Name: improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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Wir bedanken uns bei allen Mitarbeitern des IGBMC Hochdurchsatz-Sequenzierung Anlage, ein Mitglied des Konsortiums "Frankreich-Génomique" (ANR10-INBS-09-08) und alle IGBMC allgemeine Dienstleistungen insbesondere das Personal der IGBMC Tierhaltung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem CNRS, INSERM, AFM, der Ligue Nationale Contre le Cancer, die französische staatliche Fonds durch die ANR im Rahmen des Programms Investissements Avenir gekennzeichnet ANR-10-IDEX-0002-02, die Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 und die ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. S.J wurde unterstützt von der Ligue Nationale Contre le Cancer und die ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 und V.U durch das Ministère de nannte et De La Recherche. ID ist ein 'Équipe Labellisée' der Ligue Nationale Contre le Cancer.

Mäuse gehalten wurden, im Einklang mit den institutionellen Richtlinien zur Pflege und Verwendung von Labortieren und nationale Tier-Pflege-Richtlinien (Europäische Kommission Richtlinie 86/609/EWG; Französischen Dekret Nr. 87-848). Alle Verfahren wurden von der französischen nationalen Ethikkommission genehmigt.
 1. Isolation von Muskelgewebe <ol><li>Opfer eines Erwachsenen 6 bis 8 Wochen altes Baby Maus durch zervikale Dislokation. Sterlise der Extremität durch Spülen mit 70 % Ethanol und sezieren die hinteren Gliedmaßen Muskeln (Gastrocnemius, m. Tibialis Anterior, Quadrizeps) mit feinen Spitze Schere und Zange. 
	Hinweis: Sollte eine Maus etwa 500 mg des Gewebes ergeben.</li>
	<li>Hackfleisch die Muskeln in einem 2 mL Reagenzglas mit 1 mL eiskaltes hypotone Puffer, um eine homogene Zubereitung von kleinen (&#60; ca. 2-3 mm 3) Stücke mit feinen Schere und verlassen das Rohr schütteln auf einer Bank Top Rührwerk bei 4 ° C für ca. 5-10 min.</li>
</ol> 2. Gewebe-Lyse Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.
<ol><li>Das Homogenat in einem 14 mL Rundboden Röhrchen zu übertragen und in 5 mL kalte hypotone Puffer (EDTA-freie Protease-Inhibitor cocktail und PMSF) Aufschwemmen.
	<ol><li>Homogenise das Hackfleisch / Muskelgewebe mit einer lockeren Dounce (20-30 Schläge innerhalb von 3 Minuten) oder eine mechanische Gewebe-Homogenisator für 15-30 s in 14 mL Rundboden Röhrchen. 
		Hinweis: Die Effizienz der Lyse in diesem Stadium durch Lichtmikroskopie beurteilt werden kann und bei Bedarf zusätzliche Störungen durchgeführt werden kann.</li>
	</ol></li> <li>Das Homogenat in 15 mL-Tuben und Lautstärke auf 10 mL mit kalten hypotone Puffer zu füllen. Das Homogenat zu beheben, wie unten beschrieben, bevor Sie mit der nächsten Maus.</li>
</ol> 3. Befestigung <ol><li>1 % Endkonzentration Formaldehyd hinzu und schütteln Sie für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>In jedem Röhrchen, Fixierung und schütteln für 5-10 min bei Raumtemperatur zu stoppen eine Endkonzentration von 0,125 M Glycin hinzufügen.</li>
</ol> 4. Kerne Vorbereitung Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.
<ol><li>Homogenise die feste lysate mit einem losen Dounce (5-10 Schläge).
	<ol><li>Übertragung eine 15 mL Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C, Kerne und Zelltrümmer zu erhalten.</li>
	</ol></li> <li>Den Überstand zu entfernen und das Pellet in frischen 5 mL Hypotonische Puffer aufzuwirbeln. Filtern der lysate durch ein Sieb 70 µm Zelle in ein 50 mL-Tube. Filtern Sie erneut das Filtrat durch ein Sieb 40 µm Zelle.</li>
	<li>Transfer das Filtrat eine 15 mL Tube und Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 Minuten bei 4 ° C, das nukleare Pellet zu erhalten. 
	Hinweis: In diesem Stadium die Kerne können sofort beschallt oder fangen, als eine trockene Pellets in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 gelagert ° C.</li>
</ol> 5. Ultraschall <ol><li>das Volumen des nuklearen Geschosses (rund 50 µL für Maschinen- und Dounce Homogenisierung) zu bewerten und in Beschallung Puffer bis zu 3 bis 4 Mal von nuklearen Packvolumen Aufschwemmen und beschallen für 10-15 min bei 4 ° C mit einem Sonikator . 
	Hinweis: Das Chromatin kann sofort analysiert, wie unten (6) beschrieben oder eingefroren und bei-80 ° c</li>
</ol> 6. Beurteilung der Chromatin-Fragmentgröße nach Beschallung Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.
<ol><li>, De-Crosslink, 30 µL des Chromatins im Reagenzglas 1,5 mL und fügen 20 µL 5 M NaCl. Füllen Sie das Volume 500 µL und über Nacht bei 65 ° C inkubieren.
	<ol><li>Am nächsten Tag, führen Sie eine Behandlung mit 1 µL Proteinase K (20 mg/mL Brühe), 10 µL 2 M Tris pH 6,8 und 10 µL 0,5 M EDTA für 1 h bei 42 ° c führen eine Phenol-Chloroform/Chloroform Extraktion und überstürzen sich die DNA mit 1 Volumen von Natrium-acetat e (3 M) und 2 Bände von 100 % Ethanol für 1 h bei-80 ° C oder über Nacht bei-20 ° c</li>
	</ol></li> <li>Pellet-DNA durch Zentrifugation bei 13.500 x g für 15 min. Dekantieren des Überstandes, waschen das Pellet gründlich mit kaltem 70 % igem Ethanol und Zentrifuge wieder für 5 min. Dekantieren des Überstandes und an der Luft trocknen die Pellet.</li>
	<li>Aufschwemmen der Pellets in das ursprüngliche Volume (30 µL) von TE-Puffer. Die DNA-Konzentration in einem Spektralphotometer durch Absorption bei 260 nm/280 nm zu messen. Pipette 500-1.000 ng DNA zusammen mit einem DNA-Größe Leiter auf getrennten Bahnen eine 1,5 % Agarose-Gel und Elektrophorese zur Beurteilung der Fragmentgröße des Chromatins führen. 
	Hinweis: Fragmentgröße sollte zwischen 200-500 Basenpaaren, und es darf keine nachweisbaren hochmolekularen Fragmente entspricht, nicht oder schlecht-fragmentierten DNA. Bei Bedarf kann die Chromatin-Lösung (Schritt 5) wieder für eine längere Zeit beschallt und analysiert dann erneut wie oben beschrieben, bis die optimale Größe erreicht ist.</li>
</ol> 7. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Hinweis: siehe Tabelle 1 für alle Kompositionen Puffern.
<ol><li>Block Eiweiß G Sepharose Perlen durch Aliquotierung 1 mL 50 % Gülle in Ethanol. Pellets die Perlen durch Zentrifugation bei 400 X g für 1 min in einem Benchtop Zentrifugieren und waschen mit 1 mL TE-Puffer-Zentrifuge bei 400 X g und wiederholen Sie die Wash
	<ol><li>, Nachdem der zweite Zentrifugation, neu in 1 mL der ChIP Verdünnungspuffer mit 25 µL der BSA (Lager 20 mg/mL) und 20 µL tRNA (Lager 10 mg/mL Hefe). Blockieren Sie die Perlen für mindestens 2 Stunden vor der Verwendung durch Rotation (40-60 u/min) bei 4 ° c</li>
		<li>Verdünnen 50 µg des Chromatins (Schritt 5) 8 bis 10 Mal mit ChIP Verdünnungspuffer. Fügen Sie 50 µL blockierte Wulst Gülle und inkubieren 2 h drehen (40-60 u/min) bei 4 ° C. Zentrifuge bei 400 X g bei 4 ° C zu erhalten bereits geräumten Chromatin und überträgt es auf ein frisches Tubus.</li>
	</ol></li> <li>Für Immunopräzipitation, fügen Sie die entsprechende Menge an primären Antikörper (z. B. 1-2 µg pro 10 µg von Chromatin) und inkubieren Sie über Nacht mit Rotation bei 4 ° c 
	Hinweis: Die optimale Menge des Antikörpers kann vom Lieferanten empfohlen werden oder kann durch ChIP-qPCR mit unterschiedlichen Mengen von Antikörpern durchführen, bis optimale Bereicherung beobachtet wird empirisch ermittelt werden. Auch Eiweiß G Sepharose durch Protein A Sepharose je nach Subtyp des Antikörpers verwendet ersetzt werden kann.</li>
	<li>Fügen Sie die gesperrten Perlen am nächsten Tag und inkubieren Sie für 1 h mit Drehung (40-60 u/min) bei 4 ° C. Zentrifuge bei 400 X g für 20-30 s pellet-die Perlen, überstand zu entfernen, und starten den ChIP wäscht.</li>
	<li>ChIP Wäschen: führen Sie die folgenden Waschungen mit dem Puffer: einmal mit niedrig-Salz-Puffer, und dann zweimal mit hohen Salz Puffer, zweimal mit LiCl Puffer, und schließlich zweimal mit TE-Puffer.
	<ol><li>Jedem Waschgang für 10 min mit Drehung (40-60 u/min) bei 4 ° C durchführen und die Perlen zwischen jedem Waschgang durch Zentrifugation bei 400 X g für 20-30 s in einer Zentrifuge Benchtop-pellet.</li>
	</ol></li> <li>Für Elution, entfernen die letzten Wäsche und die Perlen in 250 µL Elution Buffer (frisch zubereitet) für 15 min bei Raumtemperatur unter Schütteln Aufschwemmen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 400 x g und sammeln das Eluat in einem frischen Rohr. Führen Sie diesen Schritt zweimal und dann de-Crosslink das Eluat über Nacht mit 20 µL NaCl 5 M und 1 µL RNase A (10 mg/mL), Proteinase K und Phenol-Chloroform/Chloroform Extr behandelnhandeln wie in Schritt 6.</li>
	<li>In 50 µL TE-Puffer Aufschwemmen und Aliquote für ChIP-qPCR nach Standardprotokollen 15 um die Qualität des Chips.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll für die Zubereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskeln und zeigen, dass das Chromatin für ChIP Experimente geeignet ist, die Transkription Faktor Bindung und kovalente Histon-Modifikationen in den Muskelfaser-Kernen zu erkennen. Dieses Protokoll beinhaltet mehrere kritische Schritte. Die erste ist Gewebe Störungen, die durch Dounce oder durch mechanische Scherung erfolgen kann. Mechanische Scherung ist schneller und mehr reproduzierbar, und ist daher die Met...

