Multidisipliner grubumuz, bulaşıcı bir proteinin, bir prionun, karmaşık biyolojik görevleri nasıl yerine getirebileceğini anlamaya çalışıyor. Ayrıca, prionların çevrede yıllarca veya on yıllarca nasıl kalabileceğiyle de ilgileniyoruz. Prion dekontaminasyon prosedürlerini takiben, prion inaktivasyonunun etkinliğini belirlemek için sağlam bir yöntem mevcut değildi.
Araştırmamızla bu sorunu çözmeye çalışıyoruz. RT-QuIC ile birleştirilmiş sürüntü alma yöntemi, prion tohumlama faaliyetlerini tespit etmek için çok çeşitli yüzeylerden numune alınmasına izin verir. Bu, laboratuvar, klinik veya çevresel ortamlarda yüzeyle ilişkili prionları tespit etmek için kullanılabilir.
Prionların yüzeylerle nasıl etkileşime girdiğini ve yüzeye bağlı prionların enfeksiyon oluşturmak için gereksinimlerini anlamakla ilgileniyorum. Başlamak için, sürüntü almak için uygun gözetim alanlarını belirleyin ve etiketleyin. Tanımlanan her alan için iki adet 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü hazırlayın ve ilk tüpe 250 mikrolitre DPBS ekleyin, ikincisini boş bırakın.
Köpük uçlu swabları prion kontaminasyonu olmayan bir alanda depodan alın. DPBS'de uygun beyin homojenatları veya BH kullanarak pozitif ve negatif kontrolleri hazırlayın. Temiz eldivenler kullanarak, gerekli sayıda köpük bezi ambalajdan alın ve bunları tutamak tarafı aşağı bakacak şekilde bir tüp rafına yerleştirin.
Uçların diğer yüzeylere temas etmediğinden emin olun. Temiz bir köpük çubuğu sapından tutarak, sürüntü uçlarına ilgili pozitif ve negatif kontrol örneklerinden 50 mikrolitre uygulayın. Makas kullanarak, swabın fazla sapını uzunluğunun yaklaşık yarısına kadar kesin ve köpük ucunu DPBS'ye batırmak için swabı önceden yüklenmiş mikro santrifüj tüpüne yerleştirin.
Temiz bir köpük uçlu çubuğu sapından tutarak, köpük ucunu moleküler dereceli suyla önceden ıslatın ve fazla suyu silkeleyin. Nemli köpük ucunu gözetim için seçilen alana yerleştirin ve sürüntü ucunu yüzeyde aynı anda döndürürken alanı yaklaşık 10 kez ileri geri sürün. Makas kullanarak, swabın fazla sapını uzunluğunun yaklaşık yarısına kadar kesin ve köpük ucunu DPBS'ye daldırmak için swabı önceden yüklenmiş mikro santrifüj tüpüne yerleştirin ve kapağın tamamen kapanmasını sağlayın.
Çapraz kontaminasyonu en aza indirmek için bir sonraki temizleme alanına geçmeden önce eldivenleri atın ve yenileriyle değiştirin. Swab ekstraksiyonu için, mikro santrifüj tüpünü dairesel bir tüp rafına yerleştirin ve rafı fincan boynuzu sonicater su banyosuna daldırın. Tüpün içindeki DPBS'deki köpük çubuğun su yüzeyinin altında olduğundan ve tutamak kısımlarının suya daldırılmadığından emin olun.
Numuneyi beş saniye açık ve beş saniye kapalı döngülerle toplam 15 saniye boyunca sonikleştirin. Sonikasyonun ardından, transferden önce tüpün dibindeki DPBS'yi toplamak için tüpü yaklaşık 15 saniye santrifüjleyin. 250 mikrolitreye ayarlanmış bir P 1000 pipet kullanarak, alttaki tüm sıvı çubuk ekstraktını dikkatlice önceden etiketlenmiş ilgili boş tüpe toplayın.
Swabı içeren kullanılmış tüpü atın. Numuneyi bir vakum yoğunlaştırıcıda konsantre edin, tüp kapağının açık olduğundan emin olun, döngü tamamlandıktan sonra numunenin yalnızca bir pelet kalacak şekilde tamamen konsantre olduğundan emin olun. Peletleri daha fazla kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
RT-QuIC analizi için, doku seyreltme solüsyonunda seyreltilmiş karşılık gelen beyin homojenatları ile negatif ve pozitif bir plaka kontrolü hazırlayın. Şimdi saklanan swab özü peletini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çözün ve kurutulmuş swab ekstraktını pipetleme yoluyla 50 mikrolitre moleküler dereceli su ile yeniden süspanse edin. Kısa bir süre vorteks yapın ve numuneyi oda sıcaklığında bekletin.
İki mikrolitre negatif ve pozitif plaka kontrolünü ve ardından sürüntü ekstraktlarını ilgili RT-QuIC plaka kuyucuklarına yükleyin. Negatif kontrol çubukları, pozitif floresan eşiğini geçmedi ve prosedürler sırasında herhangi bir kontaminasyon olmadığını doğruladı. Pozitif kontrol sürüntü ekstraktları, tüm replike kuyucuklarda tutarlı tohumlama sergiledi ve uygun algılama hassasiyeti gösterdi.
Kontamine olmayan alanlardan alınan yüzey sürüntü örnekleri, eşiğin üzerinde tohumlama göstermedi ve bu da prion negatifliğini doğruladı. Prion ile kirlenmiş yüzeyler, kontrollere kıyasla değişen maksimum nokta oranları ve floresan süreleri ile eşiğin üzerinde tohumlama sergiledi. Ağartıcı ile muamele edilmiş prion ile kontamine yüzeyler RT-QuIC'yi tohumlayamadı ve bu da etkili dezenfeksiyon gösterdi.
Bazı yüzey artefaktları, muhtemelen bir yüzeyde toz veya kalıntı kimyasalların varlığından dolayı potansiyel yanlış pozitifleri gösteren değiştirilmiş kinetik eğriler ve daha uzun floresan süreleri sergiledi.
