IGBMC yüksek işlem hacmi sıralama tesis, "Fransa Génomique" Konsorsiyumu (ANR10-INBS-09-08) bir üyesi ve tüm IGBMC genel Hizmetleri tüm personel özellikle IGBMC hayvan tesis personel teşekkür ediyoruz. Bu eser CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le kanser gelen hibe tarafından desteklenen, Fransız Fonu aracılığıyla ANR programı ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 etiketli Investissements d'Avenir altında devlet ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu. S.J Ministère de l'Enseignement tarafından desteklenen Ligue Nationale contre le kanser ve ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 ve V.U tarafından et de la Recherche. Ligue Nationale contre le kanser bir 'équipe labellisée' kimliğidir.

fareler sürekli bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ile ilgili Kurumsal yönergelere uygun olarak ve uygun olarak ulusal hayvan bakım kuralları (Avrupa Komisyonu yönergesi 86/609/CEE; Fransızca kararname no.87-848). Tüm yordamları Fransız Ulusal Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
 1. yalıtım kas dokusu <ol><li>kurban bir yetişkin 6 8 haftalık için fare ile servikal çıkığı. Sterlise % 70 etanol ile durulama tarafından bacak ve para cezası nokta makas ve forseps kullanarak arka bacak kasları (gastroknemius, Tibialis önünde, Quadriceps) teşrih. 
	Not: Bir fare yaklaşık 500 mg doku verim.</li>
	<li>2 mL içeren homojen bir hazırlık küçük buz gibi Hipotonik arabelleğe 1 mL tüp bebek kaslarında kıyma (&#60; 2-3 mm 3) kullanarak adet ince makas ve tezgah üst karıştırıcı 5-10 dakika süreyle 4 ° C'de sallayarak tüp terk</li>
</ol> 2. Doku lizis Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
<ol><li>Homogenate 14 mL yuvarlak alt tüp aktarmak ve 5 mL soğuk Hipotonik arabellekte (EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyl ve PMSF) resuspend.
	<ol><li>Homogenise 15-30 s yuvarlak alt 14 mL tüpler için gevşek dounce (3 dakika içinde 20-30 vuruş) veya mekanik doku homogenizer kullanarak kıyılmış kas dokusu. 
		Not: Lizis verimliliğini tarafından ışık mikroskobu bu aşamada tespit edilebilir ve gerekirse, ek kesinti yapılabilir.</li>
	</ol></li> <li>Homogenate 15 mL tüpler için transfer ve 10 mL soğuk Hipotonik arabellek kullanarak birime doldurun. Sonraki fare ile devam etmeden önce aşağıda açıklandığı gibi homogenate saptamak.</li>
</ol> 3. Fiksasyon <ol><li>formaldehit % 1 son toplama eklemek ve oda sıcaklığında 10 dakika çalkalanır.</li>
	<li>Glisin 0,125 M son bir konsantrasyon fiksasyon ve sallamak için oda sıcaklığında 5-10 dk durdurmak için her tüpün ekleyin.</li>
</ol> 4. Çekirdeklerin hazırlık Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
<ol><li>Sabit lysate gevşek dounce (5-10 vuruş) kullanarak Homogenise.
	<ol><li>15 mL tüp ve 1000 x g, santrifüj 4 ° C'de 5 min için çekirdek ve hücresel enkaz elde etmek için transfer.</li>
	</ol></li> <li>Süpernatant kaldırmak ve Pelet taze 5 mL Hipotonik arabellekte resuspend. Lysate 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla 50 mL tüp içine filtre. Filtrate 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla yeniden filtre.</li>
	<li>Transfer filtrate 15 mL tüp ve santrifüj 1000 x g de 4 ° C'de nükleer Pelet elde etmek için 5 dakika. 
	Not: Bu aşamada çekirdeklerin hemen sonicated veya sıvı azot kuru bir Pelet donmuş ve-80 depolanan yaslama ° C.</li>
</ol> 5. Sonication <ol><li>nükleer Pelet (makine ve dounce homojenizasyon için yaklaşık 50 µL) hacmi değerlendirmek ve sonication tampon 3-4 kez Paketli nükleer birimin kadar resuspend ve bir sonicator kullanarak 4 ° C'de 10-15 dk için solüsyon içeren temizleyicide . 
	Not: Kromatin olabilir (6) aşağıda açıklandığı gibi hemen analiz veya dondurulmuş ve-80 depolanan ° C.</li>
</ol> 6. Kromatin parça boyutu Sonication takip değerlendirirken Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
<ol><li>İçin de-crosslink, Kromatin 30 µL 1,5 mL tüp içinde alıp 20 µL 5 M NaCl. 500 µL birime tamamlamak ve 65 ° C'de gecede kuluçkaya.
	<ol><li>Ertesi gün, bir tedavi (20 mg/mL stok), 10 µL 2 M Tris pH 6.8 ve 10 µL 0,5 M EDTA 42 ° C. gerçekleştir fenol-kloroform/kloroform ayıklama, 1 h, 1 µL İndinavir K ile gerçekleştirmek ve sodyum acetat 1 hacmi ile DNA çökelti e (3 M) ve 2 cilt % 100 etanol için bir h-80 ° C'de veya gecede -20 ° c</li>
	</ol></li> <li>DNA tarafından Santrifüjü 13.500 x g 15 dk. Decant süpernatant de cips ve Pelet soğuk % 70 etanol ve 5 dk. Decant süpernatant için tekrar santrifüj ile iyice yıkayın ve Pelet kuruması.</li>
	<li>Pelet TE arabellek özgün birimi (30 µL) içinde resuspend. 260 nm/280 nm Absorbans tarafından bir Spektrofotometre DNA konsantrasyon ölçmek. 500-1000 ng DNA ile birlikte ayrı bir % 1.5 özel jel hatlarının bir DNA boyutu merdiven pipette ve Elektroforez Kromatin parçası boyutunu değerlendirmek için gerçekleştirin. 
	Not: Parça boyutu 200-500 baz çifti arasında olmalıdır ve sigara - ya da kötü-parçalanmış için DNA karşılık gelen parçaları yok algılanabilir yüksek molekül ağırlıklı olmalıdır. Gerekirse, Kromatin çözüm (5. adım) daha uzun bir süre için yeniden sonicated olabilir ve en uygun boyutu elde edilir kadar yukarıda açıklandığı gibi yeniden analiz.</li>
</ol> 7. Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) Not: tüm besteleri arabellek için Tablo 1 ' e bakınız.
<ol><li>Blok Protein G sepharose boncuk aliquoting 1 mL etanol içinde % 50 Bulamaç tarafından. Santrifüjü 400 x g 1 min bir benchtop için de tarafından boncuk santrifüj kapasitesi ve TE arabellek santrifüj 400 x g, 1 mL ile yıkayın ve yıkama tekrar Pelet
	<ol>Sonra ikinci Santrifüjü, yeniden askıya alma 1 ml çip seyreltme arabelleği 25 µL BSA (hisse senedi 20 mg/mL) ile ve 20 µL tRNA (hisse senedi 10 mg/mL) Maya <li>. Döndürme (40-60 rpm) 4 tarafından en az 2 kullanılmadan önce s boncuk engellemek ° C.</li>
		<li>Seyreltik 50 µg Kromatin (5. adım), 8-10 kez çip seyreltme tampon kullanarak. Engellenen boncuk Bulamaç 50 µL ekleyin ve 4'te (40-60 rpm) dönen 2s için kuluçkaya ° C. santrifüj 400 x g 4 ° C'de önceden temizlenmiş Kromatin elde edilir ve taze bir tüp transferi de.</li>
	</ol></li> <li>İmmunoprecipitation için birincil antikor (örneğin, 1-2 µg Kromatin 10 µg başına) uygun miktarda ekleyin ve gecede 4 döndürme kuluçkaya ° C. 
	Not: Antikor en uygun miktarda tedarikçi tarafından tavsiye edilebilir veya ampirik olarak optimum zenginleştirme görülmektedir kadar ChIP-qPCR antikor farklı miktarlarda ile gerçekleştirerek belirlenebilir. Ayrıca Protein G sepharose Protein A sepharose alt türü kullanılan antikor bağlı olarak değiştirilebilir.</li>
	<li>Engellenen boncuk ertesi gün eklemek ve döndürme (40-60 rpm) 4 1 h için kuluçkaya ° C. santrifüj 400 x g 20-30 s boncuk cips, süpernatant kaldırmak ve çip başlamak için de yıkar.</li>
	<li>ChIP yıkama: arabellekleri ile aşağıdaki yıkar gerçekleştirmek: bir kez düşük Salt arabellek ile ve sonra iki kez LiCl arabelleği, ile iki kez yüksek Salt arabellek ile ve son olarak iki kez TE arabelleği ile.
	<ol><li>Döndürme (40-60 rpm) 4 ° C'de 10 dakika her yıkama gerçekleştirmek ve boncuk Santrifüjü 400 x g 20-30 s bir tezgah üstü santrifüj içinde de tarafından her yıkama arasında cips.</li>
	</ol></li> <li>Elüsyon için son yıkama kaldırmak ve sallayarak süre 15 dakika oda sıcaklığında (taze hazırlanmış) 250 µL elüsyon arabelleği boncuk resuspend.</li>
	<li>Santrifüj 400 x g ve toplamak yeni bir tüp eluate. Bu adım iki kez ve daha sonra de-crosslink eluate gecede 20 µL NaCl 5 M ve 1 µL RNase A ile gerçekleştirmek (10 mg/mL), İndinavir K ve fenol-kloroform/kloroform NG ile tedavihareket olduğu gibi adım 6.</li>
	<li>TE arabellek 50 µL içinde resuspend ve aliquots ChIP-qPCR için standart protokolleri 15 göre çip kalitesini kontrol etmek için kullanın.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq.">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li><li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAF4,+a+subunit+of+transcription+factor+II+D,+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation.">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613 (2014).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells.">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530 (2010).</li><li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington's+disease+mice.">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li><li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo.">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).</li><li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).</li><li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue.">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513 (2012).</li><li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression.">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li><li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling.">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li><li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes.">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li><li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation.">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li><li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada Kromatin yetişkin fare iskelet kasları ve gösteri bu Kromatin transkripsiyon faktörü bağlama ve kovalent Histon değişiklikler kas lif çekirdeği tespit çip deneyleri için uygun hazırlanması için yeni bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı birkaç kritik adımları içerir. İlk dounce veya mekanik kesme tarafından gerçekleştirilen doku bozulma 's. Mekanik Kesme daha hızlı ve daha tekrarlanabilir ve bu nedenle yönteminin seçimi. Hiçbir uygun cihazı varsa, yine de, bozulma da douncing...

Kromatin immunoprecipitation (ChIP) kantitatif Polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) birleştiğinde ve yüksek işlem hacmi sıralama (ChIP-seq) transkripsiyon çalışmaya seçim yöntemleri ve epigenetik gen ekspresyonu çeşitli dokularda düzenlenmesi olmuştur ve hücre-tip1. Bu teknik genom çapında kovalent Kromatin değişiklikler, Histon varyant doluluk ve transkripsiyon faktörü bağlama2,3profil oluşturma sağlar.
ChIP kültürlü hücrelerden performans iyi kurulmuş olmakla birlikte, küçük parça--dan memeli dokulara daha zor kalır. Kromatin küçük parça için hazırlanıyor her doku ve hücre türü için optimize edilmiş olması gereken birkaç kritik adımları içerir. Kromatin kültürlü hücre hücresel lysates veya kendi çekirdek aşağıdaki arıtma hazırlanabilir. Memeli dokular söz konusu olduğunda, verimli lizis, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri arıtma Kromatin en iyi kurtarma sağlamak için önemlidir. Ayrıca, deneysel olarak belirlenecek önce veya sonra kendi arıtma çekirdeklerin düzeltmek seçeneği vardır. Bu engellerin rağmen çip başarıyla karaciğer, testis veya beyin4,5,6gibi dokularda üzerinden yapıldı. İskelet kası durumunda bozulma dokusunun yapısal proteinlerin yüksek bir içerik ve izolasyon-in onun çekirdeği sergileyen böyle bir fiziksel olarak dayanıklı, özellikle zorlu 's. Bu özgüllüğü göz önüne alındığında, diğer dokular için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları tatmin edici sonuçlar iskelet kasları için vermeyin.
Burada ChIP-grade Kromatin fiziksel olarak doku, formaldehit fiksasyon ve çekirdekleri ve sonication yalıtım engellemeden içerir fare iskelet kas dokusundan izole etmek için bir protokol açıklayın. Kromatin bu dokudan küçük parça için uygun hazırlamak için bu yöntem verimliliğini çeşitli transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler7için ChIP-qPCR ve ChIP-seq gerçekleştirerek gösterilmiştir.
Bu yeni teknik uzun collagenase sindirim adımları hangi zaman, genomik transkripsiyon faktörleri lokalizasyonu değişimler sırasında oluşan bir daha önce raporlanmış protokolü8 ' den çok daha hızlı ve değişiklikler gen ifadesinin içinde yer alabilir. Hangi ile çekirdekleri izole ve sabit hız burada açıklanan yöntemi daha sadakatle yerli genomik doluluk durumu yakalar Kromatin hazırlamak özellikle cazip kılıyor. Ayrıca, Kromatin yalıtım veya protein kas dokusunun çıkarılması için diğer yöntemleri olmasına rağmen açıklanan8,9,10 edilmiş ve seçili genler, hiçbir çip seq üzerinde ChIP-qPCR deneyler için kullanılan veri bunları kullanarak rapor edildi. Rapor burada yöntem transkripsiyon faktörü ve Histon değişikliği için ChIP-seq uygundur ve bu nedenle de 3/4 C veya hıc Kromatin conformation yakalama uygulamaları için uygun olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose beads</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde EM grade</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>yeast tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Blue</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Antibody</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Antibody</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Focused Ultrasonicator</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional items&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m and 40 &amp;mu;m cell strainers (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

Biz Kromatin yetişkin fare iskelet kası, yapısal proteinler yüksek bir içerik ile fiziksel olarak dayanıklı bir doku üzerinden hazırlanması için verimli ve tekrarlanabilir bir protokol tanımlamak. Disseke bacak kasları yetişkin fareler üzerinden fiziksel olarak mekanik homojenizasyon veya kıyma ve douncing, önce formaldehit fiksasyon lysate hücrenin Hipotonik arabellekte bir arada tarafından bozulur. Sabit çekirdek mekanik homojenizasyon veya douncing ve hücre artıkları kaldırmak için sıralı filtrations daha fazla döngüleri tarafından saf. Arıtılmış çekirdeklerin hemen veya daha sonraki bir aşamada donma sonra sonicated. Kromatin verimli bir şekilde sonicated ve transkripsiyon faktörleri, RNA polimeraz II ve kovalent Histon değişiklikler için uygun Kromatin immunoprecipitation deneyleri için profilleri tarafından gösterildiği gibi elde edilir. Bu iletişim kuralı tarafından hazırlanan Kromatin kullanarak tespit bağlama olayları ağırlıklı olarak kas lif çekirdeği Kromatin fiber ilişkili diğer uydu ve endotel hücreleri varlığı rağmen meydana bunlar. Bu iletişim kuralı bu nedenle yetişkin fare iskelet kas gen düzenlemesi çalışmaya adapte.

Çekirdeklerin izole etmek için biz disseke ve kıyılmış kas dokusunun mekanik homojenizasyon 18.000 ve 22.000 RPM ( Tablo malzemelerigörmek) 15 veya 45 s için gerçekleştirilen. Her koşulda, çekirdeği doku enkazı ayrılmış ama verimi düşük hız (şekil 1A-B) kullanarak en uygun olan. Çekirdek de hazırlıklı douncing tarafından 3-5 dk (şekil 1Ave veri gösterilmez) ama mekani...

Watch this Scientific Journal Video about Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

Kromatin yetişkin fare iskelet kas kas lifleri gen düzenlemesi çalışmanın Kromatin immunoprecipitation tarafından uyarlanmış üzerinden hazırlanması için yeni bir protokol sunulmuştur.

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K Görüntüleme.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. Kromatin yetişkin fare iskelet kas kas lifleri gen düzenlemesi çalışmanın Kromatin immunoprecipitation tarafından uyarlanmış üzerinden hazırlanması için yeni bir protokol sunulmuştur.

Video: Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Genetik

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

Kromatin İmmunopresipitasyon için Çapraz Bağlı İskelet Kasında Yüksek Kaliteli Nükleerlerin Hazırlanması İçin Filtrasyona Dayalı Bir Yöntem

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Biyokimya

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Fare Uzuv Kaslarından Uydu Hücre İzolasyonu ve Akış Sitometrisi Analizi

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

Yazar Spotlight: Fare Kas Kök Hücrelerinde Sistrom Analizi 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&amp;RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Gelişim Biyolojisi

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Kromatin Immunoprecipitation üzerinden fare kas iskelet için geliştirilmiş iletişim kuralı

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fare T-hücresi Hatlarında Kromatin İmmünopresipitasyonu (ChIP)

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokolü için düşük-bereket embriyonik örnekleri

Kromatin İmmunopresipitasyon için Çapraz Bağlı İskelet Kasında Yüksek Kaliteli Nükleerlerin Hazırlanması İçin Filtrasyona Dayalı Bir Yöntem

Histon değişiklikler Saccharomyces cerevisiae üzerinden Kromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Kromatin Immunoprecipitation fare kahverengi yağ dokusunun

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi