit von RT-QuIC, konzentrieren wird ein Eiweiß Niederschlag Schritt hinzugefügt des Protokolls.
	<ol><li>NaPTA Niederschlag Methode</li> <li>fügen Sie 250 µL 10 % (w/V) des N-Natriumlaurylsulfat Sarcosinate (Sarkosyl) zu 1 mL der fäkalen Protein zu extrahieren, um eine Endkonzentration von Sarkosyl von 2 % (V/V) geben.</li>
		<li>Dichtung die Schläuche, die enthalten der Proben mit Parafilm und Inkubation bei 37 ° C für 30 min unter konstanten Schütteln bei 1.400 u/min in einem Thermomixer.</li>
		<li>Stellen Sie die Mischung aus fäkalen Proteinextrakt und Sarkosyl mit einer Stammlösung mit 10 % (w/V) Natrium Phosphotungstic Acid und 170 mM Magnesiumchlorid, pH 7,4, eine Endkonzentration von 0,3 % (w/V) Natrium Phosphotungstic Acid in den Proben zu erhalten.</li>
		<li>Der Proben bei 37 ° C für 2 h mit konstanter Schütteln bei 400 u/min inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 14 ° C für 30 min bei 15.800 x g. Entfernen Sie vorsichtig die Überstände.</li>
		<li>Waschen die Pellets von resuspending sie in Waschpuffer (10 mM Tris-Cl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0,5 % Triton X 100, 10 mM EDTA, 0,5 % Natrium Deoxycholate (w/V) und 0,1 % Sarkosyl (w/V)).</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Proben bei 14 ° C für 15 min bei 15.800 x g. Entfernen Sie vorsichtig die Überstände.</li>
		<li>Aufschwemmen der Pellets in 100 µL (1/10 des ursprünglichen Volumens des fäkalen Proteins Auszug) von RT-QuIC Verdünnungspuffer. 
		Hinweis: RT QuIC Verdünnungspuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 6,9, 130 mM NaCl, 0,1 % SDS (w/V) und 1 X N2 Ergänzung) ist vor der Nutzung bereit. Einem Gesamtvolumen von 10 mL gefiltert durch einen 0,2 µm Acrodisc Spritze Filter mit einer Spritze und dann bis zur Verwendung bei-20 ° C gelagert.</li>
		<li>Speichern die NaPTA behandelt Proben bei-20 ° C bis nutzen sie in RT-QuIC Assay.</li>
	</ol></li> <li>RT-QuIC Assay <ol><li>bereiten Sie eine frische 10 mM Th-T-Stammlösung (0,032 g Th-T in 10 mL doppelt destilliertem H 2 O).</li>
		<li>Machen eine Verdünnung von 01:10 der Stammlösung doppelt H 2 O destilliert um einer Endkonzentration von Th-T von 1 mM machen die Filter Filtern mit einer Spritze durch eine 0,2 µm Acrodisc Spritze Th-T.</li>
		<li>Tauen Sie Maus rekombinante PrP (rPrP, aa 23-231) Substrat (10 µg/mL pro RT QuIC Reaktion) aufbewahrt bei-80 ° C auf Eis.</li>
		<li>Last 500 µL rPrP Substrat einzeln in 100 kDa Größe Ausgrenzung Filter Mikroröhrchen und Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur (eine Röhre/Filter kann bis zu zwei Mal verwendet werden).</li>
		<li>Übertragen die eluierten Substrat in einem sterilen 1,5 mL-Tube und halten Sie es bei 4 ° C bis zur Verwendung.</li>
		<li>Auftauen RT-QuIC Verdünnungspuffer gespeichert bei-20 ° c</li>
		<li>Machen Verdünnungen des Samens (fäkal Proteinextrakt) in RT-QuIC Verdünnungspuffer: 
		Unverdünnte Probe: die fäkale Proteinextrakt unverdünnt verwenden verdünnt, 2 x 10 -1 verdünnt, 2 x 10 -2 verdünnt, 2 x 10 -3</li> <li>RT-QuIC Reaktionsgemisch Stammlösungen vorbereiten: Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung ( PBS): 5 X NaCl: 2 M auf Lager Lösung von NaCl vorbereitet in doppelt destilliertem H 2 O. 
		EDTA: 100 mM Stammlösung von EDTA im Doppelzimmer vorbereitet destilliert H 2 O.</li>
		<li>Vor der Verwertung aller Lösungen (Schritt 1.3.8), jede Lösung getrennt durch einen 0,2 µm Acrodisc Spritze Filter mit einer Spritze zu filtern und steril bei Zimmertemperatur aufbewahren.</li>
		<li>Bereiten ein Gesamtvolumen von RT-QuIC Reaktionsgemisch nach der Anzahl der Proben (98 µL Volumen der Reaktion pro Probe und vier Wiederholungen pro Probe) zzgl. 10 % dieses Volumens verwendet werden, um sicherzustellen, dass genügend Mischung für alle Reaktionen haben.
		<ol><li>Verwendung eine 15 mL-Tube, das RT-QuIC Reaktionsgemisch vorzubereiten (20 mM Natriumphosphat, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 µM Th-T, 10 µg/mL rPrP Substrat und doppelt destilliertes Wasser, die rPrP endgültige Konzentration in der Reaktion einzustellen) unter Verwendung der Lager Sol Eigei.</li>
			<li>Alle Lösungen mischen auch nach oben und unten mit einer Pipette mit eine Filterspitze pipettieren. Die Verwendung von Wirbel so weit wie möglich vermeiden.</li>
			<li>Gießen Sie die Mischung in ein 50 mL Einweg Pipettieren Reservoir.</li>
			<li>Verwenden, eine Mehrkanal-Pipette 98 µL RT-QuIC Reaktionsgemisch in jede Vertiefung eine 96-Well optische Bodenplatte laden.</li>
		</ol></li> <li>Jeder RT QuIC Reaktion 2 µL unverdünnte oder 10-divisibel seriell verdünnt fäkale Proteinextrakt hinzufügen. Testen Sie jede Probe in vier Wiederholungen. 
		Hinweis: In jedem Experiment Verdünnungsreihen Stuhlproben (von unverdünnt bis zu 2 x 10 -3) von CWD-Negative und verifizierte CWD-positiven Tieren dienen als negative und positive Kontrollen bzw..</li>
		<li>Die Platte mit einem Dichtband vor der Inkubation in einem Teller-Reader bei 42 ° C für 25 h mit wiederholten Zyklen 1 min Doppel orbital schütteln (700 u/min) und 1 min ruhen während der Inkubation zu versiegeln.</li>
		<li>Fluoreszenz-Messeinstellungen definieren: 
