Name: single-cell quantification of protein degradation rates by time-lapse fluorescence microscopy in adherent cell culture
Uploaded: 2018-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture at JoVE.com

Hızlandırılmış mikroskobu deneyler biyomoleküler eleme tesisi (BSF adlı), EPFL gerçekleştirilmiştir. Marc Delachaux (hizmet Audiovisuel, EPFL) videografisi ve film düzenleme için teşekkür ederiz.

Not: Bu çalışmada, E14 ES hücre kültürünü kullanıldı. Ancak, bu iletişim kuralını doğrudan diğer fare ES hücre kültürünü bir protein endojen protein etiketleme veya overexpression kullanarak bir ek etiketi için erimiş ilgi ifade etmek için geçerlidir. Sonuçlar bölümünde gösterilen örnekler için Doksisiklin indüklenebilir ek-etiket füzyon hücre satırları kullanılmıştır (ek-etiket için aşağıdaki proteinler erimiş: MicroRNAs, Oct4, Srsf11, veya floresan proteinler mOrange2 ve sfGFP ve kontrolü altında koymak için bir Doksisiklin indüklenebilir organizatörü. Daha fazla bilgi için11 Doksisiklin indüklenebilir ek-etiket füzyon hücre satırları oluşturulmasında kullanılan plazmid bakınız). Sıkı zamanlama ve protein ilgi ifade yoğunluğunu kontrol için izin verdiği Doksisiklin indüklenebilir sistemi özellikle yararlı olabilir. C-terminal ek-etiket-in konumlandırma tavsiye edilir, N-terminal değiştirme olarak amino asit dizisi half-life hedef protein (N-son kural12) değiştirmek daha yüksektir.
1. E-cadherin kaplama ve hücre tohumlama
<ol><li>Bir protein için ek-tag4erimiş ilgi ifade bir ES hücre satırı oluşturmak.</li>
	<li>Kat 100 mm hücre kültür yemekleri (fosfat tamponlu tuz (PBS) olmadan Ca2 +/Mg2 +içinde seyreltilmiş) % 0,1 jelatin 1 h. için 4 mL ile jelatin kaldırmak ve hemen 1 h. kullanım kurumaya bırakın veya kaplamalı yemekleri 2 aya kadar saklayabilirsiniz.</li>
	<li>Hücre kültürünü ES hücre kültür orta (Glasgow en az temel takıma % 10 ES hücre nitelikli fetal sığır serum, 2 mM sodyum pyruvate, %1 non-gerekli amino asitler, % 1 penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2 - Orta, ilgi büyümek mercaptoethanol, lösemi inhibitör faktörü (LIF), 3 µM CHIR99021 ve 0.8 µM PD184352) jelatin kaplı yemekleri yemek başına 10-20 Mio hücre bir izdiham ulaşan kadar 2 gün 37 ° C ve % 5 CO2 . Not: Burada, LIF süpernatant toplama tarafından takip ve filtreleme HEK 293T hücreleri, geçici transfection tarafından üretildi. LIF her toplu iş iş potansiyelini pluripotency korumak test edildi, ama konsantrasyonlarının tespit. Ancak, rekombinant LIF da piyasada bulunan ve sık kullanılan fare ES hücre kültürü için konsantrasyon 1000 adet/mL13.</li>
	<li>96-şey plaka başına iyi (5 ng/PBS içinde Ca2 +/Mg2 +ile seyreltilmiş µL,. E-cadherin Fc chimera protein (E-cad-Fc) rekombinant fare 30 µL ile görüntüleme için uygun ceket Hisse senedi-80 ° C'de depolanan 100 ng/µL konsantrasyonları kullanın.) E-cad-Fc çok kırılgan olduğu gibi geniş pipetting, kaçının. 1,5 saat için 37 ° C'de kuluçkaya. Not: mikroskop bağlı olarak, diğer formatlar kullanılabilir olur.</li>
	<li>E-cad-Fc Aspire edin, bir kez PBS 100 µL Ca2 +/Mg2 +ile yıkayın ve Önceden ısıtılmış ES hücre kültür ortamının 100 µL ekleyin.</li>
	<li>PBS 5 mL olmadan Ca2 +/Mg2 +faiz hücrelerle yıkayın. Aspire edin ve tripsin-EDTA 2 mL % 0.25 ekleyin. 4 dk. 37 ° C'de için kuluçkaya ES hücre kültür orta 4 mL ekleyin, resuspend ve 1000 x g 4 dk. aspiratı süpernatant de aşağı spin ve Pelet 2 mL taze ES hücre kültür orta resuspend. Not: PBS olmadan Ca2 +/Mg2 + trypsinization önce hücreleri yıkama için hücre adezyon için gerekli olan Ca2 + iyonları, kaldırmak için kullanılır. Buna ek olarak, E-cad-Fc seyreltme ve kaplama (1.4. adım) kullanmak için PBS Ca2 +/Mg2 +ile E-cad-Fc hücrelere ES yapışma beri kaplamalı yemekleri olduğunu Ca2 +-bağımlı14.</li>
	<li>Resuspended hücreleri 1:10 ES hücre kültür orta ve sayım odası (0,1 mm derinlik TMMOB için yük 10 µL) kullanan sayısı, 1 ml seyreltik.</li>
	<li>Tohum 30.000 hücre/cm2 ' E-cad-Fc görüntüleme plaka kaplı. İyi ücret 200 µL ES hücre kültür orta ile doldurun. Doksisiklin indüklenebilir hücre hatlarında Doksisiklin uygun bir doz ile teşvik (doz ve zamanlama indüksiyon önceden optimize edin. Burada kullanılan hücre hatları ile 500 ng/mL Doksisiklin görüntüleme önce 24 saat tedavi edildi). 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçkaya ve etiketleme ve hücre tohum sonra 24 h Imaging darbe ile devam edin.</li>
</ol>2. nabız ek-etiket etiketleme
Not: protein çürüme deneyler için bu yeterli bir ek boya toplama kullanmak çok önemlidir. Konsantrasyonu hızlandırılmış, başında parlak bir sinyal vermeye yüksek olmalıdır Floresans zamanla azalacak gibi. Ancak, çok yüksek boya konsantrasyonları kullanarak kalan boya orta veya hücreleri yıkamadan sonra bile bırakılmak neden olabilir. Ücretsiz boya daha sonra çürüme eğri tahrif edecek film boyunca yeni üretilen ek-etiket moleküllerine bağlamak. Gözlenen Floresans sinyal boya, kullanılan hücre hattı gibi ifade düzeyi karşılık gelen protein özellikleri üzerinde bağlıdır. Bu nedenle, farklı dilutions, canlı hücre görüntüleme için üretici tarafından önerilen seyreltme itibaren test ederek boya toplama en iyi duruma getirmek çok önemlidir. Bu çalışma için bir far-red floresan substrat kullanıldı. En iyi bir konsantrasyon 12 nM Doksisiklin indüklenebilir overexpression hücre hatlarında kararlıydım.
<ol><li>Önceden ısıtılmış ES hücre kültürü ortamında uygun toplama için ek boya sulandırmak. Hafifçe daha önce 96-şey plaka numaralı seribaşı hücrelerden orta kaldırmak için bir pipet kullanın ve seyreltilmiş ek boya iyi başına 50 µL ekleyin. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Bir pipet ile seyreltilmiş boya Aspire edin ve 3 x 200 µL (olmadan Ca2 +/Mg2 +) Önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. ES hücre kültür ortamının 200 µL ekleyin ve 37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>Önceki çamaşır adımları iki kez daha tekrarlayın. Not: Geniş çamaşır ilişkisiz herhangi bir boya kaldırmak için önemlidir. 15 dk incubations görüntüleme deney başlamadan önce ek-etiket füzyon proteinlerin sağlam etiketleme sağlamak ise PBS tekrarlanan çamaşır adımlarla ortamda, kalan ekstraselüler boya kaldırın. Ancak, nazik pipetting tarafından çamaşır adımlarını gerçekleştirin ve E-cad-Fc seribaşı hücreleri kolayca ayırmak eğilimi olarak bir otomatik aspiratör kullanmayın.</li>
	<li>Orta görüntüleme 200 µL ekleyin. Floresan arka plan azaltmak, fenol red ücretsiz orta kullanın (takıma % 10 ES hücre nitelikli fetal sığır serum, 2 mM sodyum pyruvate, %1 non-gerekli amino asitler, % 1 penisilin/streptomisin, 2 mM L-glutamin, 100 µM 2-mercaptoethanol, LIF, 3 µM CHIR99021 ve 0.8 µM PD184352).</li>
</ol>3. hızlandırılmış mikroskobu
<ol><li>Mikroskop bırakmak ısı kontrollü ve CO2canlı görüntüleme için uygun kullanın. Sıcaklığı 37 ° C, CO%2 5'için kullanın ve 1-2 h için equilibrate için izin vermek için önceden ayarlayın.</li>
	<li>Plaka mikroskop yer ve noktalar görüntüleme için uygun bulmak. Nerede bu analiz kolaylaştıracaktır gibi hücreler eşit olarak dağıtılmış ama çok yoğun, noktalar seçin. Analiz için gerekli hücre sayısı için seçili noktaların sayısını ayarlayın. Bu çalışmada, 3-5 noktalar hücre satır başına kaydedildi.</li>
	<li>Hedefi seçin. 20 X amaç ES hücre boyutu için uygundur.</li>
	<li>Kaydedilecek floresan kanal (lar) aydınlatma ayarlarını seçin. Lazer güç ve ilgi hücrelerden Floresans sinyalin yoğunluğunu göre pozlama ayarlamak. O film boyunca azaltmak ama lazer güçler fototoksisite ve photobleaching en aza indirmek için 30 daha yüksek önlemek bu yana güçlü bir ilk sinyal aldığınızdan emin olun. Bu çalışmada, bir uyarma filtre 632/22 için nm (dalga boyu/bant), emisyon filtre 679/34 nm (dalga boyu/bant), lazer güç % 10 ve pozlama süresi 100 MS kullanılmıştır.</li>
	<li>Görüntüleme aralıkları ve hızlandırılmış deneme süresi seçin. Beklenen yarı-ömrü 2-20 h olan proteinler için 12-24 h edinme zamanlarında 15 dk zaman aralıkları ile seçin. Shorter-Lived proteinler için aralıkları ve longer-lived proteinler artış satın alma saatleri buna göre azaltın.</li>
	<li>Görüntüleme başlatın.</li>
</ol>4. görüntü işleme ve analiz
<ol><li>Alınan görüntüleri TIFF biçiminde bir yığın olarak toplamak. Daha fazla işleme ve analiz için FIJI yazılım15kullanın. Hızlandırılmış veri yığını olarak mikroskop bilgisayar yazılımı tarafından toplanan değil, tüm çerçeveleri hızlandırılmış deneme yazılımı açın ( dosya tıklayarak tarafından | Açık... veya sürükle ve araç çubuğu'na karşılık gelen dosyaları atılan) tıklatın ve resmi | Yığınlar | Görüntü yığını.</li>
	<li>Yığındaki tüm resimlerden arka plan çıkarmak için çıkarma arka plan işlevini kullanın. Bunu yapmak için işlemi ' ı tıklatın | Arka plan çıkarma. Çalışırken topu RADIUS açılır penceresinde seçin. En azından görüntüsü hücreleri büyüklüğünde bir RADIUS kullanın. Evet , arka plan çıkarma yığındaki tüm hücrelere uygulamak için seçin işlem yığın? açılır pencere.</li>