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) mit quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gekoppelt und Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-Seq) geworden, die Methoden der Wahl Transkription zu studieren und epigenetischen Regulation der Genexpression in verschiedenen Geweben und Zelltypen1. Diese Technik erlaubt es genomweiten Profilierung der kovalente Chromatin Änderungen, Histon Variante Belegung und Transkription Faktor Bindung2,3.
ChIP von kultivierten Zellen gut etabliert ist, bleibt ChIP von Säugetier-Gewebe schwieriger. Die Vorbereitung von Chromatin für ChIP umfasst mehrere wichtige Schritte, die für jede Art von Gewebe und Zellen optimiert werden müssen. Chromatin kann aus der zellulären Lysates kultivierten Zellen oder folgende Reinigung des ihre Kerne hergestellt werden. Im Falle von Säugetier-Gewebe sind effiziente lyse, Formaldehyd Fixierung und Reinigung der Kerne kritisch, um optimale Erholung des Chromatins zu gewährleisten. Darüber hinaus hat die Wahl, ob die Kerne vor oder nach ihrer Reinigung beheben experimentell zu ermitteln. Trotz dieser Hürden hat ChIP aus dem Gewebe wie Leber, Hoden oder Gehirn4,5,6erfolgreich durchgeführt. Im Falle der Skelettmuskulatur ist Störung der physisch resistent Gewebe, die einen hohen Gehalt an Strukturproteinen und Isolation von seinen Kernen Exponate besonders anspruchsvoll. Angesichts dieser Besonderheit, geben Protokolle, optimiert für andere Gewebe nicht zufriedenstellende Ergebnisse für skelettartigen Muskeln.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur ChIP-Grade Chromatin von Maus Skelettmuskelgewebe zu isolieren, die physisch stören das Gewebe, Formaldehyd Fixierung und die Isolation der Kerne und Beschallung beinhaltet. Die Effizienz dieser Methode Chromatin geeignet für ChIP aus diesem Gewebe vorzubereiten zeigte sich durch ChIP-qPCR und ChIP-Seq für verschiedene Transkriptionsfaktoren, RNA-Polymerase II und kovalente Histon-Modifikationen-7.
Diese neue Technik ist wesentlich schneller als ein zuvor gemeldeten Protokoll8 bestehend aus lange Kollagenase Verdauung Schritte während dieser Zeit, Änderungen bei genomischen Lokalisierung von Transkriptionsfaktoren und Veränderungen in der Genexpression erfolgen können. Die Schnelligkeit, mit der die Kerne isoliert und fixiert sind, macht die hier beschriebene Methode besonders attraktiv, Chromatin vorzubereiten, die mehr treu den nativen genomische Belegung Zustand erfasst. Außerdem, obwohl andere Methoden für Chromatin Isolierung oder Protein-Extraktion aus Muskelgewebe haben beschrieben8,9,10 und verwendet wurden für ChIP-qPCR Experimente auf ausgewählte Gene, kein ChIP-seq Daten wurde über sie berichtet. Die Methode hier berichtet eignet sich für Transkription Faktor und Histon Modifikation ChIP-Seq, und daher sollte auch für 3 / 4C oder HiC Chromatin Konformation Erfassung Anwendungen geeignet.

