Bu proje maliyet Birliği'nden fon aldı (Gıda ve tarım maliyet eylem FA1205: AQUAGAMETE ve Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı Marie Sklodowska-Curie altında proje Impress (GA No 642893). PROiSER, bilimsel ekibin öğrenci Alberto Vendrell Bernabéu, onun etkin katılımı video kayıt bu proje için özel olarak teşekkür etmek istiyorum.

Yordamlar içeren hayvan konuyu olmuştur (2015/VSC/bezelye/00064) tarımsal üretim ve Hayvancılık Universitat Politècnica de València de genel yönünü tarafından onaylanmış.
1. Sperm Olgun Avrupa yılan balığı esaret altında toplamak
Not: kullanım Avrupa yılan balığı erkek tankları deniz suyu ve sabit sıcaklıkta (20 ° C) bir devridaim sistemi ile yapılmaktadır. Haftalık mayi enjeksiyonuyla (insan korionik gonadotropin (hCG); balık vücut ağırlığı g başına 1,5 IU) hormonları ile tedavi. Deniz suyu ile replasmanı ardından 3 gün yavaş yavaş başlayan tatlı su balık parkenizin (1/3 toplam su tankında) 2 günde bir tuzluluk 37,0 g/ml ulaşan kadar.
<ol><li>Yılan balığı 24 h hormonu enjeksiyon örnekleri ile daha iyi sperm kalitesini elde etmek için sonra anestezi.<ol>
<li>Anestezi önceden hazırlamak: benzokain 300 mg 100 mL % 70 etanol için ekleyin. Mix iyi ve 4 ° C'de depolayın</li>
		<li>Benzokain 60 mg/L son bir konsantrasyon ve mix düzgün sistem su 5 L ile esnek bir kovada sulandırmak.</li>
		<li>Balık kova sistemi su ve benzokain ile aktarın. Balık sakinleşene kadar birkaç dakika bekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Genital bölge su ile temizleyin ve dışkı, idrar veya deniz suyu sperm örneklerinin kirlenmesini önlemek için emici kağıt ile kuru.</li>
	<li>Karın bölgesinde hafif basınç uygulayın ve vakum pompası ile 15 mL Plastik tüpler içine sperm örnekleri toplamak. Sperm hacmi en fazla 6-7 mL, Erkek bağlı olarak.</li>
	<li>Motilite analizi yapılır kadar en az 1 h için 4 ° C'de sperm örnekleri sakla.</li>
</ol>2. soğutmak ve Sperm örnekleri sulandırmak
<ol><li>Diluter çözüm önceden hazırlayın. Not: Sperm örnekleri her tür için belirli extender çözümde seyreltilmiş.<ol>
<li>Harekete geçirmek orta yılan balığı sperm örnekleri (P1 orta) için hazır olun. 0,42 g sodyum bikarbonat, sodyum klorür, magnezyum klorür, potasyum klorür ve 250 ml distile su kalsiyum klorür 0,037 g 0,56 g 0,127 g 1.828 g ekleyin. Mix de çözülmeye. 4 ° C'de mağaza</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soğutucu blok 4 ° C'de sabit bir ısıda örnekleri korumak için ayarlayın. Sıcaklık stabilize kadar bekleyin.</li>
	<li>Her tür için diluter çözüm özel kullanarak sperm örnekleri sulandırmak. Not: Seyreltme oranı belirli türler ve protokol standartlaştırmak için tanımlanmalıdır. İlk olarak, sperm konsantrasyonu 3 ve 4 numaralı adımlarda açıklandığı gibi yazılım kullanarak hareketliliği ön analizinde elde edilen konsantrasyon dayalı tahmin ediyoruz. Bu analiz ile hareketliliği yüzdeye dayalı en iyi sperm örnekleri seçmek mümkündür. Bundan sonra en iyi örnekleri doğru konsantrasyon ile kullanarak deney verileri toplamak araştırmacı başlayabilirsiniz.<ol>
<li>Yılan balığı sperm örnekleri 1:50 oranında P1 ortamda sulandırmak. Yılan balığı seyreltilmiş sperm 500 µL hazırlamak için taze sperm örneği 50 µL ve P1 450 µL ekleyin. İyice karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sperm hareketliliği parametreleri değerlendirmek
<ol><li>
Set-up hareketliliği modül yazılım
	<ol>
<li>Soğutucu 4 ° C'de hazırladı ve bu stabilize kadar bekleyin.</li>
		<li>Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı açın ve Motilite modülüseçin. Kullanıcı adı ve parola gerekiyorsa oluşturun.</li>
		<li>Özellikler ' i seçin ve sperm analizi başlamadan önce istediğiniz parametreleri seçin.<ol>
<li>' I tıklatın türler üzerinde | Balık.</li>
			<li>Saniyede çerçeveler ve Görüntüleri numarası, her tür için en iyi teknik şartlarına bağlı olarak seçin. Saniyede 120 kare, her iki seçenek ayarlayın.</li>
			<li>Negatif kontrast seçin. Sperm hücreleri yörüngeleri16doğru yeniden inşası için zorunludur.</li>
			<li>Karşılık gelen Sayım odası ve video kamera Ölçek seçin. Denemede kullanılan büyütme objektif için video kamera kalibre. Sayım odası olarak SpermTrack10 ve 10 X ölçeği ayarlayın. Not: genel olarak, sayım odasında 10 µm derinliğe ve 10 X büyütme objektif tarafından önerilen koşullar onlar daha iyi tüm sperm elde odaklanan sağlamak ve en yüksek hücre sayısı yakalama beri. Ancak, bu hareketliliği analiz için optimal koşullar her türün önceki bir çalışma yapmak için tavsiye edilir.</li>
			<li>Parçacık alanı ve bağlantı her tür için ayarlayın. En küçük parçacık alan 2 µm2 ve 7 µm, bağlantı ayarlayın. Not: balık için parçacıklar alan aralıkları 2-5 µm ve bağlantı arasında en küçük değerini sperm elde hız ve kare hızı bağlıdır.</li>
			<li>Set-up kaydedin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Yakalamaseçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Avrupa yılan balığı Sperm yazılım ile analiz
	<ol>
<li>İçin bir çözüm aktivatör (yapay deniz suyu) 25 mL distile su ile % 2 BSA 0.946 g ticari tuz ekleyerek hazırlayın.</li>
		<li>500 mL aktivatör çözeltisi (yapay deniz suyu) alın ve soğutucu blok içinde yerleştirin. Not: bazı türlerin iyonu konsantrasyonu da önemli olabilir, ancak genel olarak, balık sperm bir ozmotik şok olay tarafından devreye girer. Deniz canlıları için orta hipertonik gerekirken tatlı türler için harekete geçirmek orta hipotonik osmolalite, olmalıdır.</li>
		<li>Sayım odası soğutma sahne altında koymak ve sıcaklık stabilize 4 ° C'ye kadar bekleyin</li>
		<li>Harekete geçirmek ve sperm hücreleri etkinleştirmek ve harekete geçirmek sonra 5-10 s arasında kayıt hareketliliği videoyu başlatmak için seyreltilmiş sperm karıştırın.<ol>
<li>Bir çözüm aktivatör ve yer 4 µL sayım odasına götür.</li>
			<li>Hafifçe sulandırılmış sperm sperm hücreleri zarar görmemesi için 3 kez microcentrifuge sallayarak lunaparkçı.</li>
			<li>0.5 µL seyreltilmiş sperm almak, harekete geçirmek ile karıştırın ve hızlı sayım odasında kapak koymak. Not: Bu adım 5'ten fazla almamalıdır s analiz en kısa zamanda başlamak için.</li>
			<li>Sperm hücreleri üzerinde odaklanmak ve az sayıda sperm hücreleri (Tamamlayıcı şekil 1A) arasındaki durdurma önlemek için hücreleri (150 ila 200 hücreleri) tarafından tanımlanan en iyi görsel alan bulun. Video yakalama hızı göre ayrılır sperm hücreleri parça elde etmek için seçin.</li>
			<li>Sonuçları daha düşük bir değişkenlik elde etmek ve daha önce olduğu gibi devam etmek için en iyi aralığı vardır 3-7 alanları elde etmek için yakalama seçin. Sayım odasının kapak yoğunlaşma önlemek için 120 s etkinleştirme sonrası kadar kayıt videoları.</li>
			<li>Tüm alanların genel bir görüntülemek için Çıkış ' ı seçin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. hareketliliği verileri elde etmek
<ol><li>Alanları seçin | Kısmi | Kaydet ve bir dosya adı seçin. Kaydet' i tıklatın. Not: Elektronik kısmi veriler, grafikler ve görüntülerin sperm hücreleri parça ortalama değerleri sağlar.</li>
	<li>Genel verileri seçmek | Dosya adı | Kaydetmek. Not: Veri tüm alanları tek tek sperm için kinetik değerleri sağlar.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu protokol için kullanılan sperm analiz yazılımı araştırmacılar tarafından Dünya çapında balık da dahil olmak üzere farklı türler için kullanılmıştır. Ancak, balık sperm değerlendirmesi etkileyen belirli bazı özellikleri var. Balık sperm hücreleri yüksek hızlı hızlı düşüşler ve hareketliliği, için kısa bir süre sonra harekete geçirmek yol harekete geçirmek anında gösterdi. Ayrıca, üreme sıcaklığını tür bağlıdır ve bazı durumlarda, yaklaşık 4 ° C<sup class="xref"...

Üreme etkinliğinin her iki gamet (yumurta ve sperm)1,2kalitesine bağlı. Bu uygun yavrular3,4gelişimi sağlayan başarılı gübreleme için katkıda bulunan önemli bir faktördür. Gamet kalite uygun değerlendirilmesi bir numune doğurganlık potansiyelini tanımlamak için en iyi araçtır.
Birden fazla erkek sperm karıştırma birçok su ticari tür4üretiminde yaygın bir uygulamadır. Ancak, erkekler arasında sperm değişkenlik sperm rekabete neden olabilir ve sonuç olarak, tüm erkekler eşit gen havuzunun5' e katkıda bulunuyorlar. Bu anlamda, hareketliliği gibi bireysel boşalmak/sperm özellikleri doğru değerlendirilmesi ile ilgili bireysel erkek üreme potansiyel ayrımcı bilgi elde etmek için esastır. Zaman ve tutarlılık eksikliği ve sonuçları6,7uyumsuzluk yol açar tecrübe gerektirdiği sperm motilitesi doğrudan gözlem ve öznel yanlış veri oluşturabilir. Ancak, güvenilir sperm kalitesi analizi2,4sağlayabilir birçok yenilikçi, hızlı ve kantitatif teknikler vardır.
Bilgisayar destekli sperm analizi sperm kalitesi8hakkında doğru veri sunmak için geliştirilmiştir. Bu teknoloji sperm hareketliliğini değerlendirmesini sağlar bir faz kontrast mikroskobu ile ilişkili yazılım geliştirme içerir. Ancak, kısıtlayıcı bir faktör hareketliliği parametre video kamera çerçeve oranıdır. Bireysel sperm yörüngeleri olan bağlı olarak sperm hücreleri üzerinde kafa kamçılı hareketi kalıpları3,9,10ile, ilişkili centroid pozisyon üst üste kare video kayıtları, 11. doğrusal hız (VSI), eğrisel hız (VCL) ve ortalama yol hız (VİP) ölçülen ana kinetik parametreleri vardır. VSL son nokta zaman bölünmüş sperm hücreleri tarafından alınan ve başlangıç arasındaki mesafedir. VCL sperm hücreleri tarafından alınan kesin yörünge boyunca gerçek hızı olduğunu. VAP yörünge türetilmiş bir düzleştirilmiş yol boyunca hızı olduğunu. Bu parametreler doğrusallık (LIN), doğruluk (STR), sallantı (WOB) ve yan kafa hareketi (SKİP'in) ve beat-cross frekans (BCF)4,10genlik gibi dayak ölçümleri de dahil olmak üzere ek kinetik bilgi sağlar.
Sperm analizi sistemi memeli türler için kullanılan özgün ve sistem gereksinimlerini donör (yaklaşık 37 ° C) vücut sıcaklığında çalışmasına biridir. Bu yazılım aynı zamanda balık türleri için kullanılabilir; Her ne kadar sperm analizi sonuçları hata azaltmak için bazı uyarlamalar yapmak gereklidir. Salmonids ve yılan balığı8,12, gibi bazı balık türlerinin fertilizasyon düşük sıcaklık (yaklaşık 4 ° C'de)2,4' te oluşur. Böylece, rahatsız çalışma koşulları önlemek için soğutma aygıtlarının geliştirilmelidir. Ayrıca, balık spermlerin meni içinde immotile ve motilite etkinleştirmek için bir ozmotik şok gerektirir. Deniz canlıları için orta hipertonik gerekirken tatlı türler için harekete geçirmek orta hipotonik osmolalite, olmalıdır. Ancak, bazı türler için salmonids iyonu konsantrasyonu da önemli3,4,9olabilir. Aktivasyon sonra balık sperm hareketliliği (az 2 dk)13,14 ve15güvenilir veri elde etmek için en iyi kare hızı belirlemek için hayati olan yüksek hız hızlı bir azalma ile karakterizedir.
Bu çalışma, tasarım ve soğutma sistemleri balık sperm örnekleri için geçerli hedeflerdir. Ayrıca, bu protokol bağlı olarak bu tür standart protokolleri kurulması için en uygun kare hızları belirleme tanımlar. Bu Protokolü'nün kullanılmasına Avrupa yılan balığı bir model olarak kullanarak balık seminal değerlendirme bağlamında yeni kapılar açılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:179px;">Argent Chemical Laboratories</td>
			<td style="width:151px;">hCG</td>
			<td style="width:167px;">Hormone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzocaine</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">E1501 Sigma</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">S5761 Sigma&#160;</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">1.06406 EMD Millipore</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">1374248 USP</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">potassium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">P3911-500G</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">C7902-500G</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">commercial salt</td>
			<td style="width:179px;">Aqua Medic&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Meersalz</td>
			<td>Activator solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">05470 Sigma</td>
			<td>Activator solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Falcon tubes 15 ml</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">T1943-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Falcon tubes support</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">R5651-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Eppendorfs</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">T9661-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Micropipet 20 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">PIPETMAN&#174; Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Micropipet 10 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z683787-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tips for micropipets 20 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z740030-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tips for micropipets 10 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z740028-2000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Spermtrack</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">Counting chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">TruMorph</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">TruMorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Microscope UB 200i Serie</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Cooler plate</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Prototype</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Cooler block</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Prototype</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISAS v1</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">ISAS</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fish sperm assessment using software and cooling devices

Gamet kalite değerlendirme için su ürünleri yetiştiriciliği için yararlı veri sağlayabilir yenilikçi, hızlı ve kantitatif teknikler vardır. Bilgisayarlı sistemler sperm analizi için çeşitli parametreleri ölçmek için geliştirilmiş ve en yaygın olarak ölçülen sperm motilitesi biridir.
Başlangıçta, her ne kadar da balık sperm analizi için kullanılabilir Bu bilgisayar teknolojisi memeli türleri için tasarlanmıştır. Balık sperm değerlendirmesi kısa hareketliliği süresi gibi aktivasyon sonra ve bazı durumlarda düşük sıcaklığı adaptasyon etkileyen belirli özellikleri var. Böylece, motilite analiz balık sperm analizi için daha verimli hale getirmek için yazılım ve donanım bileşenleri değiştirmek gereklidir. Memeli sperm için ısıtma yüzeyi sperm optimum sıcaklık tutmak için kullanılır. Ancak, bazı balık türleri için sperm az 2 dk için etkin kaldığı hareketliliği, süresini uzatmak için daha düşük bir sıcaklığa kullanmak avantajlıdır. Bu nedenle, soğutma cihazları, analiz üzerinde optik mikroskop dahil olmak üzere, zaman içinde sabit sıcaklıkta örnekleri soğutmak gereklidir. Bu iletişim kuralı için sperm analizi yazılımı kullanarak ve yeni soğutma aygıtlarının sonuçları optimize balık sperm motilitesi analizini açıklar.

Sperm motilitesi zaman etkisi analizi
Avrupa yılan balığı söz konusu olduğunda, statik sperm yüzdesi artmış 15 s 120 s sonra harekete geçirmek (den % %40.7 24,4) ve mobil ilerici sperm yüzdesi düşmüştür (den %36,9 %20,9) (Şekil 1A ve 1B). Hızına göre sperm hücreleri hızlı bir düşüş zamanla azalmıştır (Şekil 1 c</st...

Watch this Scientific Journal Video about Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices at JoVE.com

Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Mevcut iletişim kuralını kullanarak bilgisayar destekli sperm analizi ve soğutma aygıtlarının balık sperm değerlendirmesi bir yordam açıklanır. Yazılım bir hızlı, doğru ve kantitatif analiz yetiştiricilik üreme başarı geliştirmek için yararlı bir araç olabilir sperm hareketliliği göre balık sperm kalitesi verir.

Yazılımı kullanarak ve soğutma aygıtlarının balık Sperm değerlendirmesi

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

fish-sperm-assessment-using-software-and-cooling-devices

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Görüntüleme.  PROiSER R+D S.L.. Mevcut iletişim kuralını kullanarak bilgisayar destekli sperm analizi ve soğutma aygıtlarının balık sperm değerlendirmesi bir yordam açıklanır. Yazılım bir hızlı, doğru ve kantitatif analiz yetiştiricilik üreme başarı geliştirmek için yararlı bir araç olabilir sperm hareketliliği göre balık sperm kalitesi verir.

Video: Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals. Peromyscus species are used in a wide range of research including toxicology, epidemiology, ecology, behavioral, and genetic studies. Here they provide a useful model for demonstrations of artificial insemination. 

Methods similar to those displayed here have previously been used in several deer mouse studies, yet no detailed protocol has been published. Here we demonstrate the basic method of artificial insemination. This method entails extracting the testes from the rodent, then isolating the sperm from the epididymis and vas deferens. The mature sperm, now in a milk mixture, are placed in the female&#x2019;s reproductive tract at the time of ovulation. Fertilization is counted as day 0 for timing of embryo development. Embryos can then be retrieved at the desired time-point and manipulated.

Artificial insemination can be used in a variety of rodent species where exact embryo timing is crucial or hard to obtain. This technique is vital for species or strains (including most Peromyscus) which may not mate immediately and/or where mating is hard to assess. In addition, artificial insemination provides exact timing for embryo development either in mapping developmental progress and/or transgenic work. Reduced numbers of animals can be used since fertilization is guaranteed. This method has been vital to furthering the Peromyscus system, and will hopefully benefit others as well.

This protocol demonstrates methods for extracting sperm from the testes of males and then inseminating female mice. This procedure is useful when precise time is needed in developmental studies as well as transgenic work.

Farelerin Hasat Sperm ve Suni Tohumlama

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Biyoloji

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

I · Cryo Kit kullanarak Fare Sperm Kriyoprezervasyon ve Kurtarma

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the number of successful mating events rather than on maximizing survival and viability 1. Sperm competition represents the competition between males after copulating with the same female 2, in which their sperm are coincidental in time and space. This phenomenon has been reported in multiple species of plants and animals 3. For example, wild-caught D. melanogaster females usually contain sperm from 2-3 males 4. The sperm are stored in specialized organs with limited storage capacity, which might lead to the direct competition of the sperm from different males 2,5.
Comparing sperm competitive ability of different males of interest (experimental male types) has been performed through controlled double-mating experiments in the laboratory 6,7. Briefly, a single female is exposed to two different males consecutively, one experimental male and one cross-mating reference male. The same mating scheme is then followed using other experimental male types thus facilitating the indirect comparison of the competitive ability of their sperm through a common reference. The fraction of individuals fathered by the experimental and reference males is identified using markers, which allows one to estimate sperm competitive ability using simple mathematical expressions 7,8. In addition, sperm competitive ability can be estimated in two different scenarios depending on whether the experimental male is second or first to mate (offense and defense assay, respectively) 9, which is assumed to be reflective of different competence attributes.
Here, we describe an approach that helps to interrogate the role of different genetic factors that putatively underlie the phenomenon of sperm competitive ability in D. melanogaster.

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Differential sperm competitive ability among Drosophila males with distinct genotypes can be ascertained through double-mating experiments. Each of these experiments involves one of the males of interest and a reference male. Readily identifiable markers in the progeny allow inference of the fraction of individuals fathered by each male.

Sperm Rekabet Yeteneği in değerlendirilmesi farklılıklar<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Bıldırcın-ördek Chimeras kullanma Kraniyofasiyal Kalkınma için Türlere özgü Katılımlar değerlendirilmesi

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Gen kullanmak için bir protokol translasyonel araştırma için uygun hayvan modeli belirlemek için zenginleştirme çözümlemesi ayarla

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Sperm yoğunluğu degrade Santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...