	<li>İlgi bir hücre seçin ve faiz (ROI) etrafında araç çubuğunu kullanarak bir bölgenin çizin. Nükleer sinyalleri için Oval seçim ilk araç çubuğunda karşılık gelen sekmeyi tıklayarak ve sonra faiz çekirdeği üzerinde tıklayarak ve oval etrafında ayarlayarak kullanın. Sitoplazmik sinyalleri veya çok yoğun bölgeler için serbest seçim hücre özetliyor yakından takip edebilmek için kullanın. Tüm arka plan pikseller (Adım 4,8-4,9) sonraki çıkarma nedeniyle tam olarak hücre anahatları takip için gerekli olmadığı halde çok büyük arka plan, bölgelerinde eklemekten kaçının.</li>
	<li>Analiz tıklatarak ROI Yöneticisi faiz bölgesine eklemek | Araçlar | ROI Yöneticisi | Eklemek, veya T klavye tuşlarına basarak.</li>
	<li>Sonraki kareye yığın penceresinde sekmesini taşıyarak veya üst karakter tuşuna basarak devam + < klavye, sonra önceki eylemlerin yineleyin. Hücre film seyri boyunca ilgi izleyin ve yatırım Getirisi her çerçevenin ROI Yöneticisi'ne ekleyin. Son ROI izlenen her hücre için daha fazla tıklatarak ayarlayın kaydetmek | Kaydet... ROI Yöneticisi'nde. Not: Ayrıca her iki kızı hücreleri hücre bölünmeler sonra izlemek ve onların entegre yoğunluklarda arka plan çıkarma sonra toplamı (protein seyreltme hücre bölünmesi sırasında hesaba 4.6-4,9 adımlara bakın). Her iki kızı hücreleri için yatırım Getirisi setleri kaydedin.</li>
	<li>Bir kez faiz hücre film izlenir, ortalama yoğunluğu ve ROIs alan değerlerini elde etmek için, ölçü birimi,'ı tıklatın. Elde edilen değerler bir elektronik tablo programına kopyalama ve hücrenin ham entegre yoğunluk her zaman noktası aşağıdaki gibi hesaplar: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg"> nerede cdemekortalama yoğunluğu vealanCkarşılık gelen yatırım Getirisi alan.</li>
	<li>Yerel arka plan tahmin etmek için hücrenin her zaman dilimi için ilgi yakın bir yatırım Getirisi ekleyin. Herhangi bir hücresel Floresans sinyal eklemekten kaçının. Kabaca bir hücre boyutudur dairesel bir yatırım Getirisi kullanın ve taşıma veya buna göre gerekirse, örneğin komşu hücreleri burnunu sokarsan küçültmek. Elektronik tabloya ölçülen yoğunluk değerleri kopyalamak ve yatırım Getirisi bir arka plan yatırım Getirisi elde etmek için ayarla ayarla cep ile daha önce açıklandığı gibi devam edin.</li>
	<li>Entegre yoğunluk hücre için arka plan-düzeltilmiş değer elde etmek için önce her zaman noktası arka entegre yoğunluğunu hesaplamak: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg"> arka plan sinyal ve alanC ortalama yoğunluğu nerede BG demek hücre çevreleyen ROI alanıdır. Her iki alanda aynı boyutta olmadığı sürece arka plan yatırım Getirisi, alanı kullanmayın.</li>
	<li>Her zaman için hücrenin son arka plan düşülen entegre yoğunluk Hesapla: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg">
</li>
	<li>Tek hücre çürümesine eğrileri normalize etmek her zaman-nokta yoğunluk değeri ilk zaman noktası yoğunluk değeri tarafından bölün. Not: Eğri uydurma (bkz. Adım 4.11) de her tek hücre veya nüfus ortalama gerçekleştirilebilir. Bir popülasyonun ortalama önyargıları farklı floresan yoğunluklarda hücreler arasında üzerinden önlemek için hesaplanır, bir normalleştirme gerek yoktur. Normalleştirme böylece her hücre son bozunma eğrisi için aynı ağırlık katkıda bulunur sağlar. Buna ek olarak, normalleştirme bağımsız olarak (bkz. Şekil 3A-3 C) onların mutlak Floresans yoğunluklarda tek hücre bozunmaları görselleştirmek yararlı olabilir. Ancak, eğer sadece tek hücreli yarı-hayat belirlenir ve verileri değil ortalama olarak, normalleştirme adım atlanabilir ve eğri uydurma doğrudan ham veriler üzerinde gerçekleştirilir.</li>
	<li>Protein half-life tahmini için bir eğri uydurma aracını kullanın. Bu çalışmada, MATLAB kullanıcı arabiriminin Apps bölümünde varsayılan olarak bulunduğu araç kutusu 3.4.1 uygun MATLAB eğrisi kullanıldı. Floresan yoğunluğu ithalat ve saat değerleri Veri al sekmesini tıklatarak elektronik tablo içine MATLAB'araç Montaj eğrisi açın ve floresan çürüme veri ve zaman Puan X veri ve Y seçin veri sekmesini seçin Özel denklem eğri uydurma tab ve üstel bir çürüme denklemi girin: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg"> f(t) floresan yoğunluğu zaman-noktada verildi, olduğu yerde bir ilk yoğunluğu ve b çürüme oranı. Uygun seçenekleri... sekmesinde, hem a ve balt sınırı için 0 seçin. A ve b için tahmini değerleri daha sonra sonuçları penceresinde görünür. Yarı ömrü aşağıdaki gibi hesaplar: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhou, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Protein+Half-Lives.">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oct4+kinetics+predict+cell+lineage+patterning+in+the+early+mammalian+embryo.">Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo.</a> Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).</li><li>Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).</li><li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells.">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li><li>Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+O6-alkylguanine-DNA+alkyltransferase+for+applications+in+protein+labeling.">Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling.</a> Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).</li><li>Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis.">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).</li><li>Bojkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+Vivo+Protein+Half-Life.">Measuring In Vivo Protein Half-Life.</a> Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).</li><li>Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+quantitative+measurements+of+gene+expression+in+single+living+cells.">A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells.</a> Methods. 120, 65-75 (2017).</li><li>Komatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Measurements+of+Protein+Dynamics+Using+Fluorescence+Activation-Coupled+Protein+Labeling+Method.">Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method.</a> J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).</li><li>Deluz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+mitotic+bookmarking+of+SOX2+in+pluripotency+and+differentiation.">A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation.</a> Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).</li><li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+N-end+rule+pathway+and+regulation+by+proteolysis.">The N-end rule pathway and regulation by proteolysis.</a> Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).</li><li>Tamm, C., Pijuan Galit&#243;, S., Anner&#233;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+Study+of+Protocols+for+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Culturing.">A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).</li><li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-Cadherin-Coated+Plates+Maintain+Pluripotent+ES+Cells+without+Colony+Formation.">E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation.</a> PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties.">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).</li><li>Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAST:+An+automated+segmentation+and+tracking+tool+for+the+analysis+of+transcriptional+kinetics+from+single-cell+time-lapse+recordings.">CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings.</a> Methods. 85, 3-11 (2015).</li><li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images.">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Comm. 8, (2017).</li><li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CIDRE:+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy.">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li><li>Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Aminoimidazole-4-carboxyamide+Ribonucleoside+Induces+G1/S+Arrest+and+Nanog+Downregulation+via+p53+and+Enhances+Erythroid+Differentiation.">5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation.</a> Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).</li><li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Regulation+of+Akt+and+Oct4+Promotes+the+Self-Renewal+and+Survival+of+Embryonal+Carcinoma+Cells.">Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells.</a> Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).</li><li>Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+of+Oct4+Enhances+Its+Stability,+DNA+Binding,+and+Transactivation.">Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation.</a> J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).</li><li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Engineered+Protein+Tag+for+Multiprotein+Labeling+in+Living+Cells.">An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells.</a> Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).</li><li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Protein çürüme izlemek için ek etiketi kullanan hiçbir kalıntı ilişkisiz boya orta veya hücreleri olarak aksi takdirde yıkama sonrası bu sol emin olmak için yeni bağlamak olduğunda en önemli adım ek-etiket molekülleri daha sonra sırasında deneme ve orada üretilen Münir uzlaşma bozunma eğrisi. Bir yandan dikkatle açıklanan çamaşır adımları uygulayarak elde bu. Öte yandan, boya konsantrasyon hala iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için izin verir bir aralıktaki olurken mümkün old...

İyi hücresel protein sentezi ve yıkımı oranları belirli her protein ve fizyolojik düzenleme tabi olmak ile geniş ciro, tabi olduğu bilinmektedir. Geleneksel olarak, protein yıkımı oranları ölçülen radyoaktif darbe chase analizi gibi toplu yöntemleri kullanarak veya sikloheksimit1gibi protein sentez inhibitörleri içeren olmuştur. Daha yakın zamanlarda, kararlı izotop kütle spektrometresi ile birlikte (SILAC) hücre kültüründe amino asitler ile etiketleme bir küresel ölçekte2protein ciro ölçmek için kurulmuştur. Ancak, bu yöntemlerin nüfus sayı ortalaması alınarak sınırlıdır ve hücre-hücre değişkenlik hakkında bilgi bu nedenle kaybolur. Ayrıca, hücre nüfus arasında iseEşitlenmemiş protein yıkımı geçici değişimler tanımlanamıyor.
Alternatif olarak, protein yarı-hayat da hangi sık sık tek hücreli çözünürlük sağlama avantajına sahip floresan tabanlı yaklaşımlar tarafından belirlenebilir. Örneğin, bir photoactivatable yeşil flüoresan protein (paGFP) erken memeli embriyo3Oct4 half-life belirlemek için kullanılır. Canlı hücreler içinde protein çürüsün izlemek için başka bir yöntem bir ek etiketi Floresans hızlandırılmış görüntüleme ile birlikte kullanmaktır. EK-etiket DNA onarım enzim O6- alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) özellikle moleküler probları4,5' e, birleştiğinde (BG) türevleri ile benzylguanine tepki verir, mutasyona uğramış bir sürümüdür 6. bu nedenle, herhangi bir ek-etiket füzyon proteini bir Floresan, hücre geçirgen boya ile geri dönüşümsüz olarak etiketlenmiş. Darbe bir protein ek etiketi artık boya fiyasko tarafından takip, erimiş ilgi etiketlerine göre etiketli protein nüfus düşüşü izleme ve dolayısıyla protein half-life belirlemek için izin verir. Nabız-chase proteinlerin etiketleme için ek-etiketleri başarıyla kullanılmaktadır ve protein belirlemek için yarı-yapışık hayatımızda hücre kültür ve in vivo5,7,8,9. Yaygın olarak kullanılan çeşitli kapsayan ek-etiket yüzeylerde floresan spectra her özel uygulama için en iyi boya seçimi etkinleştirmek ticari olarak kullanılabilir. Böylece, ek-etiketleri diğer floresan füzyon protein veya boya ile çok renkli görüntüleme için de kullanılabilir. Hücre geçirgen boyalar hücre içi hem de membran bağlı proteinler izlemek için geçerlidir, ancak hücre geçirimsiz boyalar proteinler membran hayvan zinciri, etiketleme için uygundur. Ayrıca, bazı Bu sondalar neredeyse hiçbir Bazal Floresans sergi ve sadece ek-etiket10bağlama üzerine güçlü bir floresan sinyal yayan başlar.
Bu iletişim kuralı tek hücrelere ek etiketini kullanarak ilgi farklı protein yıkımı oranları ölçmek nasıl açıklar. Burada E-cadherin kültür fare embriyonik kök (ES) hücrelere bu yöntemi uygulamak, ama herhangi bir yapisan kültürlü hücre türü ile kullanmak mümkün olmalıdır. Biz ek-etiket füzyon protein Floresans hızlandırılmış görüntüleme tarafından takip darbe etiketleme tek hücre yarı-hayat ilgi çeşitli proteinlerin belirlemek için izin verir ve yarı-hayatımızda hücre hücre çeşitliliği için bir tahmin sağlar gösterir bir nüfus kültürlü hücre.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate</td><td>Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm</td><td>Marienfeld-superior</td><td>640030</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium&amp;nbsp; Non-Essential Amino Acids</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory factor</td><td>-</td><td>-</td><td>Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI)</td><td>Merck Millipore</td><td>361559</td><td></td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>391210-10-9</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from bovine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS 10x concentrated</td><td>BioConcept</td><td>3-05K00-I</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s PBS Without Ca++/Mg++</td><td>BioConcept</td><td>3-05F29-I</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Solution 0.25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>New England BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>-</td><td>-</td><td>Open-source image analysis software</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell quantification of protein degradation rates by time-lapse fluorescence microscopy in adherent cell culture

Protein sentezi dinamik bir durumda olduğundan ve bozulması ve yarı hayatlarını çeşitli şartlar altında ayarlanabilir. Ancak, en sık protein half-life ya olduğunu belirlemek için yaklaşımlar kullanılan lysed hücrelerden popülasyon ortalamaları için sınırlı veya protein sentez inhibitörleri kullanılmasını gerektirir. Bu iletişim kuralı protein yarı-hızlandırılmış Floresans mikroskobu ile birlikte ek-etiket füzyon protein kullanarak hayatımızda tek yaşam yapışık hücreleri, ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bir ek etiketi için erimiş ilgi herhangi bir protein kovalent birleştiğinde bir Floresan, hücre geçirgen boya tarafından benzylguanine türev bağlanabilir ve etiketli protein nüfus çürüme kalan boya fiyasko sonra izlenebilir. Sonraki hücre izleme ve miktar bir üstel çürüme eğri eğri uydurma tarafından protein yıkımı oranları Tek Kişilik hücrelerde belirlemek için izin izlenen her hücre için zaman sonuçlar üzerinde tümleşik Floresans yoğunluğunu. Bu yöntem için yarı-hayat kolayca diğer yöntemlerle ölçülen olamaz kültürlü hücrelerinin bir popülasyondaki heterojen bir tahmin sağlar. Burada sunulan yaklaşım kültürlü yapışık hücreleri bir protein bir ek etiketi için erimiş ilgi ifade, her türlü için geçerlidir. Burada E-cadherin kaplı hücre kültür Tabaklarda yetiştirilen fare embriyonik kök (ES) hücre protein oranları geniş bir yarı-hayat ile belirlenebilir nasıl tek hücre yıkımı göstermek için kullanın.

Açıklanan protokol tahmini hücre hücre değişkenlik half-life için bir ek etiketi için erimiş herhangi bir verilen protein sağlar. Aksi takdirde koloniler halinde yetişen ES hücreleri tek hücre çözümlenmek rekombinant E-cadherin-Fc kullanımı görüntü plaka kaplama için sağlar. Tek hücreler ayrı ayrı Film ( şekil 1A) ders boyunca izlenebilir.
Her tek hücre proteini half-life belirlemek için her iki kızı hücreleri entegre yoğunluklarda...

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture at JoVE.com

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Bu iletişim kuralı protein yarı-tek yaşam yapisan hücrelerde, hayatını darbe etiketleme ve floresan hızlandırılmış görüntüleme ek-etiket füzyon proteinlerin kullanarak belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Tek hücreli miktar Protein yıkımı oranları hızlandırılmış Floresans mikroskobu yapisan hücre kültüründe tarafından

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K Görüntüleme.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL). Bu iletişim kuralı protein yarı-tek yaşam yapisan hücrelerde, hayatını darbe etiketleme ve floresan hızlandırılmış görüntüleme ek-etiket füzyon proteinlerin kullanarak belirlemek için bir yöntem açıklanır.

Video: Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological systems. In FDAP experiments, the clearance of proteins within living organisms can be measured. A protein of interest is tagged with a photoconvertible fluorescent protein, expressed in vivo and photoconverted, and the decrease in the photoconverted signal over time is monitored. The data is then fitted with an appropriate clearance model to determine the protein half-life. Importantly, the clearance kinetics of protein populations in different compartments of the organism can be examined separately by applying compartmental masks. This approach has been used to determine the intra- and extracellular half-lives of secreted signaling proteins during zebrafish development. Here, we describe a protocol for FDAP experiments in zebrafish embryos. It should be possible to use FDAP to determine the clearance kinetics of any taggable protein in any optically accessible organism.

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein levels in cells and tissues are often tightly regulated by the balance of protein production and clearance. Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP), the clearance kinetics of proteins can be experimentally measured in vivo.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Gelişim Biyolojisi

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases. Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest that typically occurs in response to exposure to sub-lethal stresses. However, like other non-dividing cells, senescent cells remain metabolically active and carry out many functions that require unique transcriptional and translational demands and widespread changes in the intracellular and secreted proteomes. Understanding how protein synthesis and decay rates change during senescence can illuminate the underlying mechanisms of cellular senescence and find potential therapeutic avenues for diseases exacerbated by senescent cells. This paper describes a method for proteome-scale evaluation of protein half-lives in non-dividing cells using pulsed stable isotope labeling by amino acids in cell culture (pSILAC) in combination with mass spectrometry. pSILAC involves metabolic labeling of cells with stable heavy isotope-containing versions of amino acids. Coupled with modern mass spectrometry approaches, pSILAC enables the measurement of protein turnover of hundreds or thousands of proteins in complex mixtures. After metabolic labeling, the turnover dynamics of proteins can be determined based on the relative enrichment of heavy isotopes in peptides detected by mass spectrometry. In this protocol, a workflow is described for the generation of senescent fibroblast cultures and similarly arrested quiescent fibroblasts, as well as a simplified, single-time point pSILAC labeling time-course that maximizes coverage of anticipated protein turnover rates. Further, a pipeline is presented for the analysis of pSILAC mass spectrometry data and user-friendly calculation of protein degradation rates using spreadsheets. The application of this protocol can be extended beyond senescent cells to any non-dividing cultured cells such as neurons.

This protocol describes the workflow for metabolic labeling of senescent and non-dividing cells with pulsed SILAC, untargeted mass spectrometry analysis, and a streamlined calculation of protein half-lives.

Metabolik Etiketleme ve Kütle Spektrometrisi ile Yaşlanan ve Bölünmeyen Kültürlü Hücrelerde Protein Devir Hızlarının Ölçülmesi

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

Biyokimya

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Efferocytosis tek hücreli floresans mikroskobu tarafından miktar

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Biyoloji

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts 

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

Tek ve Çok hücreli Bağlamlarda Invadopodia aracılı Ekstrasellüler Matriks Proteoliz Kantitatif Ölçümü

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

Measuring Diurnal Rhythms in Autophagic and Proteasomal Flux

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main lysosome-dependent pathway is called autophagy, while the primary non-lysosomal method for protein catabolism is the ubiquitin-proteasome system. Recent studies in model organisms suggest that the activity of both autophagy and the ubiquitin-proteasome system is not constant across the day but instead varies according to a daily (circadian) rhythm. The ability to measure biological rhythms in protein turnover is important for understanding how cellular quality control is achieved and for understanding the dynamics of specific proteins of interest. Here we present a standardized protocol for quantifying autophagic and proteasomal flux in vivo that captures the circadian component of protein turnover. Our protocol includes details for mouse handling, tissue processing, fractionation, and autophagic flux quantification using mouse liver as the starting material.

We describe our protocol for measuring biological rhythms in protein catabolism via autophagy and the proteasome in mouse liver.

Otophagic ve Proteasomal Akı'da Diurnal Ritimlerin Ölçülmesi

Cells employ several methods for recycling unwanted proteins and other material, including lysosomal and non-lysosomal pathways. The main ...

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high throughput. In general, the acquisition of single-cell time courses from cultured cells is hampered by cell motility and diversity of cell shapes. Adhesive micro-arrays standardize single-cell conditions and facilitate image analysis. LISCA combines single-cell microarrays with scanning time-lapse microscopy and automated image processing. Here, we describe the experimental steps of taking single-cell fluorescence time courses in a LISCA format. We transfect cells adherent to a micropatterned array using mRNA encoding for enhanced green fluorescent protein (eGFP) and monitor the eGFP expression kinetics of hundreds of cells in parallel via scanning time-lapse microscopy. The image data stacks are automatically processed by newly developed software that integrates fluorescence intensity over selected cell contours to generate single-cell fluorescence time courses. We demonstrate that eGFP expression time courses after mRNA transfection are well described by a simple kinetic translation model that reveals expression and degradation rates of mRNA. Further applications of LISCA for event time correlations of multiple markers in the context of signaling apoptosis are discussed.

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays LISCA - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

We present a method for the acquisition of fluorescence reporter time courses from single cells using micropatterned arrays. The protocol describes the preparation of single-cell arrays, the setup and operation of live-cell scanning time-lapse microscopy and an open-source image analysis tool for automated preselection, visual control and tracking of cell-integrated fluorescence time courses per adhesion site.

Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA) - Hücresel Kinetiği Ölçmek için Çok Yönlü Bir Teknik

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high ...