<table><tbody><tr><td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose beads</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainers 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde EM grade</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>yeast tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen Blue</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Pol II ChIP Antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP Antibody</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 ChIP Antibody</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Focused Ultrasonicator</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Additional items&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml round bottom tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m and 40 &amp;mu;m cell strainers (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

Wir beschreiben eine effiziente und reproduzierbare Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur, eine physisch resistent Gewebe mit einem hohen Gehalt von Strukturproteinen. Sezierten Gliedmaßen Muskeln von Erwachsenen Mäusen sind physisch durch mechanische Homogenisierung oder eine Kombination von hacken und Douncing in einem hypotonischen Puffer vor Formaldehyd Fixierung der Zelle lysate gestört. Die feste Kerne werden gereinigt, durch weitere Zyklen von mechanischer Homogenisierung oder Douncing und sequentielle Filtrationen, Zelle Ablagerungen zu entfernen. Die gereinigte Kerne können sofort oder zu einem späteren Zeitpunkt nach dem Einfrieren beschallt werden. Das Chromatin kann effizient beschallt und ist geeignet für Chromatin Immunopräzipitation Experimente, wie durch die Profile für Transkriptionsfaktoren, RNA-Polymerase II und kovalente Histon Änderungen erhalten. Die verbindliche Ereignisse mit Chromatin vorbereitet durch dieses Protokoll nachgewiesen sind überwiegend in die Muskelfaser Kerne trotz der Anwesenheit von Chromatin von anderen Faser-assoziierten Satelliten- und Endothelzellen stattfindet. Dieses Protokoll ist daher angepasst, Genregulation in der Skelettmuskulatur erwachsener Mäuse zu studieren.

Um die Kerne zu isolieren, führten wir mechanische Homogenisierung des Muskelgewebes seziert und Hackfleisch für entweder 15 oder 45 s, bei 18.000 und 22.000 u/min (siehe Tabelle der Materialien). Unter allen Bedingungen Kerne aus den Trümmern Gewebe getrennt werden könnte, aber die Ausbeute war optimal mit der niedrigeren Drehzahl (Abbildung 1A-B). Kerne könnten auch durch Douncing für 3-5 min (Abb...

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Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

Eine neuartige Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur zur Erforschung der Genregulation in Muskelfasern von Chromatin Immunopräzipitation angepasst präsentiert.

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.5K Aufrufe.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. Eine neuartige Protokoll für die Vorbereitung von Chromatin von Erwachsenen Maus Skelettmuskulatur zur Erforschung der Genregulation in Muskelfasern von Chromatin Immunopräzipitation angepasst präsentiert.

Serie: Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

Forschung

Genetik

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

Eine Filtrations-basierte Methode zur Herstellung von hochwertigen Nuklei aus vernetzten Skelettmuskeln für Chromatin-Immunpräzipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Biochemie

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes that add or remove these marks in response to signals received by the cell. These PTMS are key contributors to the regulation of processes such as gene expression control and DNA repair. Chromatin immunoprecipitation (chIP) has been an instrumental approach for dissecting the abundance and localization of many histone PTMs throughout the genome in response to diverse perturbations to the cell. Here, a versatile method for performing chIP of post-translationally modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) is described. This method relies on crosslinking of proteins and DNA using formaldehyde treatment of yeast cultures, generation of yeast lysates by bead beating, solubilization of chromatin fragments by micrococcal nuclease, and immunoprecipitation of histone-DNA complexes. DNA associated with the histone mark of interest is purified and subjected to quantitative PCR analysis to evaluate its enrichment at multiple loci throughout the genome. Representative experiments probing the localization of the histone marks H3K4me2 and H4K16ac in wildtype and mutant yeast are discussed to demonstrate data analysis and interpretation. This method is suitable for a variety of histone PTMs and can be performed with different mutant strains or in the presence of diverse environmental stresses, making it an excellent tool for investigating changes in chromatin dynamics under different conditions.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Here, we describe a protocol for chromatin immunoprecipitation of modified histones from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA is subsequently used for quantitative PCR to interrogate the abundance and localization of histone post-translational modifications throughout the genome.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Isolierung von Satellitenzellen aus Gliedmaßenmuskeln der Maus und Durchflusszytometrie-Analyse

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of satellite cells from the limb muscle, a tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice were mechanically disrupted by mincing in medium supplemented with dispase and type I collagenase. Upon digestion,&#160;the homogenate was filtered through cell strainers, and cells were suspended in FACS buffer. Viability was determined with fixable viability stain, and immunostained satellite cells were isolated by FACS. Cells were lysed with Triton X-100 and released nuclei were bound to concanavalin A magnetic beads. Nucleus/bead complexes were incubated with antibodies against the transcription factor or histone modifications of interest. After washes, nucleus/bead complexes were incubated with protein A-micrococcal nuclease, and chromatin cleavage was initiated with CaCl2. After DNA extraction, libraries were generated and sequenced, and the profiles for genome-wide transcription factor binding and covalent histone modifications were obtained by bioinformatic analysis. The peaks obtained for the various histone marks showed that the binding events were specific for satellite cells. Moreover, known motif analysis unveiled that the transcription factor was bound to chromatin via its cognate response element. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in adult mice limb muscle satellite cells.

Autor im Rampenlicht: Cistrome-Analyse in Muskelstammzellen der Maus 

Presented here is an efficient protocol for the fluorescence-activated cell sorting (FACS) isolation of mouse limb muscle satellite cells adapted to the study of transcription regulation in muscle fibers by cleavage under targets and release using nuclease (CUT&amp;RUN).

Ein effizientes Protokoll für die CUT&amp;RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Entwicklungsbiologie

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

Zusammenfassung

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Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) in Maus-T-Zell-Linien

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Eine Filtrations-basierte Methode zur Herstellung von hochwertigen Nuklei aus vernetzten Skelettmuskeln für Chromatin-Immunpräzipitation

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Histon-Modifikationen von Saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

Ein effizientes Protokoll für die CUT&RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Ein effizientes Protokoll für die CUT&RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Ein effizientes Protokoll für die CUT&RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen