Name: evaluating in vitro dna damage using comet assay
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
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Diese Forschung wurde durch das Intramurale Forschungsprogramm des NIH, NCI und CCR unterstützt. Alle Autoren erhielt Intramural Research Grant von NIH, NCI und CCR.

1. bereiten Reagenzien <ol><li>1 X PBS <ol><li>100 mL 10 X PBS mit 900 mL dH 2 O verdünnen und anpassen den pH-Wert 7,4 mit pH-Meter. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol></li> <li>Lyse Lösung (LS) <ol><li>bereiten 2,5 M NaCl, 100 mM Binatrium-EDTA, 10 mM Tris-Base und 200 mM NaOH in 900 mL dH 2 O; häufig dauert es etwa 20 min zu der Mischung vollständig auflösen lassen. Stellen Sie den pH-Wert bis 10 mit dem pH-Meter. Fügen Sie 1 % Natrium Natriumlaurylsulfat Sarcosinate und 1 % Triton x-100, und die letzte Lautstärke bis 1.000 mL. Cool, 4 ° C für mindestens 30 min vor Gebrauch.</li>
	</ol></li> <li>Elektrophorese alkalische Lösung (AES), pH &#62; 13 <ol><li>bereiten 200 mM NaOH und 1 mM Binatrium EDTA in 800 mL dH 2 O. Stellen Sie den pH-Wert und stellen Sie sicher, dass es pH ist &#62; 13. Die letzte Lautstärke bis 1.000 mL. Vor Gebrauch frisch machen und auf 4 ° C für mindestens 30 min vor Gebrauch abkühlen lassen.</li>
	</ol></li> <li>Neutral Elektrophorese Sollution (NES) <ol><li>bereiten Sie 1.000 mL neutral Elektrophorese Puffer durch das Mischen von 100 mM Tris-Base und 300 mM Natriumacetat auf 1.000 mL dH 2 O. Stellen Sie des pH-Werts auf 9,0 mit Eisessig. Cool, 4 ° C für mindestens 30 min vor Gebrauch.</li>
	</ol></li> <li>DNA Niederschlag Lösung (DPS) <ol><li>Vorbereitung von 10 mL 7,5 M Ammonium Acetat Brühe. Mischen Sie für 50 mL DNA Niederschlag Lösung 6,7 mL 7,5 M Ammoniumacetat mit 43,3 mL 95 % igem Ethanol. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol></li> <li>Retikuläres Lösung <ol><li>Add 1 µL 10.000 x grün fluoreszierenden Nukleinsäure-Fleck (z. B. SYBR Green) in 30 mL Tris-EDTA Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM Binatrium-EDTA, pH 7,4) und Store bei 4 ° C. Protect aus Licht.</li>
	</ol></li> <li>1 % niedrig schmelzende Agarose <ol><li>1 % niedrig schmelzenden Punkt Agarose (1 g in 100 mL dH 2 O) in der Mikrowelle schmelzen. Schwenken Sie die Agarose alle 15-20 s, um sicherzustellen, dass die Agarose vollständig geschmolzen ist. Legen Sie die Agarose in 37 ° C Wasserbad für mindestens 20 Minuten vor dem Gebrauch.</li>
	</ol></li> <li>Pre-warme Pipettenspitzen <ol><li>schneiden Sie die schmalen Enden der P200 Pipettenspitzen von 3 mm und bei 37 ° C warmen vor Pipettieren Agarose.</li>
	</ol></li></ol> 2. Bereiten Sie Comet gleitet <ol><li>Slide Beschichtung <ol><li>Schmelze 1 % Agarose (1 g in 100 mL dH 2 O) in der Mikrowelle für 2 – 3 min. oder bis die Agarose vollständig geschmolzen ist. Tauchen Sie die Glas-Objektträger in der Agarose und einer Seite der Folie mit einem fusselfreien Tuch abwischen.</li>
		<li>Legen Sie die Folien auf einer flachen Oberfläche an der Luft trocknen oder Erhitzen bei 50 ° C für schnelleres Trocknen, ein transparente Agarose-Film sollte nach dem Trocknen gebildet werden. Legen Sie die beschichteten Folien in 37 ° C vor dem Gebrauch.</li>
	</ol></li> <li>Vorbereitung der einzelnen Zellsuspensionen <ol><li>Kultur und Genuss der Gliom-Zelle <ol><li>die U251 MG Kulturzellen in DMEM-Ham f-12 Medium ergänzt mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 10 µg/mL Streptomycin bei 37 & # 176; C mit 5 % CO 2.</li>
			<li>Der Zellen mit 1 mL Trypsin für 3 min zu verdauen und Trypsin mit DMEM-Ham f-12 Medium mit FBS neutralisieren. Sammeln in 15 mL-Tube mit 300 X g für 4 min drehen, aspirieren Sie das Medium und Sperren von Zellen bei 2 x 10 5 Zellen/mL in 1 X PBS. 
