Name: assays for the degradation of misfolded proteins in cells
Uploaded: 2016-08-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells at JoVE.com

We thank S. Raychaudhuri for providing the destabilized firefly luciferase mutant plasmid, and A. Glavis-bloom and N. Charan for technical assistance. This work was supported, in part, by grants from NIH (CA088868, GM060911, and CA182675).

Reaktif hazırlanması 1. <ol><li> Hücre liziz tamponu (50 mM Tris, pH 8.8, 100 mM NaCI, 5 mM MgCI2,% 0.5 NP-40). Ek 2 mM DTT, 1 x tam proteaz kokteyli, 250 lU / ml kadar Benzonaz ile yıkanmıştır. </li><li> Pelet tamponu hazırlayın (20 mM Tris, pH 8.0, 15 mM MgCI2). Ek 2 mM DTT, kullanımdan önce 1 x tam proteaz kokteyli ve 250 IU / ml kadar Benzonaz. </li><li> 3x kaynama tamponu (% 6 SDS, 20 mM Tris, pH 8.0) içinde hazırlayın. Kullanmadan önce 150 mM DTT Supplement. </li><li> mikroplak floresan okuyucu kullanarak deneyleri için düşük floresan DMEM ortamı hazırlayın. 25 mM glükoz, 0.4 mM glisin, 0.4 mM arjinin, 0.2 mM sistein, 4.0 mM glutamin, 0.2 mM histidin, 0.8 mM izolösin, 0,8 mM lösin, 0.8 mM lizin, 0.2 mM metionin, 0.4 mM fenilalanin, 0.4 mM serin, 0.8 karıştırın mM treonin, 0.078 mM triptofan, 0.4 mM tirosin, 0.8 mM valin, 1.8 mM CaCl2, 0.81 mM MgSO 4, 5.33 mM KCI, 44.0 mM NaHCO 3, 110 mM NaCI, 0.9 mMNaH 2 PO 4. pH 7.4&#39;e HCI veya NaOH kullanılarak solüsyonun pH ayarlayın. süzme yoluyla orta sterilize edin. NOT: Bu ortam o Fe dışında yüksek glukoz ile standart DMEM ortamı bileşenlerini içermektedir (NO 3) 3, vitaminler ve Fenol Kırmızısı ihmal edilir. Fenol kırmızı, riboflavin ve düzenli DMEM kültür ortamı içinde piridoksal belirgin bir floresan sinyali 21 tespiti engeller. Bu bileşenleri olmadan kültür ortamı, başarılı canlı hücre GFP görüntüleme için çok önemlidir. buzdolabında saklandığında orta 12 ay boyunca stabildir. </li></ol> Atxn1 82Q GFP 2. Parçalanma Deneyi <ol><li> Plaka, yaklaşık% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi 35 mm tabak içine 3 x 10 5 HeLa hücreleri, O / N kültür hücreleri transfeksiyon zaman% 40-60 bir ortak akışa kadar büyümeye yapılabilmesi için,. NOT: Gerekli plakaların sayısı zaman noktalarında ve tedavi d sayısına dayanırAşağıda escribed. </li><li> Üreticinin talimatlarına 9&#39;a göre her bir transfeksiyon reaktifi olarak Atxn1 82Q-GFP / pRK5 plazmid 0.3 ug ile transfekt HeLa hücreleri. DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı yapın ve her bir kuyu için bölmeyin. </li><li> 4-5 saat sonrası transfeksiyon, dalgaboyu 450-490 nm ile GFP ifade için ters bir floresan mikroskop altında canlı hücreleri incelemek. görüntüleme sonra inkübatör geri hücreleri dönün. NOT: Şu anda çekirdekte hem de dağınık GFP sinyalleri ve GFP sinyalleri küçük benekler gözlemleyin. </li><li> Vakum aspirasyonla Ortamı çıkarın ve 50 ug / ml CHX ihtiva eden 2 ml taze DMEM ekleyin. hasat öncesi CHX 0, 4, 8, 12 ve 16 saat için hücreleri tedavi. proteozomal bozulmasını incelemek için, bir kontrol olarak, 16 saat tedavi edilmemiş plaka proteazom önleyicisi MG132 (10 uM) içerir. </li><li> Her bir zaman noktasında hücrelerin bir plaka hasat edilir. vakum aspirasyon An tarafından orta çıkarın3 ml buz gibi soğuk 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez tabakları yıkamak d. kuru buz üzerinde plaka Yapış-dondurma. </li><li> Son zaman noktasında (16 saat) sonra, buz soğukluğundaki hücre parçalama tamponu 150 ul içinde (bütün zaman noktalarında gelen) Dondurulmuş hücreler kazıma ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 17,000 x g&#39;de bir tezgah üstü santrifüj içinde hücre lizatları santrifüjleyin. </li><li> bir pipet kullanılarak bir tüpe, NP-40 çözülebilir (NS) proteinleri içeren süpernatant aktarın. Not: Gerekirse Bradford tahlili ile protein konsantrasyonlarını ölçmek için süpernatantlar kullanın. </li><li> nazikçe pelet bozmadan tüplere yaklaşık 200 ul 1x PBS ekleyerek pelet durulayın. Dikkatle vakum aspirasyon ya da pipetle PBS kaldırmak. Buz üzerinde 15-30 dakika inkübasyon, ardından 150 ul buz gibi soğuk tampon maddesi hücre topağı bunları yeniden askıya. NOT: yeniden süspanse topak parçası NP-40 çözünmeyen (NI) proteinleri içerir. Bir diag Şekil 1B&#39;ye bakınızDeterjan fraksiyonlaşması koç. </li><li> peletlerden yeniden süspansiyon haline NS fraksiyonları ve NP-40 çözünmeyen (NI) fraksiyonlara 3x kaynama tamponu 75 ul ekle. 5 dakika için bir ısı blokta 95 ° C&#39;de numune ısıtın. Not: NP-40 çözünmeyen fraksiyon Kümelenmeye ısıtılması ve numuneler belli olacak sonra eritilir. </li><li> kaynatıldı NS ve NI bir kısım SDS-jel yükleme tamponu ekleyin. SDS-PAGE jel tüm zaman noktalarında alınan örneklerin eşit miktarda yerleştirin. Zaman 0. NOT toplanan numuneden yaklaşık 20 ug NS hacim yüklenen karşılık gelir: NI hizip NS yanı sıra SDS-çözünür (SS) proteini, SDS ayıran jel ile çözülebilir. Buna karşılık, NI fraksiyondan SDS-dirençli (SR) agrega jel yükleme kuyuları (Şekil 1B) sıkışmış. Western blot algılama geliştirmek için, NI hacminin iki yüklenebilir. </li><li> anti-GFP antikor ve zenginleştirilmiş kimyasal aydınlatma (ECL) ile western blot ile NS SS Atxn1 82Q-GFP algılar. NOT: Bu protokol kullanıldığında SS fraksiyonunda Atxn1 82Q genellikle daha az NS fraksiyonu ile karşılaştırılır. Daha uzun ECL maruz uygun sinyaller için gereklidir. </li><li> Bir nokta leke cihazı (Şekil 1B) kullanarak filtre gerilik tahlilleri ile pelet fraksiyonu SR Atxn1 82Q inceleyin. Kısaca, bir 0.2 mikron selüloz asetat membran tutan bir nokta-benek aparatı ayarlayın. Nokta-blot cihazının her bir kuyunun içine kaynatıldı NI yük 80-120 ul. Not: SR agrega sadece az miktarda hücrelerinde oluşan zamanda, nokta benek analizi için, Western blot analizi için kullanılan NS fraksiyonunun hacminin yaklaşık 10-15 kat SR fraksiyonunun bir hacim yükleyin. <ol><li> Vakum ile membrandan örnekleri süzüldükten sonra, zar üzerinde kalmış Atxn1 82Q-GFP agrega anti-GFP immunoblotting 9,12,22 ile tespit edilebilir. NOT: Filtre geriliği testinin ayrıntılı bilgi için önceki raporlarda 9,12,22 bakın. Bu adım isteğe bağlıdırSR Atxn1 82Q bu protokolü açıklanan kısa transfeksiyon aşağıdaki SS ve NS fraksiyonları ile karşılaştırıldığında çok az olduğu için. Buna ek olarak, SR Atxn1 82Q seviyeleri büyük ölçüde CHX Chase (Şekil 2B) aynı kalır. Ancak, SS Atxn1 82Q miktarları ilk deneylerde herhangi bir ilaç tedavisi veya gen ifadesi için zamanla etkilenip etkilenmediğini incelemek için hala çok önemlidir. SS protein türleri, western blot ile tespit edilebilir, SDS-PAGE jel yükleme kuyu içinde kalmak. Bununla birlikte, bu yöntem daha az hassastır ve daha değişken sonuçları (Şekil 1B) oluşturur. </li></ol></li></ol> SDS-PAGE ve Western blot NLS-lusiferaz-GFP 3. Parçalanma Deneyi <ol><li> Plaka, yaklaşık% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş DMEM aracı maddesi 35 mm tabak içine 3 x 10 5 HeLa hücreleri. O / N kültürden sonra% 40-60 bir kesişme transfeksiyon zamanı ulaşılır. gerekli plakaların sayısı t sayısına dayanırime noktaları ve tedavileri aşağıda tarif. </li><li> Üreticinin talimatlarına 9&#39;a göre her bir kuyunun kullanarak transfeksiyon reaktif içine 1.0 mikrogram NLS-lusiferaz-GFP / pRK5 plazmid ile Transfect HeLa hücreleri. iyi her kısım için DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı olun. </li><li> O / N transfeksiyon (saat 15 civarında) sonra, emisyon dalga boyu 450-490 nm GFP tanımı için bir ters flüoresan mikroskop altında, canlı hücreleri incelemek. görüntüleme sonra inkübatör geri hücreleri dönün. Not: Dağınık çekirdek GFP sinyali hücreleri (% 70) büyük çoğunluğunda gözlenebilir. Hücrelerin küçük bir yüzdesi (% 5) Nükleer agrega var. </li><li> Vakum aspirasyonla Ortamı çıkarın ve 50 ug / ml CHX ihtiva eden 2 ml taze DMEM ekleyin. hasat öncesi CHX 0, 1.5, 3, 4.5 ve 6 saat için hücreleri tedavi. proteozomal bozulmasını incelemek için, kontrol olarak 6 saat muamele bir plaka ek proteazom önleyicisi MG132 (10 uM) içerir. </li><li> Her bir zaman noktasında hücrelerin bir plaka hasat edilir. Vakum aspirasyonla Ortamı çıkarın ve 3 ml buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile iki kez plakaları yıkayın. kuru buz üzerinde plaka Yapış-dondurma. </li><li> Son zaman noktasında (6 saat) sonra hücreler de tüm zaman noktaları buz soğukluğunda hücre parçalama tamponu 150 ul sıyrılmış ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir dondurulmuş, tamamlandı. </li><li> bir son% 2 SDS konsantrasyonu ve 50 mM DTT için bütün hücre lizatları SDS jel yükleme tamponu ekleyin. 5 dakika boyunca 95 ° C&#39;de sıcaklıkta bir blok üzerinde inkübe edin. </li><li> SDS-PAGE ve anti-GFP antikoru kullanılarak Western blot ile NLS-lusiferaz GFP analiz edin. SDS-PAGE jel tüm zaman noktalarında alınan örneklerin eşit miktarda yerleştirin. hacmi yaklaşık 20 ug 0 zamanında toplanan numune alınan bütün hücre lizatları içinde tekabül yüklendi. </li></ol> Floresan Mikroplaka Okuyucu Kullanılarak NLS-lusiferaz-GFP 4. Gerçek zamanlı Parçalanma Testi <ol><li> Tohum, yaklaşık 1 x 10 4Şeffaf alt siyah 96 oyuklu doku kültürü plakaları halinde HeLa hücreleri. O / N kültürden sonra% 50-70 bir kesişme transfeksiyon zamanı ulaşılır. NOT: tamamen askıya HeLa hücreleri içeren ortam 60 ul her kuyuya doğrudan numaralı seribaşı. tohumlama sonra geri ve ileri ek orta veya kaya plakasını eklemeyin, aksi takdirde hücreler dengesiz dağıtılmış olabilir. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak her bir transfeksiyon reaktifi olarak NLS-lusiferaz-GFP / pRK5 plazmid 9 0.05-0.1 ug Transfect HeLa hücreleri. DNA ve transfeksiyon reaktifi içeren bir ana transfeksiyon karışımı yapın ve her bir kuyu için bölmeyin. hücrelerle üç kuyu, her işlem koşulunda için arka plan flüoresan sinyali için bir kontrol olarak hizmet DNA ile transfekte değildir. Not: transfeksiyon varyasyonu azaltmak için alternatif bir yol, tohumlamadan önce hücreleri transfekte etmektir. Bununla birlikte, hücrelerin büyük bir kısmı yanlış katlanmış protein ile transfektes eklemek veya bu yöntemi kullanarak azaltılmış canlılığı göstermek için başarısız. Bazı hücreler, toksik yanlış katlanmış proteinleri ifade ederken şekilde tripsin emdirme ile neden olduğu stres dayanamayıp olasıdır. Bunun bir sonucu olarak, genel olarak flüoresan sinyal önemli ölçüde azalır. </li><li> 20-24 saat transfeksiyondan sonra, emisyon dalga boyu 450-490 nm GFP tanımı için bir ters flüoresan mikroskop altında, canlı hücreleri incelemek. </li><li> vakum aspirasyon ile orta çıkarın. her oyuğa PBS 1x yaklaşık 200 ul ekleyin ve sonra DMEM ortamı artık miktarını kaldırmak için aspire. </li><li> % 5 FBS ve 50 ng / ml CHX, düşük floresan DMEM ortamında 60 ul ekle. proteozomal bozulmasını incelemek için, numune bir takım ek proteazom önleyicisi MG132 (10 uM) içerir. Her bir tedavi / durum için kuyu üç kopya olarak ayarlayın. NOT: fluo bir düşüşe neden olabilir diğer faktörleri ekarte etmek çok önemlidir, çünkü MG132 tedavisi proteozomal bozulması için kontrol olarak dahil edilmiştirhücre ölümü ve floresans içeren rescence sinyali. </li><li> CHX ilave edildikten sonra bir flüoresan plaka okuyucusu üzerinde hemen GFP flöresan sinyalinin ölçülmesi. NOT: Yazılım ölçüm ayarları Tablo 1&#39;de gösterilmiştir. </li><li> kadar 8-10 saat boyunca plaka saatte okuyun. okuduktan sonra, hücre kültürü inkübatör geri plaka dönüş. </li><li> tablo dosyası olarak veri ihracat. floresan yoğunluğu yanı sıra her biri için çoklu okur ortalama değerini kullanın. İlgili gruplar halinde Zamanda 0 ortalama değerleri her veri noktasının değerlerini normalleştirmek. Şekil 4A ve 4B ve Şekil 5&#39;te sağ panellerinde gösterildiği gibi, zaman içinde normalleştirilmiş floresan yoğunluğu çizilir. </li><li> Tekrarlı ölçümlerde 23 ile iki yönlü ANOVA kullanılarak iki durum arasındaki bozulma oranlarının istatistiksel analiz. NOT: Bu analizde, &quot;floresan yoğunluğu&quot; &quot;suların ise bağımlı değişkenent koşulları &quot;ve&quot; zaman &quot;iki faktör vardır. Bunun yerine bireysel zaman noktalarında veri karşılaştırma, tekrarlı ölçümlerde iki yönlü ANOVA tüm zaman boyunca iki tedavi grubu arasındaki farkı analiz eder. </li></ol>

<ol>
	<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+misfolding.">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426, 884-890 (2003).</li><li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins.">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li><li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis.">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li><li>Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+proteins+in+neurodegenerative+disease.">Toxic proteins in neurodegenerative disease.</a> Science. 296, 1991-1995 (2002).</li><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folding+proteins+in+fatal+ways.">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li><li>Vousden, K. H., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blinded+by+the+Light:+The+Growing+Complexity+of+p53.">Blinded by the Light: The Growing Complexity of p53.</a> Cell. 137, 413-431 (2009).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gain+of+function+of+mutant+p53+by+coaggregation+with+multiple+tumor+suppressors.">Gain of function of mutant p53 by coaggregation with multiple tumor suppressors.</a> Nat Chem Biol. 7, 285-295 (2011).</li><li>Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinucleotide+repeat+disorders.">Trinucleotide repeat disorders.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 575-621 (2007).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+system+that+degrades+misfolded+proteins+and+protects+against+neurodegeneration.">A cellular system that degrades misfolded proteins and protects against neurodegeneration.</a> Mol Cell. 55, 15-30 (2014).</li><li>Chu, Y., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+E3+ligase+activity+of+TRIM+proteins.">SUMO E3 ligase activity of TRIM proteins.</a> Oncogene. 30, 1108-1116 (2011).</li><li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes:+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins.">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26, 4102-4112 (2007).</li><li>Janer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PML+clastosomes+prevent+nuclear+accumulation+of+mutant+ataxin-7+and+other+polyglutamine+proteins.">PML clastosomes prevent nuclear accumulation of mutant ataxin-7 and other polyglutamine proteins.</a> J Cell Biol. 174, 65-76 (2006).</li><li>Bauer, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+chaperone-mediated+autophagy+for+the+selective+degradation+of+mutant+huntingtin+protein.">Harnessing chaperone-mediated autophagy for the selective degradation of mutant huntingtin protein.</a> Nat Biotechnol. 28, 256-263 (2010).</li><li>Austin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+causing+mutants+of+TDP-43+nucleic+acid+binding+domains+are+resistant+to+aggregation+and+have+increased+stability+and+half-life.">Disease causing mutants of TDP-43 nucleic acid binding domains are resistant to aggregation and have increased stability and half-life.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 4309-4314 (2014).</li><li>Barmada, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+induction+enhances+TDP43+turnover+and+survival+in+neuronal+ALS+models.">Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models.</a> Nat Chem Biol. 10, 677-685 (2014).</li><li>Paxinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+alpha-synuclein+aggregation+by+intracellular+nitrative+insult.">Induction of alpha-synuclein aggregation by intracellular nitrative insult.</a> J Neurosci. 21, 8053-8061 (2001).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firefly+luciferase+mutants+as+sensors+of+proteome+stress.">Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress.</a> Nat Methods. 8, 879-884 (2011).</li><li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson's+models.">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li><li>Elden, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-2+intermediate-length+polyglutamine+expansions+are+associated+with+increased+risk+for+ALS.">Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS.</a> Nature. 466, 1069-1075 (2010).</li><li>Fortini, M. E., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+neurodegenerative+diseases+in+Drosophila:+on+a+wing+and+a+prayer.">Modeling human neurodegenerative diseases in Drosophila: on a wing and a prayer.</a> Trends Genet. 16, 161-167 (2000).</li><li>Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fading+media+for+live+cell+GFP+imaging.">Anti-fading media for live cell GFP imaging.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates.">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li><li>McDonald, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Statistics. 3, 173-179 (2014).</li><li>Holmberg, C. I., Staniszewski, K. E., Mensah, K. N., Matouschek, A., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+degradation+of+truncated+polyglutamine+proteins+by+the+proteasome.">Inefficient degradation of truncated polyglutamine proteins by the proteasome.</a> EMBO J. 23, 4307-4318 (2004).</li><li>Verhoef, L. G., Lindsten, K., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregate+formation+inhibits+proteasomal+degradation+of+polyglutamine+proteins.">Aggregate formation inhibits proteasomal degradation of polyglutamine proteins.</a> Human molecular genetics. 11, 2689-2700 (2002).</li><li>Jana, N. R., Zemskov, E. A., Wang, G., Nukina, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proteasomal+function+due+to+the+expression+of+polyglutamine-expanded+truncated+N-terminal+huntingtin+induces+apoptosis+by+caspase+activation+through+mitochondrial+cytochrome+c+release.">Altered proteasomal function due to the expression of polyglutamine-expanded truncated N-terminal huntingtin induces apoptosis by caspase activation through mitochondrial cytochrome c release.</a> Human molecular genetics. 10, 1049-1059 (2001).</li><li>Fribley, A., Zeng, Q., Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibitor+PS-341+induces+apoptosis+through+induction+of+endoplasmic+reticulum+stress-reactive+oxygen+species+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells.">Proteasome inhibitor PS-341 induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress-reactive oxygen species in head and neck squamous cell carcinoma cells.</a> Molecular and cellular biology. 24, 9695-9704 (2004).</li><li>Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+protein+aggregation.">Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation.</a> Science. 292, 1552-1555 (2001).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrasarcoplasmic+amyloidosis+impairs+proteolytic+function+of+proteasomes+in+cardiomyocytes+by+compromising+substrate+uptake.">Intrasarcoplasmic amyloidosis impairs proteolytic function of proteasomes in cardiomyocytes by compromising substrate uptake.</a> Circulation research. 97, 1018-1026 (2005).</li><li>Link, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+green+fluorescent+protein+into+a+toxic,+aggregation-prone+protein+by+C-terminal+addition+of+a+short+peptide.">Conversion of green fluorescent protein into a toxic, aggregation-prone protein by C-terminal addition of a short peptide.</a> The Journal of biological chemistry. 281, 1808-1816 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

yanlış katlanmış proteinleri bozulmasını düzenleyen mekanizmaların hücresel proteinlerin dengesini sağlamaya yönelik olarak, ve muhtemelen, nörodejeneratif bozuklukların ve diğer protein yanlış katlayan hastalıkların tedavisi için değerli bir ilaç hedeflerini temsil eder. Burada, yanlış katlanmış proteinler bozunmasını incelenmesi deneyler, patojenik Atxn1 protein (Atxn1 82Q) ve örnek olarak bir nükleer lokalize lusiferaz mutant (NLS-LucDM) ile tarif edilmektedir. <p class="jove_content"...

Proteinler hücrelerde en fazla yer alan makromoleküllerdir ve bunlar hemen hemen tüm biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. çoğu proteinin biyolojik aktivitesi içine katlama gerektirmemekte ve doğal üç boyutlu yapılara muhafaza. Anormal yerleşimleriyle Proteinler sadece normal işlevlerini kaybeder, ama aynı zamanda sık sık diğer proteinlerin fonksiyonlarını bozar ve hücrelerin 1,2 toksik olan çözünebilir oligomerik türler veya agrega oluşturmaz. Protein yanlış katlanmasına karşı için hücreler yanlış katlanmış proteinleri 3 ortadan hem moleküler, kendi doğal şekillerinde ulaşmak için katlanmamış veya kısmen katlanmış polipeptidleri yardımcı şaperonlar ve degradasyon yollarını, kullanır. Karmaşıklığı ve katlama sürecinin stokastik doğası göz önüne alındığında, protein yanlış katlanması kaçınılmaz olduğunu ve mutasyonlar, biyosentetik hatalar, ve post-translasyonel zararların 1 durumunda ters olmayabilir. Bu nedenle, hücreleri sonuçta degradat itimatiyon yollar protein kalitesini korumak için. hücresel protein kalite kontrol önemi (PQC) sistemleri, kanser, diyabet ve Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, amyotrofik lateral skleroz, Huntington hastalığı (HD) gibi birçok nörodejeneratif rahatsızlıklar dahil olmak üzere protein yanlış katlayan hastalıklarının sıklığı altını, ve spinoserebellar ataksi (SCA) 4,5. Örneğin, tümör baskılayıcı p53&#39;ün mutasyonlar her durumda 6% 50-70 ~ ilişkili tümörlerde, tek en sık genetik lezyondur. P53 mutasyonlarının önemli bir bölümüyle agrega 7 oluşumuna yol p53 yapısını değiştirmek yanlış anlamlı mutasyonlar vardır. Ayrıca, genişletilmiş polyQ uzanıyor sahip proteinler genetik ve patolojik HD ve SCA ile ilişkilidir. Etkilenen proteinlerde polyQ streç uzunluğu belli bir eşik dönemi aştığında bu ilerici ve genellikle ölümcül hastalıklar tezahürtutun ve polyQ streç uzunluğu 8 uzatır olarak giderek daha şiddetli hale gelir. Bu hastalıkların tedavisi için çekici bir yaklaşım, terapötik olarak hücresel PQC sistemleri, özellikle de degradasyon yollarını yastığı sağlamaktır. Ancak bozuk proteinlerin memeli hücrelerinde özellikle parçalanması ile ilgili yollar, yeterince anlaşılamamıştır. o proteazom katlanan proteinlerin bozulması için kritik öneme olduğu kabul edilmiştir rağmen, hayati bir mesele tanımlanmamış kalır: Özellikle tanınan ve yıkım için hedeflenmiş nasıl katlanan proteinler. PQC sistemleri sitoplazma, endoplazmik retikulum ve mitokondri gibi hücresel bölümlerinde tespit edilmiştir, ancak ayrıca, çekirdekte PQC sistemleri 2 tam olarak bilinmemektedir. laboratuarımızda tarafından yapılan son çalışmalar çekirdekte yanlış katlanmış proteinler çeşitli tanır ve bozan bir sistem belirledikmemeli hücre, 9. Bu sistem, promiyelositik protein (PML), nükleer protein ve üçlü motif ihtiva eden (TRIM) protein ailesinin bir üyesi ve RNF4, protein ihtiva eden bir halka-etki oluşur. PML ve çeşitli diğer kesme proteinler, protein SUMOylation 10 özgünlüğünü ve verimliliğini kolaylaştırır SUMO (küçük ubikitin benzeri modifiye edici) ile E3 ligaz aktivitesi, sahiptirler. RNF4 onlara ubikuitin ligaz aktivitesinin 11 tanıyor HALKA etki ek olarak bir veya daha fazla sumo-etkileşim motifleri (SIMS) ihtiva SUMO hedefli ubikitin ligazlara (Stubl), küçük bir grup aittir. Biz PML özellikle yanlış katlanmış proteinlerle ilgili farklı özellikleri ayırt edebilir ayrık alt tabaka tanıma siteleri aracılığıyla katlanan proteinleri tanıdığı bulundu. bağlanma üzerine, PML etiketler dahili SUMOylation sitesinin varlığı nedeniyle poli-zincir oluşturabilirler SUMO2 / 3 poli-zincir, iki hemen hemen aynı memeli SUMO proteinlerle proteinleri yanlış katlanmış. SUMOylated katlanan proteinler daha sonra ubikuitinasyon ve proteozomal bozulmasına yol açar RNF4, tarafından tanınır. Biz daha PML yetersizlik SCA türü bir fare modelinde 1 (SCA1) 9 davranışsal ve nöropatolojik kusurları şiddetlendirir olarak PML-RNF4 sistemi, nörodejenerasyon karşı koruma için önemli olduğunu göstermiştir. Protein düzeyleri düzenleyen diğer hücresel mekanizmaları protein parçalanmasını ayırt etmek için, protein ciro oranları 9 ölçüldü. Protein ciro belirlemek için en sık kullanılan yöntemler arasında nabız kovalamaca ve sikloheksimid (CHX) kovalamaca vardır. Bu iki yöntem zamanla incelemek, sırasıyla, çeviri-yetkin hücreleri ve çeviri-inhibe hücrelerde ilgi toplam önceden var olan proteinlerin ilgi radyoizotop işaretli proteinler. Ancak, patojen ve yanlış katlanması eğilimli proteinleri eğitim için önemli bir sorun bu proteinlerin yarı ömrü son derece lo olabilir olduğunung. Örneğin, ataksin-1, ataksin-7, Huntingtin, α-sinüklein ve TDP-43 24 saat 9,12-16 fazla 12 yarılanma ömürleri. bu proteinleri barındıran hücreler, uzun süreli çeviri inhibisyonunu hayatta olmayabilir, özellikle yanlış katlanmış proteinlerle çünkü kendileri hücreler için oldukça zehirli olabilir çünkü bu proteinlerin yavaş devir hızları CHX kovalamaca analizi kullanımını engellemektedir. izotopik etiketleme ile darbe kovalamaca analizi aynı zamanda son derece toplama eğilimli olan proteinler için zor olabilir. En çok darbe kovalayıcı deneyler, aynı zamanda, radyoaktif etiketli tüm diğer proteinlerden ilgili proteini ayırmak için immüno kullanır. Bu işlem, normal olarak, yanlış SDS-PAGE elektroforezi ile analiz yapmak SDS çözülmeyen agrega oluşturabilen sırasında uzun immünopresipitasyon ve yıkama işlemleri içerir. Yavaş devir hızı 9 açıklanan burada bir protokol nükleer katlanan proteinleri analiz etmek. 82 glutaminler (Atxn1 82Q) bir kısım içeren ataksin-1 (Atxn1) patojenik bir şekilde, bu amaçla 8 kullanılır. Hücre içinde sentezlendiğinde, çekirdeği (Şekil 1A) Atxn1 82Q mikroskopik formları görebilir inklüzyonlar gelişmiş yeşil floresan proteini (GFP), füzyon. Darbe kovalamaca analizi Ataxn1 82Q yarı ömrü boyunca 18 saat 9 olduğunu ortaya koymaktadır. Atxn1 82Q doğal yapısındaki ile yanlış katlanmış farklı özelliklere konformasyonları, hem de türler ile türlerden oluşmaktadır. Tür farklı oranlarda degrade olması muhtemeldir ve bu nedenle ayrı ayrı analiz edilmesi gerekmektedir. gelen lizatlar Atxn1 82Q-GFP ifade eden hücreler, NP-40 çözülebilir (çözünebilir veya NS, büyük olasılıkla doğal proteinleri veya yanlış katlanmış oligomerik / monomer proteinleri temsil eder) ve NP-40 çözünmeyen (Nı, toplu / yanlış katlanmış) kısımlar halinde bölünür. (Büyük ihtimalle düzensiz agregalar SS) ya da (SDS-dirençli SR, ikincisi daha SDS çözünür ayrılabilir muhtemelen amiloid fibriller) Parçalar (Şekil 1B). SR fraksiyon immunoblotting, ardından filtre geriliği deneyleri ile tespit edilebilir iken, KG ve SS fraksiyonları Western blotting ile ve ardından SDS-PAGE ile analiz edilebilir. CHX Chase deterjanla paya ayırma yöntemi ile bir araya getirilmiş ve SS Atxn1 82Q yarılanma ömrü SS fraksiyonu kolaylıkla tanınan ve bozulmuş belirten NS Atxn1 82Q toplam Atxn1 82Q (Şekil 2A) çok daha kısa olduğu ortaya çıkmıştır hücrelerin 9. Böylece, bu yöntem yanlış katlanmış proteinlerin dinamiklerini incelemek için ve onların yıkım desen karşılaştırmak için güçlü bir araç sağlar. Ayrıca yanlış katlanmış proteinleri bozulmasını modüle makromolekülleri veya küçük bileşiklerin belirlenmesi için yüksek miktarda madde taraması için uygun olan bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, ateşböceği lusiferaz (LucDM) 17 bir model şaperon alt-tabaka bir şekilsel olarak destabilize mutant dayanır. Biz sigorta varNükleer lokalizasyon sinyali (NLS) d LucDM algılama kolaylık olması için bu hücre bölmesine PQC sistemleri prob, ve GFP (NLS-LucDM GFP) için. Mikroskopik NLS-LucDM-GFP formları hücreleri (Şekil 3A) küçük bir yüzdesi görünür nükleer agrega. Atxn1 82Q, NLS-LucWT-GFP olduğu PML-RNF4 yolu 9&#39;da SUMO2 / 3 tarafından değiştirilebilir ve regüle NLS-LucDM-GFP fakat vahşi tip muadili benzer. SS ve SR türlerin nispi miktarları NS göre minimum olmasına rağmen NLS-LucDM-GFP aşağıda protokol 3&#39;te tarif edilen koşullar kullanılarak, SS ve SR türler oluşturur. tahlil basitleştirmek için, biz sadece SDS SDS-PAGE ve western blot ile (NS ve SS fraksiyonları hem dahil) çözünebilir LucDM analiz. Önemli olarak, CHX takip deneyi SDS çözünür NLS-LucDM-GFP yarı ömrü LucDM tanır ve dalgalanmalar sistemi için belirli bir alt-tabaka olduğunu düşündüren vahşi tip muadili (Şekil 3B) çok daha kısa olduğunu göstermiştirYanlış katlanmış proteinler. LucDM-GFP bozulması genel flüoresan sinyalinde önemli bir düşüşe neden olur. Bu nedenle, aynı zamanda mikro floresans bazlı analiz kullamlarak hücresel LucDM-GFP gerçek zamanlı saptanması için bir protokol geliştirilmiştir. Bir çok yüksek girdi boyunca araştırma (HTS) sistemleri olarak anormal protein 18-20 neden olduğu hücre agregatları ve hücre canlılığı düzenleyici ilaçlar ya da gen için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, çok az HTSs özellikle memeli hücrelerinde bozulmasını hedefleme için tasarlanmıştır. Bu protokol, hücresel yanlış katlanmış protein parçalanması ile ilgili protein ifadesi, devirme ve ilaç tedavisinin etkileri hızlı ve büyük ölçekli analizi için sağlam bir sistem olarak hizmet vermektedir. Bu iki yanlış katlanmış proteinlerin analizi için protokoller tarif aşağıda, örnek olarak HeLa hücreleri kullanılarak. Transfeksiyon koşulları ve zaman süreci, her hücre hattı için optimize edilmesi gerekebilir, ancak deneyler ayrıca, diğer hücre çizgileri ile de uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11995-092</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NP40S-500ML</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8699</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>45000232</td><td></td></tr><tr><td>Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Roche Boehringer Mannheim</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Dot Apparatus&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1706545</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors GFP Monoclonal Antibody</td><td>Clonetech</td><td>632375</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Actin mAb Rabbit, IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A45060-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Amino acids are used for making low fluorecence culturing medium</td></tr><tr><td>Olympus IX-81&amp;nbsp; Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX81</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Black TC Plate w/ Transluscent Clear Bottom</td><td>Sigma-Greiner</td><td>89135-048</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Bottom Plate Reader Infinite 200&amp;reg; PRO</td><td>TECAN</td><td>Infinite 200&amp;reg; PRO</td><td></td></tr><tr><td>Cellulose acetate membrane 0.2 &amp;micro;m</td><td>Sterlitech</td><td>CA023001</td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Statistical analysis software</td></tr></tbody></table>

assays for the degradation of misfolded proteins in cells

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded proteins may serve as potential therapeutic targets. To distinguish degradation of misfolding-prone proteins from other mechanisms that regulate their levels, one important method is to measure protein half-life in cells. However, this can be challenging because misfolding-prone proteins may exist in different forms, including the native form and misfolded forms of distinct characteristics. Here we describe assays to examine the half-life of misfolded proteins in mammalian cells using a highly aggregation-prone protein, Ataxin-1 with an extended polyglutamine (polyQ) stretch, and a conformationally unstable luciferase mutant as models. Cycloheximide chase is combined with cell fractionation to examine the turnover rate of misfolding-prone proteins in various cellular fractions. We further depict a fluorescence-based assay using an enhanced green fluorescence protein (EGFP)-fusion of the luciferase mutant, which can be adapted for high throughput screening on a microplate-reader.

HeLa hücreleri% 50 transfeksiyon (Şekil 1A) sonra 20 saat - bir sabit durum analizinde, mikroskobik görünür Atxn1 82Q-GFP nükleer agrega 30 görülmektedir. Anti-GFP antikor kullanılarak ve NS SS fraksiyonların Western blot analizi, proteinin molekül ağırlığı (Şekil 1B) karşılık gelen, 100 kDa ve 150 kDa işaretleri arasında Atxn1 82Q-GFP bir tat bant göstermektedir. SR fraksiyonunda Atxn1 82Q-GFP filtresi geriliği tahlili ile, ya da...

Watch this Scientific Journal Video about Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells at JoVE.com

Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening.

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Protein misfolding and aggregation are associated with various neurodegenerative diseases. Cellular mechanisms that recognize and degrade misfolded ...

assays-for-the-degradation-of-misfolded-proteins-in-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.9K Görüntüleme.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. This report describes protocols for measuring degradation rates of misfolded proteins by either western blot or fluorescence-based assays. The methods can be applied to analysis of other misfolded proteins and for high throughput screening. 

Video: Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a key pathological feature of HD is the aberrant accumulation of mutant HTT (mHTT) protein into high molecular weight complexes and intracellular inclusion bodies composed of fragments and other proteins. Conventional methods to measure and understand the contributions of various forms of mHTT-containing aggregates include fluorescence microscopy, western blot analysis, and filter trap assays. 
However, most of these methods are conformation specific, and therefore may not resolve the full state of mHTT protein flux due to the complex nature of aggregate solubility and resolution.
For the identification of aggregated mHTT and various modified forms and complexes, separation and solubilization of the cellular aggregates and fragments is mandatory. Here we describe a method to isolate and visualize soluble mHTT, monomers, oligomers, fragments, and an insoluble high molecular weight (HMW) accumulated mHTT species. HMW mHTT tracks with disease progression, corresponds with mouse behavior readouts, and has been beneficially modulated by certain therapeutic interventions1. This approach can be used with mouse brain, peripheral tissues, and cell culture but may be adapted to other model systems or disease contexts.

A method is described for fractionation of insoluble and soluble mutant huntingtin species from mouse brain and cell culture. The method described is useful for characterization and quantification of huntingtin protein flux and aids in analyzing protein homeostasis in disease pathogenesis and in the presence of perturbations

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Biyokimya

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Nörobilim

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Biyoloji

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Assaying Proteasomal Degradation in a Cell-free System in Plants

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular functions in virtually all eukaryotic organisms. Specifically, in plants, the ubiquitin/26S proteasome system (UPS) regulates protein degradation and contributes significantly to development of a wide range of processes, including immune response, development and programmed cell death. Moreover, increasing evidence suggests that numerous plant pathogens, such as Agrobacterium, exploit the host UPS for efficient infection, emphasizing the importance of UPS in plant-pathogen interactions.
The substrate specificity of UPS is achieved by the E3 ubiquitin ligase that acts in concert with the E1 and E2 ligases to recognize and mark specific protein molecules destined for degradation by attaching to them chains of ubiquitin molecules. One class of the E3 ligases is the SCF (Skp1/Cullin/F-box protein) complex, which specifically recognizes the UPS substrates and targets them for ubiquitination via its F-box protein component. To investigate a potential role of UPS in a biological process of interest, it is important to devise a simple and reliable assay for UPS-mediated protein degradation. Here, we describe one such assay using a plant cell-free system. This assay can be adapted for studies of the roles of regulated protein degradation in diverse cellular processes, with a special focus on the F-box protein-substrate interactions.

Targeted protein degradation represents a major regulatory mechanism for cell function. It occurs via a conserved ubiquitin-proteasome pathway, which attaches polyubiquitin chains to the target protein that then serve as molecular &#8220;tags&#8221; for the 26S proteasome. Here, we describe a simple and reliable cell-free assay for proteasomal degradation of proteins.

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

The ubiquitin-proteasome pathway for protein degradation has emerged as one of the most important mechanisms for regulation of a wide spectrum of cellular ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Protein Aggregate Formation Assay: A Method to Detect and Quantify Protein Aggregation in Cultured Cells upon Induction by Proteasome Inhibitor

Source: Lee, H. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56425">Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017)
In this video, we demonstrate a cell-based protein aggregation assay using proteasome inhibitors, which block proteasome activity, preventing misfolded, mutant proteins, fused to a fluorescent label, from undergoing ubiquitin-dependent proteasomal degradation, leading to their accumulation within the cell cytoplasm. The protein aggregates are then visualized and quantified by fluorescence microscopy.

Protein Agregat Oluşum Deneyi: Proteazom İnhibitörü ile İndüksiyon Üzerine Kültürlenmiş Hücrelerde Protein Agregasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Source: Lee, H. et al. Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells. J. Vis. Exp. (2017)
...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biyolojik Teknikler

Tahlil Teknikleri

Biyokimyasal analizler

Misfolding-Prone Protein Degradation Assay: A Technique to Monitor Misfolded Protein Degradation Using Cycloheximide Treatment and Detergent Fractionation

Source: Guo, L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54266">Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for misfolded proteins using cycloheximide treatment along with detergent fractionation. This method aids in studying the dynamics of misfolded proteins and uncovering the in-depth mechanisms of protein turnover.

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik

Source: Guo, L. et al., Assays for the Degradation of Misfolded Proteins in Cells. J. Vis. Exp. (2016).
This video describes a degradation assay for ...

Hücreler yanlış katlanmış proteinlerle degradasyonundan Tahliller

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

Yüksek içerik miktar Sod1 canlı hücreler Mutant Protein toplama oluşumu için tahlil geliştirme

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Bitkilerde bir Cell-serbest Sistemde proteozomal indirgenme Assaying

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay

Protein Agregat Oluşum Deneyi: Proteazom İnhibitörü ile İndüksiyon Üzerine Kültürlenmiş Hücrelerde Protein Agregasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Yanlış Katlanmaya Eğilimli Protein Bozunma Deneyi: Sikloheksimid Tedavisi ve Deterjan Fraksiyonlaması Kullanılarak Yanlış Katlanmış Protein Bozunmasını İzlemek İçin Bir Teknik