		Anregung: 450 nm Emission: 480 nm unten lesen, Anzahl der Blitze: 20 manuelle Verstärkung: 1000 (je nach Maschine) Integrationszeit: 20 µs</li> <li>Entfernen Sie die Platte aus dem Teller Leser am Ende des 25 h.</li>
		<li>Spin-down der Platte bei 3.000 x g für 3 min zur Vermeidung von möglichen Kontaminationen zwischen den Wells.</li>
		<li>Entfernen Sie die Dichtung von der Platte.</li>
		<li>Bereiten eine neue 96-Well-Platte durch das Hinzufügen von 90 µL RT-QuIC Reaktionsmischung enthalten frisches Substrat und frischen Fluoreszenz färben Th-T, wie in Abschnitt 1.3.1, 1.3.6 beschrieben.</li>
		<li>Transfer 10 µL aus jedem Brunnen der ersten Platte auf die neu vorzubereitenden 96 gut Platte.</li>
		<li>Die neue Dichtplatte und RT-QuIC Assays für zusätzliche 50 h die beschriebenen Schritte in Schritt 1.3.13. weiter. Dieser zusätzliche Schritt von 50 h machen die gesamte Reaktionszeit der 75 h. 
		Hinweis: Die Verfahren der RT-QuIC Assay erfolgen unter Biosafety Schrank.</li>
		<li>Die Daten sammeln.
		<ol><li>Lesen und dokumentieren die Th-T Fluoreszenzsignal jeder gut alle 15 min.</li>
			<li>Daten der Gesamtzahl der Zyklen mit Datenanalyse-Software und die Übertragung in eine Tabellenkalkulation mit dem Durchschnitt der vierfach Reaktionen erfassen.</li>
			<li>Zeichnen die Durchschnitte der Daten. Die x-Achse entspricht die Reaktionszeit der RT-QuIC (h) und die y-Achse entspricht die relative Fluoreszenz-Einheiten (RFU). Jede Kurve entspricht einer Verdünnung von einem bekannten Probe.</li>
			<li>In jedem Experiment abzugrenzen eine Schwelle durch die Berechnung der höchsten Mittelwerte der negativen Kontrolle plus 5 Standardabweichungen in aktuellen beschrieben veröffentlicht Literatur 41. 
			HINWEIS: Alle Replikate, die die definierte Schwelle überschritten gelten als positiv. Wenn mindestens zwei von vier Wiederholungen die Schwelle überschritten, gilt die Probe dann positive.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Reinigung von rekombinanten Prion-Protein (rPrP) <ol><li>Wachstum von bakteriellen Lager und Ausdruck des rPrP Hinweis: Escherichia coli (E. Coli) Stamm Rosetta (DE3) transformiert mit Vektor-Haustier-24 Codierung der Maus PrP (Rückstände 23-231) wurde verwendet, um die rPrP vorzubereiten.
	<ol><li>Auftauen Glycerin Bestand an Rosetta (DE3) transformiert mit Haustier-24 mPrP(23-231) auf Eis.</li>
		<li>Streifen LB (Luria Bertani) Platten mit einer Endkonzentration von Kanamycin von 50 µg/mL und über Nacht in einem Inkubator 37 ° C inkubieren. Stellen Sie sicher, dass die Platten auf den Kopf gestellt zur Vermeidung von Kondensation der Luftfeuchtigkeit in den festen Medien, die die Bakterien enthalten. Bereiten Sie zwei Platten zu achten, Wachstum in mindestens einer der beiden Platten haben.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 L LB und Autoklaven um es steril machen.</li>
		<li>Ergänzung 1 L sterile LB Medien mit 1 mL Kanamycin (50 mg/mL) und 1 mL Chloramphenicol (34 mg/mL).</li>
		<li>Wählen Sie eine Kolonie von jeder Platte mit einem Einweg-Impfschlinge 3 mL LB-Medium mit Kanamycin und Chloramphenicol impfen.</li>
		<li>Ort der Mini-Kulturen im Brutschrank bei 37 ° C mit konstanter Schütteln bei 225 u/min für 5-6 h.</li>
		<li>Fügen Sie die Mini-Kulturen auf den Rest des ursprünglichen 1 l LB Medien zusammen mit Express Autoinduktion System 1 für die Induktion der Proteinexpression.</li>
		<li>Ort der Kultur in 2 L Flasche oder größer, in einem Inkubator bei 37 ° C mit konstanter Schütteln bei 200 u/min für 20-24 h.</li>
		<li>4 x 250 mL Zentrifuge Röhren 1 L Kultur aufgeteilt.</li>
		<li>Spin-down das Röhrchen mit der Kultur bei 3.750 x g für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Überstand verwerfen und die bakterielle Pellets in 50 mL Zentrifuge Röhren sammeln, dann frieren sie bei-80 ° C bis zu Weiterverarbeitung. Die daraus resultierende Pellets haben 3 bis 4 g für eine gute Protein-Ausbeute gewogen.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung der Einbeziehung Körper <ol><li>tauen die gefrorenen Pellet (3 bis 4 g) bei 37 ° C für einige Minuten.</li>
		<li>Pellet ein weiteres Mal für 10 min bei-80 ° C Einfrieren und wieder Auftauen. Wiederholen Sie diesen Schritt von Einfrieren und Auftauen zweimal.</li>
		<li>Aufschwemmen der bakterielle Pellet in 1 X Lyse-Reagenz (z. B. BugBuster Master Mix) durch Pipettieren gründlich. Verwenden Sie 5 mL Reagenz für 1 g bakterielle Pellets. Achten Sie darauf, die Mischung vollständig zu homogenisieren.</li>
		<li>Das Homogenat auf einer Wippe für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Zentrifugieren Homogenat bei 16.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Überstände durch sorgfältig Gießen off</li>
		<li>Der Pellets in das gleiche Volumen von 1 X Lyse-Reagenz wie im vorherigen Schritt zu homogenisieren.</li>
		<li>Das Homogenat für 15 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie ein ausreichendes Volumen an 01:10 (0,1 X) Lyse-Reagenz zu einem insgesamt Homogenat Volumen von 40 mL. Mix durch Umkehrung gut Homogenisieren sicherstellen.</li>
		<li>Zentrifugieren Homogenat bei 7.900 x g für 15 min bei 4 ° c</li>
		<li>Verwerfen den Überstand vorsichtig gießen it.</li>
		<li>Das Pellet in 40 mL 0,1 x Lyse-Reagenz Aufschwemmen.</li>
		<li>Zentrifugieren Homogenat bei 16.000 x g für 15 min bei 4 ° c</li>
		<li>Verwerfen den Überstand vorsichtig durch Gießen und das Pellet mit Einschlusskörperchen bei-20 ° C bis Weiterverarbeitung zu speichern.</li>
	</ol></li> <li>Proteinreinigung <ol><li>Einschlusskörperchen bei Raumtemperatur auftauen.</li>
		<li>Lösen sich die aufgetauten Inclusion Bodies in 14 mL 8 M Guanidin-HCl (38 g Guanidin-Hydrochlorid in 0,1 M NaPO 4 pH 8.0 und füllen Sie das Fahrwerk mit H 2 O bis 50 mL; pH bei endgültige Lösung nicht verstellen), Proteine zu solubilisieren.</li>
		<li>Achten Sie darauf, auch von oben und unten Pipettieren homogenisieren.</li>
		<li>Inkubation der lysate auf einer Wippe bei Raumtemperatur für 50 min.</li>
		<li>Bereiten 18 g Ni-NTA Harz Perlen (18 g für 3 bis 4 g bakterielle Pellet); mit 100 mL Wasser mit Vakuum und einen 100 mL 0,22 µm Flasche Top Filter spülen.
		<ol><li>Die 18 g Ni-NTA Harzkügelchen in 50 mL-Tube und ausreichend Volumen der Denaturierung Puffer (100 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M Guanidin-Hydrochlorid, pH 8) um das Endvolumen zu machen bis zu 50 mL.</li>
			<li>Die Perlen in der denaturierenden Puffer für 50 min auf einer Wippe bei Raumtemperatur equilibrate.</li>
		</ol></li> <li>Zentrifugieren der Einbeziehung Körper lysate 16.000 x g für 5 min, unlösliche Ablagerungen zu entfernen.</li>
		<li>Äquilibriert Perlen der Überstand hinzu und die Pellets zu verwerfen.</li>
		<li>Setzen Sie die Mischung auf ein Rocker für 40 min bei Raumtemperatur erlauben Proteinbindung an Ni-NTA Harz. 
		Hinweis: Nickel Chelat Perlen dienen zur PrP reinigen durch seine Nickel-Affinität. Die Histidin-reiche N-terminalen Region von PrP rendert die Affinität zu Nickel(II)-Oxid, wodurch das Protein binden an nickel-Ionen ohne irgendwelche seiner-Tag.</li>
		<li>Waschen FPLC mit Wasser zu reinigen, beide Linien (A und B).</li>
		<li>Ausführen von Geruchsstoffen Puffer (100 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, pH 8.0, 6 M Guanidin-Hydrochlorid, pH 8) durch beide Linien (A und B) das System Prime (die Spalte ist noch nicht zugeordnet).</li>
		<li>Laden der Harz auf Spalte. Vergewissern Sie sich, um Luftblasen zu minimieren.</li>
		<li>Legen die Spalte auf der FPLC und einen linearen Farbverlauf aus 100 % Denaturierung Puffer A und 0 % der Umfaltung Puffer B (100 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, pH 8,0) zunächst auf 0 % Puffer Denaturierung und 100 % Umfaltung Puffer bis zum Ende laufen. Dieser allmähliche Verlagerung ist bei einer Durchflussrate von 0,75 mL/min 240 min laufen und ist notwendig für die korrekte Faltung von PrP. 
		Hinweis: Während der chromatographischen Reinigungsprozess ist denaturierte PrP zuerst langsam auf das Harz refolded durch die Anwendung eines linearen Farbverlaufs Umfaltung Puffer, den denaturierenden Puffer zu ersetzen. Dieser Schritt entfernt auch die chaotropen Guanidin-HCl.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass 100 % Umfaltung Puffer weiterhin fließen durch die Spalte für eine zusätzliche 30 min bei 0,75 mL/min.</li>
		<li>Spülen Linie A mit anschließender Elution Buffer (100 mM Natriumphosphat, 10 mM Tris, 500 mM Imidazol, pH-Wert 5,8) Wasser unter Umgehung der Spalte. Dies wird sauber aus der denaturierenden Puffer, der jetzt von der Elution Buffer im AKTA System ersetzt wurde.</li>
		<li>Elute Protein mit 2 mL/min mit einem linearen Farbverlauf für 40 min vom 100 % Umfaltung Puffer B und 0 % Elution Buffer A zunächst auf 0 % Umfaltung Puffer und 100 % Elution Buffer. 
		Hinweis: Die hohe Konzentration von Imidazol in Elution Puffer konkurrieren PrP &#39; s-Bindung an die Nickel(II)-oxid. Die primäre Protein Peak sollte anfangen zu ca. 1/3 des Weges durch den Farbverlauf eluieren.
		<ol><li>Watch Chromatogramm für OD 280 nm erhöhen.</li>
		</ol></li> <li>Sammeln nur die Rohre, enthält das Protein in der Mitte des großen Berges. 
		Hinweis: Der eluierten Bruchteile von 2 mL werden in 15 mL Röhrchen gesammelt.</li>
		<li>In den Rohren sofort mit ca. 1/3 Volumen (1 mL) enthaltene Protein von Dialyse-Puffer (10 mM Natriumphosphat, pH 5.8) verdünnen.</li>
		<li>Legen Sie sofort die Rohre auf Eis.</li>
		<li>Pool eluierten Proteins in den Rohren enthalten.</li>
		<li>Armen das Protein in Dialyse-Kassetten (Molekulargewicht Cut-off 10 kDa).</li>
		<li>Setzen die Kassetten in vorgekühlt Dialyse-Puffer (3,6 L) für 2 h bei 4 ° C, dann übertragen die Kassetten in einen frischen Dialyse-Puffer (3,6 L) für eine Nacht. Machen Sie sicher, dass die Dialyse-Puffer in ständiger Bewegung befindet.</li>
		<li>Protein nach der Dialyse durch einen 0,2 µm Acrodisc Spritze Filter mit einer Spritze zu filtern.</li>
		<li>Messen die Konzentration des Proteins mit einem BCA Protein Assay Kit.</li>
		<li>Konzentrat oder verdünnen, wenn nötig, passen die Proteinkonzentration bis 0,3 mg/mL. 
		Hinweis: Bestätigen Sie Reinheit durch SDS-PAGE und Coomassie blaue Färbung.</li>
		<li>1 mL Aliquote des Proteins in Mikrozentrifugenröhrchen und sofort bei-80 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern, wie in der RT-QuIC Protokoll beschrieben.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

RT-QuIC war zuvor beschäftigt, CWD Prionen in Urin und fäkale Extrakte von mündlich infizierten weiß - angebundene Rotwild und Maultierhirsche 38zu erkennen. Das System in diesem Manuskript gezeigt ist eine angepasste Methode des RT-QuIC Assays. Weitere Schritte wurden in der "klassischen" RT-QuIC Assay zur Verbesserung der Erkennung und Empfindlichkeit des Assays für CWD Prionen in Fäkalien infizierter Tiere aufgenommen.
Die niedrige Nachweisempfindlichkeit im Ko...

Prion-Krankheiten oder transmissiblen spongiformen Enzephalopathien (TSE) sind Neurodegenerative Erkrankungen einschließlich der Creutzfeldt - Jakob-Krankheit (CJK) beim Menschen, bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern, Scrapie bei Schafen und Ziegen und chronische verschwenden Disease (CWD) in Hirschartigen 1,2. TSE zeichnen sich durch markante spongiforme aussehen und Verlust von Nervenzellen im Gehirn. Nach der Hypothese "Protein nur" sind Prionen hauptsächlich bestehend aus PrPSc ("Sc" für Scrapie) 3, fehlgefaltete Isoform des Host-kodierten zellulären Prion-Proteins, PrPC. PrP-Sc ergibt sich aus der Umrechnung von PrPC eine Konformation in ᵦ-Blätter 4,5,6 dienen kann, wie ein Samenkorn zu binden und konvertieren andere PrPC Moleküle angereichert. Die neu generierten PrPSc -Moleküle sind in wachsenden Polymer 7,8 eingearbeitet in kleineren Oligomere, wodurch höhere Anzahl von infektiösen Kerne einbricht. PrP-Sc ist anfällig für Aggregation und teilweise resistent gegen Proteasen 9,10.
CWD betrifft, Wild- und Zuchtfisch Elche (Cervus Canadensis), Maultierhirsch (Odocoileus Hemionus), weiß - angebundene Rotwild (WTD; Odocoileus Virginianus), Elch (Alces Alces) und Rentiere (Rangifer Tarandus Tarandus) 11,12,13. Es gilt die ansteckende Prion-Krankheit mit horizontale Übertragung von Cervid Interaktionen und Umwelt Fortbestehen der Infektiosität 14,15begünstigt. Im Gegensatz zu anderen Prion-Krankheiten wo PrPSc Akkumulation und Infektiosität des Gehirns beschränkt sind, in CWD diese finden auch in peripheren Geweben und Körperflüssigkeiten z.B. Speichel, Urin und Kot 16,17, 18.
Immunohistochemistry gilt als der Goldstandard für CWD Diagnose zur Erkennung von PrPSc Verteilung und spongiformen Läsionen 19,20. ELISA und western-Blot sind in seltenen Fällen auch für CWD Diagnostik verwendet. Somit basiert hauptsächlich aktuelle Prion-Krankheit-Diagnose auf der Erkennung von Prionen in Post-Mortem-Geweben. Ante-Mortem-Diagnose für CWD steht mit Mandeln oder Gewebebiopsien Recto-anal Mukosa-assoziierten lymphatischen (RAMALT); aber dieses Verfahren ist invasiv und erfordert die Erfassung der Tiere. Somit wäre die Verwendung von leicht zugänglichen Exemplare, wie Urin und Kot, eine praktische Möglichkeit für CWD Prion-Erkennung. Aber diese Ausscheidungen Hafen relativ niedrige Konzentrationen von Prionen unterhalb der Nachweisgrenze der aktuellen diagnostischen Methoden. Infolgedessen ist ein empfindlicher und hohen Durchsatz-Diagnose-Tool erforderlich. In-vitro- Conversion-Systeme, wie z. B. Protein misfolding cyclic Amplification assay (PMCA) 21, Amyloid Aussaat Assay und Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung (RT-QuIC) Assay 22,23, 24 sind sehr mächtige Werkzeuge, der selbst verbreitende Fähigkeit der PrP-Sc , in Vitro zu imitieren die Prion-Konvertierung zu nutzen und dadurch verstärken die Präsenz der winzige Mengen von PrPSc zu nachweisbaren Konzentrationen 25 ,26. Die RT-QuIC-Methode nutzt jedoch die Tatsache, dass die Konvertierung Produkt bereichert in β-Sheet Sekundärstruktur speziell Thioflavin T (TEN-T) binden kann. Daher wächst rekombinante PrP (rPrP) bei der gesäten Wandlung zu Amyloid-Fibrillen, die Th-T zu binden und können somit in Echtzeit durch die Messung der Fluoreszenz von Th-T ausgedrückt als relative Fluoreszenz Einheiten (RFU) im Laufe der Zeit erkannt werden. Sobald überwacht, kann die RFU verwendet werden, um relative seeding Aktivitäten und quantitative Parameter wie der Lag-Phase zu bewerten. Die Lag-Phase stellt die Uhrzeit (h) erforderlich, um die Schwelle zu erreichen, während die rPrP Umsatz in der frühen Phase der Reaktion unter der Nachweisgrenze der Th-T Fluoreszenz ist. Zum Jahresende die scheinbare Verzögerung Phase, zur Bildung von einem ausreichend Amyloid-Kern (Keimbildung/Dehnung), begleitende tritt auf, wenn die Th-T Fluoreszenz den Schwellenwert überschreitet und wird positiv. Das Wachstum von Amyloid Fibrillen in Echtzeit und die anfängliche PrPSc oder Sämaschinen Aktivität in der Probe enthaltenen nachgewiesen werden können wird durch Segmentierung verstärkt die mehr Samen erzeugt. Diese Samen verursachen wiederum eine raschere exponentielle Wachstumsphase Amyloid Faser.
Da dieser Test so niedrig wie 1 zu erkennen ist fg PrPSc 24, die hohe Empfindlichkeit qualifiziert diese Technik, Ante-Mortem oder nichtinvasive Diagnostik zu erreichen durch das Erkennen von PrPSc in verschiedenen peripheren Geweben, Ausscheidungen oder andere Arten der Probe geringe Infektiosität beherbergen. RT-QuIC bietet auf jeden Fall Vorteile gegenüber anderen Assays für die Reproduzierbarkeit, Funktionalität, Schnelligkeit (weniger als 50 h) und niedrige Kosten im Vergleich zu Bioassays. Es vermeidet die technische Komplexität wie Beschallung in PMCA verwendet; Darüber hinaus wird es in einem Klebeband versiegelt Mikrotestplatte die Gefahr der Aerosol-Kontamination von jedem Bohrloch minimiert durchgeführt. Die Multi-well-Format ermöglicht die Analyse von bis zu 96 Proben im gleichen Experiment. Um das immer wiederkehrende Problem der Fehlalarme und spontanen Umwandlung von rPrP in der in-vitro- Konvertierung Assays zu begegnen ist die Umsetzung ein Grenzwert (Cut-off) in RT-QuIC sehr nützlich. In der Tat ist basierend auf den Ergebnissen der Negativkontrolle (durchschnittliche RFU von negativen Proben + 5 SD 27), eine Baseline eingerichtet, aus denen Diskriminierung zwischen positiven und negativen Proben erfolgen kann. Die Verwendung von vier Wiederholungen für jede Probe kann somit helfen, definieren eine Probe als positiv, wenn mindestens 50 % der Wiederholungen ein positives Signal zeigen, d.h. cross cut-off- 28. Die Homologie zwischen Samen und Substrat ist in RT-QuIC, nicht erforderlich, wie z. B. in einer früheren Studie, Hamster rPrP gefunden wurde, ein empfindlicher Untergrund im Vergleich zu den homologen Substrat in menschlichen PrPvCJD entkernt und Schafen Scrapie ausgesät Reaktionen 29. Hamster-Schafe chimärer rPrP wurde auch vorgeschlagen, um ein gut geeigneter Substrat als menschliche rPrP, menschliche Variante CJD Prionen 30zu erkennen sein. Somit ist die Verwendung von rPrP Substraten aus verschiedenen Arten sehr häufig in diesem Test. Dieser Test wurde erfolgreich auf mehrere Prion-Krankheiten, wie z. B. sporadischer CJD 31,32,33, Gen angewendetSchulrhythmus Prion Krankheiten 34, BSE- 35,36,37, Scrapie 23,36und CWD 38,39,40,41, 42. Studien mit verarbeitet, Liquor, Blut, Speichel und Urin als Samen in RT-QuIC alle erfolgreich waren, PrPSc 38,39,40,41, zu erkennen 42., die Erkennung Fähigkeit in Proben wie Blutplasma zu fördern, die Inhibitoren des Amyloid Bildung enthalten kann Orrú Et Al. (2011) entwickelt eine Strategie, um potentielle Inhibitoren Amyloid Formation entfernen durch Kämmen PrPSc Immunopräzipitation (IP) Schritt und RT-QuIC, benannt "enhanced QuIC" Assay (eQuIC). Darüber hinaus wurde ein Substrat Ersatz Schritt nach ~ 24 h Reaktionszeit beschäftigt, um die Empfindlichkeit zu verbessern. Schließlich, als niedrig wie 1 ag von PrPSc wurde mit eQuIC 30nachweisbar.
Um Kot Extrakte reinigen und entfernen mögliche Assay-Hemmer im Kot, wurden Kotproben von Elch auf experimentelle orale Infektion in präklinischen und klinischen Stadien gesammelt in Puffer mit Wasch- und Protease-Inhibitoren homogenisiert. Die Kot-Extrakte wurden weitere verschiedene Methoden PrPSc in den Proben unter Verwendung Proteinfällung über Natrium Phosphotungstic Acid (NaPTA) Niederschlag konzentrieren vorgelegt. Die NaPTA Niederschlag Methode, erstmals beschrieben von Safar Et al. 43, wird verwendet, um die PrP-Sc in Proben zu konzentrieren. Die Inkubation von NaPTA mit der Probe führt zu bevorzugten Ausfällung von PrPSc anstatt PrPC. Der molekulare Mechanismus ist jedoch noch unklar. Dieser Schritt hat auch geholfen, Eindämmung und Verhinderung der spontanen Umwandlung von rPrP, die in einigen Fällen beobachtet wird. Zu guter Letzt wurden die Kot-Extrakte von optimierten RT-QuIC mit Maus rPrP (aa 23-231) als Substrat und unter anderem Substrat Ablösung im Protokoll zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit getestet.
Die Ergebnisse zeigen, dass diese verbesserte Methode sehr geringe Konzentrationen von CWD Prionen erkennt und die Empfindlichkeit der Erkennung und Spezifität in Stuhlproben im Vergleich zu einem Protokoll NaPTA Niederschlag und Substrat ersatzlos erhöht. Diese Methode kann möglicherweise kann zu anderen Geweben und Körperflüssigkeiten angewendet werden und von großem Nutzen für die CWD Überwachung im wilden und Gefangenschaft Hirschartigen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodisc seringe filters</td>
			<td>PALL</td>
			<td>4652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UCF901024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 10 ml seringe</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA75846-842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vacuum filters</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS M Tube</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guanidine hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12780029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ML9150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K</td>
			<td>PALL</td>
			<td>OD100C34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc sealing tapes</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>232702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>7910-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>342483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>496626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thioflavin T</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-100</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>9410-OP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial buffers and solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BugBuster Master Mix</td>
			<td>Nogagen</td>
			<td>71456-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA superflow</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1018401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Life Technoligies</td>
			<td>P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards and commercial kits</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Express Autoinduction System 1</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>71300-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA protein purification systems FPLC</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-25.50</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman rotor JA-10</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar Omega microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MARS Data Analysis</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism6</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time quaking-induced conversion assay for detection of cwd prions in fecal material

Die RT-QuIC-Technik ist ein sensibler in-vitro- zellfreie Prion Verstärkung Assay basiert hauptsächlich auf die kernigen Fehlfaltung und Aggregation von rekombinanten Prion Protein (PrP) Substrat mit Prion Samen als Vorlage für die Konvertierung. RT-QuIC ist eine neuartige Hochdurchsatz-Technik, analog zur Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Nachweis von Amyloid Fibrille Wachstum basiert auf den Farbstoff Thioflavin T, die auf spezifische Wechselwirkung mit ᵦ-Blatt reichen Proteinen fluoresziert. So kann Amyloid Bildung in Echtzeit erkannt werden. Wir haben versucht, zuverlässige nicht invasive Screening-Test zur Erkennung von chronischen wasting Disease (CWD) Prionen in fäkale Extrakt zu entwickeln. Hier haben wir speziell die RT-QuIC Technik zu offenbaren, dass PrPSc Aussaat Aktivität im Kot von CWD Hirschartigen infiziert. Anfangs war die Sämaschinen Aktivität der fäkalen Extrakte, die wir vorbereitet in RT-QuIC, möglicherweise wegen eines möglichen Assay-Hemmer im fäkalen Material relativ gering. Zur Verbesserung Sämaschinen Aktivität von Kot-Extrakten und entfernen mögliche Assay-Inhibitoren, homogenisiert wir Stuhlproben in einem Puffer mit Wasch- und Protease-Inhibitoren. Wir reichten auch Proben unterschiedlicher Methoden, PrPSc auf der Grundlage von Proteinfällung mit Natrium Phosphotungstic Acid und Zentrifugalkraft zu konzentrieren. Schließlich wurden die Kot-Extrakte durch optimierte RT-QuIC getestet, die Substrat-Ersatz in das Protokoll zur Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit enthalten. So haben wir ein Protokoll für empfindliche Detektion von CWD Prion Aussaat Aktivität im Kot der vorklinischen und klinischen Hirschartigen durch RT-QuIC, die ein praktisches Werkzeug für nichtinvasive Diagnostik der CWD sein kann.

Die CWD fäkale Extrakte vorbereitet bei 10 % (w/V) konnten RT QuIC Reaktion Samen, doch die Nachweisempfindlichkeit war niedrige 27. Mit einem speziellen Puffer für fäkale Homogenisierung war ein entscheidender Schritt, hohe Hintergrundfluoreszenz in RT QuIC begleitende Reaktionen auf die Verwendung der Maus rPrP Substrat zu vermeiden, anstatt Hirsch rPrP ermöglichte man genauere Ergebnisse 27. Die Zugabe von NaPTA Niederschlag verringer...

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Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine einfache, schnelle und effiziente Prion-Verstärkung-Technik, die Echtzeit-Beben-induzierte (RT-QuIC) Konvertierungsmethode beschreiben.

Echtzeit-Beben-induzierte Umwandlung Test zur Erkennung von CWD Prionen in Fäkalien

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Aufrufe.  University of Calgary. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine einfache, schnelle und effiziente Prion-Verstärkung-Technik, die Echtzeit-Beben-induzierte (RT-QuIC) Konvertierungsmethode beschreiben.

Serie: Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Protein Misfolding Cyclic Amplification of Prions

Prions are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein has two distinct isoforms, the non-infectious host-encoded protein (PrPC) and the infectious protein (PrPSc), an abnormally-folded isoform of PrPC 8.
One of the challenges of working with prion agents is the long incubation period prior to the development of clinical signs following host inoculation13. This traditionally mandated long and expensive animal bioassay studies. Furthermore, the biochemical and biophysical properties of PrPSc are poorly characterized due to their unusual conformation and aggregation states.
PrPSc can seed the conversion of PrPC to PrPSc in vitro14. PMCA is an in vitro technique that takes advantage of this ability using sonication and incubation cycles to produce large amounts of PrPSc, at an accelerated rate, from a system containing excess amounts of PrPC and minute amounts of the PrPSc seed19. This technique has proven to effectively recapitulate the species and strain specificity of PrPSc conversion from PrPC, to emulate prion strain interference, and to amplify very low levels of PrPSc from infected tissues, fluids, and environmental samples6,7,16,23 .
This paper details the PMCA protocol, including recommendations for minimizing contamination, generating consistent results, and quantifying those results. We also discuss several PMCA applications, including generation and characterization of infectious prion strains, prion strain interference, and the detection of prions in the environment.

Protein misfolding cyclic amplification (PMCA) is an in vitro assay for the study of prion conversion and strain and species barriers. It can also be used as a prion detection assay.

Proteinfehlfaltungen Cyclic Amplification von Prionen

Prions  are infectious agents that cause the inevitably fatal transmissible spongiform  encephalopathy (TSE) in animals and humans9,18. The prion protein ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Nachweis von microRNAs in Mikroglia durch Real-time PCR in Normal-und ZNS Während Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

Hochdurchsatz-quantitative Echtzeit-RT-PCR-Assay zur Bestimmung Expressionsprofile der Typen I und III Interferon-Formationsglieder

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological malignancies such as childhood acute lymphocytic leukemia. Efforts are currently underway to extend this promising therapy to solid tumors in addition to other hematological cancers. Here, we describe the development and production of potent CAR T cells targeting antigens with unique or preferential expression on solid and liquid tumor cells. The in vitro potency of these CAR T cells is then evaluated in real-time using the highly sensitive impedance-based xCELLigence assay. Specifically, the impact of different costimulatory signaling domains, such as glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (TNFR)-related protein (GITR), on the in vitro potency of CAR T cells is examined. This report includes protocols for: generating CAR T cells for preclinical studies using lentiviral gene transduction, expanding CAR T cells, validating CAR expression, and running and analyzing xCELLigence potency assays.

We describe a quantitative real-time in vitro cytolysis assay system to evaluate the potency of chimeric antigen receptor T cells targeting liquid and solid tumor cells. This protocol can be extended to assess other immune effector cells, as well as combination treatments.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to confirm rabies diagnosis but have only recently been accepted by the OIE (World Organisation for Animal Health) as a primary method to detect rabies infection. Real-time RT-PCR assays provide real-time data, and are closed-tube systems, minimizing the risk of contamination during setup. DNA intercalating fluorochrome real-time RT-PCR assays do not require expensive probes, minimizing the cost per sample, and when the primers are designed in conserved regions, assays that are specific across virus genera rather than specific to just one virus species are possible. Here we describe a pan-lyssavirus SYBR real-time RT-PCR assay that detects lyssaviruses across the Lyssavirus genus, including the most divergent viruses IKOV, WCBV and LLEBV. In conjunction with dissociation curve analysis, this assay is sensitive and specific, with the advantage of detecting all lyssavirus species. The assay has been adopted in many diagnostic laboratories with quality assured environments, enabling robust, rapid, sensitive diagnosis of animal and human rabies cases.

This real-time RT-PCR using dsDNA intercalating dye is suitable to diagnose lyssavirus infections. The method begins with RNA extracted from rabies suspected ante-mortem or post-mortem samples, detailing master mix preparation, RNA addition, setup of the real-time machine and correct interpretation of results.

Pan-lyssavirus Echtzeit RT-PCR für Tollwut-Diagnose

Molecular assays are rapid, sensitive and specific, and have become central to diagnosing rabies. PCR based assays have been utilized for decades to ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician and the patient. A culture is also prone to false negative results from random loss of viability during specimen handling, overgrowth of other fecal flora, and poor growth of several pathogenic Campylobacter species on traditional media. These problems can confound clinical decisions on patient treatment and have limited the field from answering fundamental questions on Campylobacter growth and infections. We describe a procedure that estimates the lower limit of bacterial numbers that can be detected by a culture and a method for quantifying survival of C. jejuni in media used for transport of this fragile organism. Knowing this information, it becomes possible to set clinically relevant detection thresholds for diagnostic tests and address unstudied issues of whether non-symptomatic colonization is prevalent, if co-infection with other enteric pathogens is common, or if bacterial load correlates with symptoms or serious sequelae. The study also included testing of 1,552 prospectively collected patient diarrheal fecal specimens that were initially classified by conventional culture and further tested by a new enzyme immunoassay. Positive and discrepant specimens were then screened by four molecular methods to assign true-positive or true-negative status. The 5 non-culture methods showed complete agreement on all 48 positive and discrepant specimens, while the culture mis-identified 14 (28%). The specimens that were incorrectly identified by culture included 13 false negative and 1 false positive sample. This basic protocol can be used with multiple Campylobacter spp. and will allow the numbers of Campylobacter bacteria that produce symptoms of gastroenteritis in humans to be determined and for prevalence rates to be updated.

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Although stool culture for Campylobacter is imprecise, it is still considered the gold standard for identification. Methods to determine the limit of detection and survival in transport media of C. jejuni in human stool are described and compared with a new immunoassay with better accuracy.

Kulturmethoden zur Bestimmung der Grenze der Detektion und des Überlebens in Transportmedien von Campylobacter Jejuni in humanen Fäkalproben

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Fecal (micro) RNA Isolation

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs from fecal samples of animal and human subjects. The aim is to isolate total RNA with high purity and quantity for downstream analyses such as RNA sequencing, RT-PCR, and micro-array. The advantages of this optimized protocol in the miRNA isolation are capabilities of isolating highly purified RNA products with additional washing steps described, increased quantity of RNA obtained with an improved method in the resuspension of sample, and important tips of decontamination. One limitation is the inability to process and purify larger sample of more than 200 mg as these sample sizes would cause a difficulty in the clear formation of the interphase. Consequently, the large sample size may contaminate the aqueous phase to be extracted as described in the protocol with organic matters that affect the quality of RNA isolated in the end. However, RNA isolates from a sample of up to 200 mg are sufficient for most of downstream analyses.

Fecal micro RNA Isolation

This protocol isolates high quality total RNA from fecal samples of animal and human subjects. A commercial miRNA isolation kit is used with significant adaption to isolate pure RNA with optimized quantity and quality. The RNA isolates are good for most downstream RNA assays such as sequencing, micro-array, and RT-PCR.

Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a large proportion of the infecting bacteria form biofilms within airway sputum. Pa biofilms isolated from CF sputum have been shown to grow in small, dense aggregates of ~10-1,000 cells that are spatially organized and exhibit clinically relevant phenotypes such as antimicrobial tolerance. One of the biggest challenges to studying how Pa aggregates respond to the changing sputum environment is the lack of nutritionally relevant and robust systems that promote aggregate formation. Using a synthetic CF sputum medium (SCFM2), the life history of Pa aggregates can be observed using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and image analysis at the resolution of a single cell. This in vitro system allows the observation of thousands of aggregates of varying size in real time, three dimensions, and at the micron scale. At the individual and population levels, having the ability to group aggregates by phenotype and position facilitates the observation of aggregates at different developmental stages and their response to changes in the microenvironment, such as antibiotic treatment, to be differentiated with precision.

Tools for the Real-Time Assessment of a Pseudomonas aeruginosa Infection Model

Synthetic cystic fibrosis sputum medium (SCFM2) can be utilized in combination with both confocal laser scanning microscopy and fluorescence-activated cell sorting to observe bacterial aggregates at high resolution. This paper details methods to assess aggregate populations during antimicrobial treatment as a platform for future studies.

Werkzeuge zur Echtzeitbewertung eines Pseudomonas aeruginosa-Infektionsmodells

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is one of the most common opportunistic pathogens associated with cystic fibrosis (CF). Once Pa colonization is established, a ...