			Hinweis: Die Zellprobe sollte unmittelbar vor Beginn des Tests vorbereitet sein und alle Proben in einem dunklen oder abgeblendet Umfeld zur Vermeidung von DNA-Schäden aus Licht behandelt werden.</li>
			<li>Kombinieren die Zellsuspension mit 1 % geschmolzenen niedrigen Schmelzpunktes Agarose (bei 37 ° C) im Verhältnis 01:10 (V/V), von oben und unten Pipettieren vorsichtig mischen und sofort pipette 30 µL in eine Folie. Verwenden Sie die Seite von der Pipettenspitze verbreiten die Agarose/Zelle Mischung um die Bildung einer dünnen Schicht gewährleisten.</li>
			<li>Legen Sie die Folie flach bei 4 ° C im Dunkeln für 10 min. erhöht die Vergelung Zeit bis 30 min Einhaltung von Proben in Umgebungen mit hoher Luftfeuchtigkeit verbessert.</li>
			<li>Tauchen die Folie in 4 ° C im Dunkeln für 1 h über Nacht LS.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 3. Einzelne Zelle Elektrophorese <ol><li>weiter zu alkalisch (Schritt 3.2) oder Neutral (Schritt 3.3) Comet assay</li> <li>für alkalischen Comet Assay <ol><li>Entfernen Sie vorsichtig Folien aus dem LS, abtropfen überschüssigen Puffer und sanft Tauchen in AES für 1 h bei 4 ° C erlauben DNA abwickeln. Halten Sie die Folien in der Dunkelheit.</li>
		<li>Add vorgekühlt AES in der Elektrophorese Diahalter nicht mehr als 0,5 cm über die Folien (Dies hängt von der Größe der Elektrophorese Einheiten), legen Sie die Folien innerhalb und mit einer Kappe bedecken. Die Versorgungsspannung auf 1 V/cm (die Länge zwischen den Elektroden) und laufen für 30 min bei 4 ° c</li>
		<li>Abfluss überschüssiger Elektrophorese Lösung aus Folie. Vorsichtig Tauchen Folien zweimal in dH 2 O 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Tauchen sanft Folien in 70 % igem Ethanol für 5 min bei Raumtemperatur. Fahren Sie mit Schritt 4.</li>
	</ol></li> <li>Für neutrale Comet Assay <ol><li>Entfernen Sie vorsichtig die Folien aus dem LS, abtropfen überschüssigen Puffer und sanft Tauchen in NES für 30 min bei 4 ° c halten Sie die Folie im Dunkeln.</li>
		<li>Add vorgekühlt neutral Elektrophorese Puffer in der Elektrophorese Diahalter nicht mehr als 0,5 cm über Folien (Dies hängt von der Größe der Elektrophorese Einheiten), legen Sie die Folien innerhalb und mit einer Kappe bedecken. Die Versorgungsspannung auf 1 V/cm (die Länge zwischen den Elektroden) und laufen für 45 min bei 4 ° c</li>
		<li>Abfluss überschüssigen Puffer von den Folien. Vorsichtig Tauchen Folien in DPS für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Tauchen sanft Folien in 70 % igem Ethanol für 30 min bei Raumtemperatur. Fahren Sie mit Schritt 4.</li>
	</ol></li></ol> 4. Fleck Comet Folien <ol><li>Folien bei 37 ° C für 10-15 min im Dunkeln trocknen.</li>
	<li>Platz 50-100 µL grün fluoreszierenden Nukleinsäure Färbelösung auf jede getrocknete Agarose und Fleck für 15 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Folien in dH 2 O kurz abspülen und trocknen komplett bei 37 ° C im Dunkeln. Weiter zur Bildaufnahme und -Analyse.</li>
</ol> 5. Bild Erfassung und Analyse Hinweis: die Visualisierung und Quantifizierung von DNA-Brüchen basieren auf Epifluoreszenz Mikroskopie und die Comet-Assay-Software (siehe Tabelle der Materialien) 12 .
<ol><li>Legen Sie die Folien auf das Mikroskop mit einem Diahalter. Stellen Sie sicher, dass das Agarosegel auf das Objektiv gerichtet ist. Nach dem Zufallsprinzip die Aufnahmen von den gefärbten Komet-Folien mit dem Fluoreszenzmikroskop mit einem 10 X-Objektiv. Die Kanten und die Gebiete rund um Luftblasen zu vermeiden.</li>
	<li>Stellen Sie sicher jeder Kometenschweif horizontal verteilt wird. Komet Köpfe sollten stammen aus der linken Seite und das Heck von der rechten Seite.</li>
	<li>Speichern Sie jedes Bild in einem binären TIF-Format mit hellen Fleck DNA und dunklem Hintergrund. Laden Sie Bilder in die Software mit der &#34; wählen Sie Dateien zu analysieren &#34; Taste, die auf der linken Seite der Symbolleiste befindet. Fenster ein Bild sollte angezeigt werden ( Abbildung 1).</li>
	<li>Ein Messrahmen auf den Bildschirm zeichnen und seine Größe im Einklang mit der Komet der Zelle anpassen. Klicken Sie auf die &#34; Adjust &#34; Taste, um die Schwelle des Kopfes, Kometen und Rute nach dem Bild einrichten, und klicken Sie dann auf die &#34; Messungen beginnen &#34; Taste ( Abbildung 1).</li>
	<li>Wählen Sie eine Zelle mit dem Rahmen und die Messung durch Anklicken mit der Maus aktivieren die &#34; die Comet Assay &#34; Taste; eine Intensität Bild zeigt sich auf der &#34; Profile &#34; Fenster mit der ausgewählten Messparameter. Die Ergebnisse können gespeichert werden, indem Sie auf das &#34; Ergebnis speichern &#34; Taste ( Abbildung 1). 
	Hinweis: Die Software berechnet die Parameter einschließlich der Länge der Kometenschweif, der Prozentsatz der tailed DNA, die Rute Moment (TM) und der Olive Schweif Moment (OTM). Die Rute Momente werden berechnet, indem die Formeln wie folgt: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" /> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" /></li> <li>mindestens 50 Zellen zu analysieren pro Behandlung.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells.">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li><li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells.">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li><li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+gel/comet+assay:+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing.">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li><li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays.">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li><li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+comet+assay:+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair.">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li><li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy.">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li><li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+targeted+therapy:+The+past+or+future+of+cancer+treatment?.">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?.</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li><li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy.">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157 (2015).</li><li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo.">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li><li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+Repair+in+Cancer:+Beyond+PARP+Inhibitors.">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li><li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair.">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li><li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay.">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li><li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay.">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li><li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair:+principles,+applications,+and+limitations.">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li><li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay.">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200 (2014).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Comet-Assay ist ein effizientes Werkzeug, einzelne- und Doppel-Strang DNA-Brüchen auf zellulärer Ebene zu messen. Der Test wurde weithin als "golden Standard" in Studien zur Genotoxizität und Biomonitoring13, angefangen von base Läsionen, DNA-Querverbindungen, Arzneimittelentwicklung und Alkali-empfindlichen Stellen angewendet. In der vorliegenden Studie zeigten wir zwei unterschiedliche schrittweise Protokolle für alkalische und neutrale Comet Assays, beziehungsweise. Einzelne Zelle Elek...

Die Comet-Assay wurde zuerst von Ostling und Johanson im Jahr 1984 durch den Nachweis, dass die Migration der DNA Fragmente von Kernen in einem neutralen Zustand1entwickelt. Die Technik wurde später von Singh Et Al., zeigen, dass eine alkalische Zustand wesentlich die Spezifität und Reproduzierbarkeit der Assay-2 erhöhtentwickelt. Seitdem die neutrale Comet-Assay ist meist verwendet, um doppelsträngige DNA-Brüchen, zu erkennen, während die alkalischen Comet-Assay empfindlicher für kleinere Mengen von DNA-Schäden ist, darunter Einzel- und Doppelstrang DNA, Alkali labil Websites, DNA-DNA bricht oder Vernetzung der DNA-Protein und DNA-Single-Strangbrüchen verbunden mit unvollständiger Exzision reparieren Websites3,4. Beide Assays ermöglichen die Visualisierung von fragmentierten DNA und bieten eine einfache Möglichkeit, DNA-Schäden quantitativ zu bewerten. Die Comet-Assay gilt als eine empfindliche Methode für in Vitro und in Vivo genetische toxikologischen Studien und ist anwendbar auf verschiedenen Forschungsbereichen wie frühe Arzneimittelkandidat Selektion, Umweltüberwachung, human-Biomonitoring, und grundlegende Forschung auf DNA-Schädigung und Reparatur5.
Das Prinzip des Tests ist, dass unter ein elektrisches Feld, fragmentierte DNA wandert aus dem Nucleoid Körper (auch bekannt als "Komet Kopf") und bildet einen DNA-Fleck in der Agarosegel (auch bekannt als der "Kometenschweif"). Mit Nukleotid Färbung, kann das Ausmaß der DNA-Schädigung durch Analyse "Kometen" durch diese einzelne Zelle Elektrophorese gebildet quantifiziert werden. Berechnung des Augenblicks Tail kann weiterhelfen, um DNA-Schäden unter verschiedenen experimentellen Gruppen zu vergleichen. Verglichen mit traditionellen Methoden der DNA-Schäden-Erkennung, ist der Comet-Assay direkter, sensibler, kostengünstig und relativ einfach.
Strahlentherapie und Chemotherapie sind gemeinsame Strategien zur Behandlung von Krebs durch die Generierung von Einzelstrang und Doppelstrang DNA Brüche in Chromosomen6. Der aktuelle Fortschritt in der DNA-Reparatur-Inhibitoren ermöglicht eine effektivere genotoxische Wirkung von Kombinations-Chemotherapie und daher potentiell reduziert systemischen Nebenwirkungen wie Anämie, Infektionen und Knochenmark Unterdrückung7, 8. in dieser Studie zeigten wir die Untersuchung von einem Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) Inhibitor Olaparib (Ola)9. PARP ist ein reichlich nuklearen Protein und ist verantwortlich für DNA-base Excision Repair durch die Bildung einer Poly (ADP-Ribose) Polymer-10. Temozolomid (TMZ) ist ein Oral verfügbaren Alkylierungsmittel und weithin für Gliom Patientenbehandlung. Durch die Verwendung der Comet-Assay, um DNA-Schäden zu quantifizieren, zeigen wir, dass die Kombination von Olaparib mit Temozolomid zutiefst DNA-Schäden in den Zellen Gliom, erhöht, was darauf, dass Olaparib/Temozolomid Kombinationstherapie ist eine wirksame Strategie zur Gliom, zu behandeln hindeutet, als im Vergleich mit Temozolomid allein11.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS(Ca&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;++&lt;/sup&gt; free)</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Sodium lauryl sarcosinate</td><td>Sigma</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>Sigma</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>Glacial acetic acid</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% ethanol</td><td>WARNER-GRAHAM</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass tissue slides</td><td>ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips</td><td>SHARP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizontal electrophoresis chamber</td><td>TREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>Power supply</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Quincy Lab</td><td>Model 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettor</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

evaluating in vitro dna damage using comet assay

DNA-Schäden ist ein weit verbreitetes Phänomen für jede Zelle während seiner Lebensdauer und ist definiert als eine Veränderung der chemischen Struktur von genomischer DNA. Krebs-Therapien, wie z. B. Strahlen- und Chemotherapie, stellen enorme zusätzliche DNA-Schäden, was zu Zellzyklus Festnahme und Apoptose zu Krebsentwicklung zu begrenzen. Quantitative Bewertung von DNA-Schäden während experimentelle Krebstherapie ist ein wichtiger Schritt um die Wirksamkeit eines genotoxischen Agenten zu rechtfertigen. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf eine einzelne Zelle Elektrophorese Assay, auch bekannt als die Comet-Assay, die einzigen quantifizieren kann und Doppel-Strang DNA bricht in Vitro. Die Comet-Assay ist ein DNA-Schäden Quantifizierungsmethode effizient und einfach durchzuführen, und hat geringen Zeitbudget/Ansprüche und hohe Reproduzierbarkeit. Hier heben wir das Dienstprogramm des Comet-Assays für einer präklinischen Studie durch die Auswertung der gentoxischen Wirkung von Olaparib/Temozolomid Kombinationstherapie U251 Gliom Zellen.

Dieses Protokoll beschreibt Schritt für Schritt Workflow für die Comet Assay Ausführung und Datenanalyse (Abbildung 1). Ergebnisse aus der basischen und neutralen Comet-Assays zeigten, dass der Kometenschweif von Doxorubicin behandelt U251 Zellen (1 µM, 20 h) länger war und hatte eine höhere Intensität der DNA, schlägt eine beträchtliche Ansammlung von fragmentierten DNA aufgrund von Chemotherapie (Abbildung 2).
<p c...

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Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

Die Comet-Assay ist eine effiziente Methode um zu erkennen, dass DNA-Schäden einschließlich Einzel- und Doppelstrang-DNA bricht. Wir beschreiben basische und neutrale Comet Assays zur Messung der DNA-Schäden in den Krebszellen, die therapeutische Wirkung der Chemotherapie zu bewerten.

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

37.1K Aufrufe.  National Cancer Institute. Die Comet-Assay ist eine effiziente Methode um zu erkennen, dass DNA-Schäden einschließlich Einzel- und Doppelstrang-DNA bricht. Wir beschreiben basische und neutrale Comet Assays zur Messung der DNA-Schäden in den Krebszellen, die therapeutische Wirkung der Chemotherapie zu bewerten.

Serie: Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

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Forschung

Krebsforschung

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

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The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

CometChip: A High-throughput 96-Well Platform for Measuring DNA Damage in Microarrayed Human Cells

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular metabolites. Ironically, at high doses DNA damaging agents are also used to treat cancer. The ability to quantify DNA damage responses is thus critical in the public health, pharmaceutical and clinical domains. Here, we describe a novel platform that exploits microfabrication techniques to pattern cells in a fixed microarray. The &#8216;CometChip&#8217; is based upon the well-established single cell gel electrophoresis assay (a.k.a. the comet assay), which estimates the level of DNA damage by evaluating the extent of DNA migration through a matrix in an electrical field. The type of damage measured by this assay includes abasic sites, crosslinks, and strand breaks. Instead of being randomly dispersed in agarose in the traditional assay, cells are captured into an agarose microwell array by gravity. The platform also expands from the size of a standard microscope slide to a 96-well format, enabling parallel processing. Here we describe the protocols of using the chip to evaluate DNA damage caused by known genotoxic agents and the cellular repair response followed after exposure. Through the integration of biological and engineering principles, this method potentiates robust and sensitive measurements of DNA damage in human cells and provides the necessary throughput for genotoxicity testing, drug development, epidemiological studies and clinical assays.

We describe here a platform that allows comet assay detection of DNA damage with unprecedented throughput. The device patterns mammalian cells into a microarray and enables parallel processing of 96 samples. The approach facilitates analysis of base level DNA damage, exposure-induced DNA damage and DNA repair kinetics.

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

DNA damaging agents can promote aging, disease and cancer and they are ubiquitous in the environment and produced within human cells as normal cellular ...

Biotechnik

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other environmental stressors. Use of the comet assay in regulatory testing for genotoxic potential in rodents has been driven by adoption of an Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline in 2014. Comet assay slides are typically prepared from fresh tissue at the time of necropsy; however, freezing tissue samples can avoid logistical challenges associated with simultaneous preparation of slides from multiple organs per animal and from many animals per study. Freezing also enables shipping samples from the exposure facility to a different laboratory for analysis, and storage of frozen tissue facilitates deferring a decision to generate DNA damage data for a given organ. The alkaline comet assay is useful for detecting exposure-related DNA double- and single-strand breaks, alkali-labile lesions, and strand breaks associated with incomplete DNA excision repair. However, DNA damage can also result from mechanical shearing or improper sample processing procedures, confounding the results of the assay. Reproducibility in collection and processing of tissue samples during necropsies may be difficult to control due to fluctuating laboratory personnel with varying levels of experience in harvesting tissues for the comet assay. Enhancing consistency through refresher training or deployment of mobile units staffed with experienced laboratory personnel is costly and may not always be feasible. To optimize consistent generation of high quality samples for comet assay analysis, a method for homogenizing flash frozen cubes of tissue using a customized tissue mincing device was evaluated. Samples prepared for the comet assay by this method compared favorably in quality to fresh and frozen tissue samples prepared by mincing during necropsy. Moreover, low baseline DNA damage was measured in cells from frozen cubes of tissue following prolonged storage.

This protocol describes several procedures for preparing high quality frozen tissue samples at the time of necropsy for use in the comet assay to assess DNA damage: 1) minced tissue, 2) scraped epithelial cells from the gastrointestinal tract, and 3) cubed tissue samples, requiring homogenization using a tissue mincing device.

Verwendung von gefrorenem Gewebe im Kometentest zur Bewertung von DNA-Schäden

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...

Genetik

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been extensively evaluated. Traditional methods are time consuming, expensive, resource intensive and require replicating cells. In contrast, the comet assay, a single cell gel electrophoresis assay, is a faster, non-invasive, inexpensive, direct and sensitive measure of DNA damage and repair. All forms of DNA damage as well as DNA repair can be visualized at the single cell level using this powerful technique.
	The principle underlying the comet assay is that intact DNA is highly ordered whereas DNA damage disrupts this organization. The damaged DNA seeps into the agarose matrix and when subjected to an electric field, the negatively charged DNA migrates towards the cathode which is positively charged. The large undamaged DNA strands are not able to migrate far from the nucleus. DNA damage creates smaller DNA fragments which travel farther than the intact DNA. Comet Assay, an image analysis software, measures and compares the overall fluorescent intensity of the DNA in the nucleus with DNA that has migrated out of the nucleus. Fluorescent signal from the migrated DNA is proportional to DNA damage. Longer brighter DNA tail signifies increased DNA damage. Some of the parameters that are measured are tail moment which is a measure of both the amount of DNA and distribution of DNA in the tail, tail length and percentage of DNA in the tail. This assay allows to measure DNA repair as well since resolution of DNA damage signifies repair has taken place. The limit of sensitivity is approximately 50 strand breaks per diploid mammalian cell 1,2. Cells treated with any DNA damaging agents, such as etoposide, may be used as a positive control. Thus the comet assay is a quick and effective procedure to measure DNA damage.

The comet assay is an efficient way of detecting single- and double-strand breaks, including alkali-labile sites and DNA-DNA/DNA-protein cross-links on the DNA in all cells including hippocampal neurons. The method takes advantage of the differential migration of DNA in an electric field due to differences in amount of DNA damage.

Testen DNA Damage in Hippocampus-Neuronen mit dem Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Neurowissenschaften

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively inert because it has two unpaired electrons located in different pi * anti-bonding orbitals. These two electrons have parallel spins, meaning they rotate in the same direction about their own axes. This is why the oxygen molecule is not very reactive. Activation of oxygen may occur by two different mechanisms; either through reduction via one electron at a time (monovalent reduction), or through the absorption of sufficient energy to reverse the spin of one of the unpaired electrons. This results in the production of reactive oxidative species (ROS). There are a number of ways in which the human body eliminates ROS in its physiological state. If ROS production exceeds the repair capacity, oxidative stress results and damages different molecules. There are many different methods by which oxidative stress can be measured. This manuscript focuses on one of the methods named cell gel electrophoresis, also known as &#8220;comet assay&#8221; which allows measurement of DNA breaks. If all factors known to cause DNA damage, other than oxidative stress are kept constant, the amount of DNA damage measured by comet assay is a good parameter of oxidative stress. The principle is simple and relies upon the fact that DNA molecules are negatively charged. An intact DNA molecule has such a large size that it does not migrate during electrophoresis. DNA breaks, however, if present result in smaller fragments which move in the electrical field towards the anode. Smaller fragments migrate faster. As the fragments have different sizes the final result of the electrophoresis is not a distinct line but rather a continuum with the shape of a comet. The system allows a quantification of the resulting &#8220;comet&#8221; and thus of the DNA breaks in the cell.

Comet assay measures DNA breaks, induced by different factors. If all factors (except oxidative stress) causing DNA damage are kept constant, the amount of DNA damage is a good indirect parameter of oxidative stress. The goal of this protocol is to use comet assay for indirect measurement of oxidative stress.

Comet Assay als ein indirektes Maß für Systemische Oxidativer Stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Biologie

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents is important for protecting public health. The in vivo alkaline comet assay, which detects DNA damage as strand breaks, is especially relevant for assessing the genotoxic hazards of xenobiotics, as its responses reflect the in vivo absorption, tissue distribution, metabolism and excretion (ADME) of chemicals, as well as DNA repair process. Compared to other in vivo DNA damage assays, the assay is rapid, sensitive, visual and inexpensive, and, by converting oxidative DNA damage into strand breaks using specific repair enzymes, the assay can measure oxidative DNA damage in an efficient and relatively artifact-free manner. Measurement of DNA damage with the comet assay can be performed using both acute and subchronic toxicology study designs, and by integrating the comet assay with other toxicological assessments, the assay addresses animal welfare requirements by making maximum use of animal resources. Another major advantage of the assays is that they only require a small amount of cells, and the cells do not have to be derived from proliferating cell populations. The assays also can be performed with a variety of human samples obtained from clinically or occupationally exposed individuals.

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

The alkaline comet assay measures DNA strand breaks in eukaryotic cells. By adding an Endonuclease III or human 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase digestion step, the assay can efficiently detect oxidative DNA damage. We describe methods for using these assays to detect DNA damage in rat liver.

In - vivo - Alkaline Comet Assay und enzymmodifizierten Alkaline Comet Assay zur Messung von DNA - Strangbrüchen und oxidative DNA - Schäden in der Rattenleber

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell function, and therefore DNA damage may play a critical role in the development of, conceivably, all major human diseases, e.g., cancer, neurodegenerative and cardiovascular disease, and aging. Single-cell gel electrophoresis (i.e., the comet assay) is one of the most common and sensitive methods to study the formation and repair of a wide range of types of DNA damage (e.g., single- and double-strand breaks, alkali-labile sites, DNA-DNA crosslinks, and, in combination with certain repair enzymes, oxidized purines, and pyrimidines), in both in vitro and in vivo systems. However, the low sample throughput of the conventional assay and laborious sample workup are limiting factors to its widest possible application. With the "scoring" of comets increasingly automated, the limitation is now the ability to process significant numbers of comet slides. Here, a high-throughput (HTP) variant of the comet assay (HTP comet assay) has been developed, which significantly increases the number of samples analyzed, decreases assay run time, the number of individual slide manipulations, reagent requirements, and risk of physical damage to the gels. Furthermore, the footprint of the electrophoresis tank is significantly decreased due to the vertical orientation of the slides and integral cooling. Also reported here is a novel approach to chilling comet assay slides, which conveniently and efficiently facilitates the solidification of the comet gels. Here, the application of these devices to representative comet assay methods has been described. These simple innovations greatly support the use of the comet assay and its application to areas of study such as exposure biology, ecotoxicology, biomonitoring, toxicity screening/testing, together with understanding pathogenesis.

The comet assay is a popular means of detecting DNA damage. This study describes an approach to running slides in representative variants of the comet assay. This approach significantly increased the number of samples while decreasing assay run-time, the number of slide manipulations, and the risk of damage to gels.

Ein Hochdurchsatz-Comet-Assay-Ansatz zur Beurteilung zellulärer DNA-Schäden

Cells are continually exposed to agents arising from the internal and external environments, which may damage DNA. This damage can cause aberrant cell ...

Alkaline Single Cell Gel Electrophoresis: A Sensitive Technique for Quantitative Estimation of DNA Damage in Individual Cancer Cells Following Chemotherapy

Source: Lu, Y., et al. <a href="https://www.jove.com/v/56450">Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate an alkaline single-cell electrophoresis assay to quantify both single- and double-strand DNA breaks in doxorubicin-treated cells. Alkaline conditions disrupt the hydrogen bonds between DNA base pairs, resulting in the complete unwinding and separation of DNA strands. This allows differential migration of undamaged and damaged DNA fragments in agarose gel upon electrophoresis, revealing a comet-shaped structure of slowly migrating undamaged DNA forming the circular comet head, and rapidly migrating damaged DNA fragments forming the elongated comet tail.

Basische Einzelzell-Gelelektrophorese: eine empfindliche Technik zur quantitativen Abschätzung von DNA-Schäden in einzelnen Krebszellen nach Chemotherapie

Source: Lu, Y., et al. Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate an alkaline single-cell ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Electrophoresis Techniques

Comet Assay for DNA Damage Detection in Cells

Source: Ji, Y., et al. <a href="https://app.jove.com/v/63559">A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage.</a> J. Vis. Exp. (2022).
The video demonstrates the comet assay for detecting DNA damage following exposure to harmful agents. Under alkaline conditions, the DNA unwinds and denatures, and upon electrophoresis, the undamaged and damaged DNA migrate differently in the agarose gel, forming a comet-shaped structure. The slowly migrating undamaged DNA forms the circular comet head, while the rapidly migrating damaged DNA fragments form the elongated comet tail.

Comet Assay zur Detektion von DNA-Schäden in Zellen

Source: Ji, Y., et al. A High-Throughput Comet Assay Approach for Assessing Cellular DNA Damage. J. Vis. Exp. (2022).
The video demonstrates the comet ...