이 프로젝트 비용 협회 로부터 자금 받았다 (음식과 농업 비용 액션 FA1205: AQUAGAMETE, 그리고 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 마리 Sklodowska-퀴리 아래 프로젝트 감동 (GA 없음 642893). 우리는 특히 학생에 게는 알베르토 벤드 렐 베르나,이 프로젝트의 비디오 기록에 그의 적극적인 참여에 대 한 PROiSER의 과학 팀에 게 감사 하 고 싶습니다.

절차와 관련 된 동물 주제 되었습니다 승인 (2015/VSC/완두콩/00064) 농업 생산 및 가축 Universitat Politècnica de València에서의 일반적인 방향으로.
1. 포로에서 성숙한 유럽 뱀장어에서 정자 수집
참고: 사용 유럽 장 어 남성 해 수와 일정 온도 (20 ° C)에서 재순환 시스템 탱크에서 유지. (인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG), 물고기 몸 무게의 g 당 1.5 IU) 주간 복 주사를 통해 호르몬 치료. 해 수와 교체 뒤 점차 시작 3 일 민물 물고기 순응 (탱크에서 총 수의 1/3) 37.0 g/mL의 염 분을 도달할 때까지 매 2 일.
<ol><li>더 나은 품질의 정자 샘플을 얻기 위해 호르몬 주사 후 24 h 장 어를 anesthetize.<ol>
<li>사전에 마 취 준비: 70% 에탄올 100ml에 benzocaine의 300 밀리 그램을 추가. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 저장</li>
		<li>60 mg/L의 최종 농도 고 제대로 혼합 시스템 물 5 l 유연한 버킷에서 benzocaine를 희석.</li>
		<li>Benzocaine와 시스템 물 양동이에 물고기를 전송 합니다. 물고기는 진정 될 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>물으로 음부를 선택을 취소 하 고 정자 샘플 대변, 소변 또는 바닷물의 오염을 피하기 위하여 흡수 성 종이 함께 건조.</li>
	<li>복 부 지역에 부드러운 압력을 적용 하 고 15 mL 플라스틱 튜브 진공 펌프를 사용 하 여 정자 샘플을 수집. 정자 볼륨 남성에 따라 최대 6-7 mL.</li>
	<li>운동 성 분석 실시 될 때까지 적어도 1 시간에 4 ° C에서 정자 샘플을 유지.</li>
</ol>2. 냉동 및 정자 샘플을 희석
<ol><li>Diluter 솔루션을 미리 준비 합니다. 참고: 각 종족에 대 한 특정 extender 솔루션 정자 샘플을 희석 한다.<ol>
<li>장 어 정자 샘플 (P1 매체)에 대 한 비-활성 제 매체를 준비 합니다. 나트륨 중 탄산염, 염화 나트륨, 염화 마그네슘, 염화 칼륨 및 증류수 250 mL를 염화 칼슘의 0.037 g 0.56 g의 0.127 g의 1.828 g의 0.42 g을 추가 합니다. 믹스 잘 분해 하. 4 ° c.에 게</li>
	</ol>
</li>
	<li>일정 한 온도에서 샘플을 유지 하기 위해 4 ° C에서 쿨러 블록을 설정 합니다. 온도 안정화 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>사용 하 여 각 종족에 대 한 diluter 솔루션 특정 정자 샘플을 희석. 참고: 희석 비율 특정 종족 이며, 표준화 프로토콜을 정의 합니다. 첫째, 정자 농도 3, 4 단계에 설명 된 대로 소프트웨어를 사용 하 여 운동 성의 사전 분석에서 얻은 농도에 따라 예상 됩니다. 이 분석, 그것은 또한 운동 성의 비율에 따라 최고의 정자 샘플을 선택할 수입니다. 이 후, 연구원 최고의 샘플을 사용 하 여 정확한 농도와 실험에 대 한 데이터 수집을 시작할 수 있습니다.<ol>
<li>1시 50분의 비율로 P1 매체에서 장 어 정자 샘플을 희석. 500 µ L 희석 장 어 정자의 준비, 신선한 정자 샘플의 50 µ L과 p 1의 450 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 평가 정자 운동 성 매개 변수
<ol><li>
설정 소프트웨어의 운동 성 모듈
	<ol>
<li>4 ° C에서 쿨러 무대를 설정 하 고 안정 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>소프트웨어를 오픈 하 고 운동 성 모듈을 선택 합니다. 필요한 경우 사용자 이름 및 암호를 만듭니다.</li>
		<li>속성 을 선택 하 고 정자 분석을 시작 하기 전에 원하는 매개 변수를 선택 합니다.<ol>
<li>종 클릭 | 물고기.</li>
			<li>각 종족에 대 한 최고의 기술 조건에 따라 초당 프레임 및 이미지 번호를선택 합니다. 초당 120 이미지에서 두 옵션을 설정 합니다.</li>
			<li>네거티브 대비를 선택 합니다. 그것은 정 충 궤도16의 정확한 개조에 대 한 필수입니다.</li>
			<li>해당 계산 챔버 와 비디오 카메라의 규모 를 선택 합니다. 실험에 사용 된 확대 렌즈에 대 한 비디오 카메라를 보정. 세 실으로 SpermTrack10 및 10 X 규모를 설정 합니다. 참고: 일반적으로, 세 실에서 10 µ m의 깊이 10 X의 확대 렌즈는 권장된 조건 때문에 그들은 모든 정 충의 더 나은 초점을 제공 하 고 세포의 가장 높은 번호를 캡처. 그러나, 각 종족의 운동 성 분석에 대 한 최적의 조건의 이전 연구를 확인 하는 것이 좋습니다.</li>
			<li>각 종족에 대 한 입자 영역 및 연결 을 조정 합니다. 2 µ m2 와 7 µ m에서 연결 최소 입자 영역을 설정 합니다. 참고: 물고기, 2-5 µ m, 연결 사이 입자 영역 범위의 최소 값에 따라 다릅니다 정 충 속도 및 프레임 속도.</li>
			<li>설정을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>캡처를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
소프트웨어와 함께 유럽 장 어 정자를 분석
	<ol>
<li>25 ml 증류수 2 %BSA 상업 소금 0.946 g를 추가 하 여 활성 솔루션 (인공 해 수)를 준비 합니다.</li>
		<li>활성 솔루션 (인공 해 수)의 500 mL 고 쿨러 블록에. 참고: 일반적으로, 생선 정자 활성화 됩니다 삼투성 충격 이벤트, 일부 수 종에 대 한 이온 농도 또한 중요할 수 있지만. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다.</li>
		<li>냉각 단계 아래 세 챔버를 넣고 온도 4 ° c.에 안정화 될 때까지 기다립니다</li>
		<li>활성 제와 희석된 정자 정 충을 활성화 하 고 운동 성 비디오 활성화 후 5-10 s 사이 녹화 시작을 섞는다.<ol>
<li>세 실에서 활성 솔루션 및 장소 4 µ L를 가져가 라.</li>
			<li>부드럽게 정 충 세포에 손상을 방지 하는 microcentrifuge 3 번 흔들어 희석된 정자 균질.</li>
			<li>희석의 0.5 µ L를가지고, 활성기를 함께 혼합 하 고 신속 하 게 계산 챔버에 커버를 넣어. 참고:이 단계 5 개 이상 걸리지 않을 겁니다 최대한 빨리 분석을 시작 하는 s.</li>
			<li>정 충 세포에 집중 하 고 최고의 시각적 영역, 정 충 (150 ~ 200 셀)을 피하기 위해 셀 (보충 그림 1A) 사이의 차단의 낮은 수에 의해 정의 됩니다. 속도 따라 구분 되는 정 충 트랙을 캡처 비디오 를 선택 합니다.</li>
			<li>결과에서 낮은 변화 하기 전에 진행 하는 최적의 간격을 3 ~ 7 필드를 캡처 를 선택 합니다. 세 실의 표지에 응축을 피하기 위하여 120 s 후 정품 인증까지 기록 영화.</li>
			<li>출구 는 모든 분야의 일반적인 보기를 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 운동 데이터를 얻기
<ol><li>필드를 선택 | 부분 | 저장 파일 이름을 선택 하 고. 저장을 클릭 합니다. 참고: 스프레드시트 부분 데이터, 차트 및 정 충 트랙의 이미지의 평균값을 제공합니다.</li>
	<li>일반 데이터 선택 | 파일 이름 | 저장. 참고: 데이터를 개별 정 충의 모든 필드에 대 한 운동 값을 제공합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 사용 하는 정자 분석 소프트웨어 사용 되었습니다 연구자에 의해 전세계 물고기를 포함 하 여 다른 종족에 대 한. 그러나, 생선 몇 가지 특정 기능을 정자 평가 영향을 미칠 수 있다. 물고기 정 충 신속 하 게 거부 하 고 활성화 후 운동 성의 짧은 시간에 지도 활성화의 순간에 높은 속도 보여주었다. 게다가, 재생산의 온도 종 종속적 이며, 어떤 경우에 약 4 ° C2<sup...

생식의 효능 두 gametes (계란과 정자)1,2의 품질에 따라 달라 집니다. 이 성공적인 수정, 허용 가능한 자손3,4의 개발에 기여 하는 주요 요소입니다. 배우자 품질의 편리한 평가 표본의 불 임 가능성을 정의 하기 위한 최고의 도구입니다.
여러 남성에서 정자를 혼합 많은 수생 상업 종4의 생산에 있는 관행 이다. 그러나, 남성 사이 정자 가변성 정자 경쟁으로 이어질 수 있습니다 그리고, 따라서, 모든 남성 동등에 기여 하는 유전자5. 이런이 의미에서 개별 정액/정 충 등의 기능 운동, 올바른 평가 잠재적인 개별 남성 불 임에 대 한 차별적인 정보를 얻기 위해 기본적 이다. 정자의 운동 성의 직접 관찰 시간과 경험, 일관성의 부족, 결과6,7의 호환성 요구 하는 때 부정확 하 고 주관적인 데이터를 생성할 수 있습니다. 그러나, 믿을 수 있는 정자 품질 분석2,4를 제공할 수 있는 많은 혁신적이 고 신속한 양적 기술이 있다.
컴퓨터 기반 정자 분석 정자 품질8에 대 한 정확한 데이터를 제공 하기 위해 개발 되었다. 이 기술은 위상 대비 현미경 정자 운동 성 평가 수와 관련 된 소프트웨어의 개발을 포함 합니다. 그러나, 운동 성 매개 변수의 제한 요소 비디오 카메라의 프레임 속도입니다. 개별 정 충 정 충을 기반으로하는 궤도 머리 중심 위치 연속 프레임에서 비디오 녹화의 flagellar 운동 패턴3,,910, 와 상관 11. 주요 운동 매개 변수 측정은 직선 속도 (VSL), 곡선 속도 (VCL)와 평균 경로 속도 (VAP). VSL 시작과 끝점 시간으로 나눈 정 충에 의해 촬영 사이의 거리입니다. 소스는 정 충에 의해 정확한 궤적을 따라 실제 속도입니다. VAP 궤적의 파생된 매끄러운된 경로 따라 속도입니다. 이러한 매개 변수는 선형성 (린), 직진도 (STR), 동요 (WOB) 및 측면 머리 운동 (ALH)와 비트 크로스 주파수 (BCF)4,10의 진폭 같은 박동 측정을 포함 한 추가 운동 정보를 수 있습니다.
정자 분석 시스템은 원래 포유류 종, 사용 되 고 시스템에 대 한 요구 사항 중 하나는 기증자 (약 37 ° C)의 온도에서 동작 하는 것입니다. 물고기 종;이 소프트웨어를 사용하실 수 있습니다. 비록, 그것은 정자 분석 결과의 오류를 줄이기 위해 몇 가지 적응을 만들 필요가 있다. Salmonids 등 장 어8,12, 일부 어 종에 수정 낮은 온도 (약 4 ° C)2,4에 발생합니다. 따라서, 냉각 장치 불편 한 작업 조건을 피하기 위해 개발 되어야 한다. 또한, 물고기 정 충은 정액에서 운동 하 고는 삼투성 충격 운동 성 활성화에 필요한. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다. 그러나, 일부 종 salmonids로 이온 농도 또한 수 있습니다 중요 한3,,49. 활성화 후 생선 정자 운동 성 (2 분 미만)13,14 및 신뢰할 수 있는 데이터15를 최적의 프레임 속도 결정 하는 중요 한 되 고 높은 속도의 급속 한 감소에 의해 특징입니다.
이 연구의 목표는 디자인 생선 정자 샘플에 대 한 냉각 시스템을 적용 하는. 또한,이 프로토콜에는 종에 따라 표준 프로토콜의 설립에 대 한 최적의 프레임 속도 확인 하는 방법을 정의 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 모델로 유럽 장 어를 사용 하 여 물고기 정액 평가의 맥락에서 새로운 문을 엽니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:745px;" width="745">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Human Chorionic Gonadotropin</td>
			<td style="width:179px;">Argent Chemical Laboratories</td>
			<td style="width:151px;">hCG</td>
			<td style="width:167px;">Hormone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzocaine</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">E1501 Sigma</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">S5761 Sigma&#160;</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:249px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">1.06406 EMD Millipore</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">magnesium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">1374248 USP</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">potassium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">P3911-500G</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">C7902-500G</td>
			<td style="width:167px;">P1 medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">commercial salt</td>
			<td style="width:179px;">Aqua Medic&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Meersalz</td>
			<td>Activator solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">BSA</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">05470 Sigma</td>
			<td>Activator solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Falcon tubes 15 ml</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">T1943-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Falcon tubes support</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">R5651-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Eppendorfs</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">T9661-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Micropipet 20 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Gilson</td>
			<td style="width:151px;">PIPETMAN&#174; Classic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Micropipet 10 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z683787-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tips for micropipets 20 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z740030-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Tips for micropipets 10 &#181;l</td>
			<td style="width:179px;">Merck</td>
			<td style="width:151px;">Z740028-2000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Spermtrack</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">Counting chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">TruMorph</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">TruMorph</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Microscope UB 200i Serie</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">Microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Cooler plate</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Prototype</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:249px;">Cooler block</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Prototype</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ISAS v1</td>
			<td style="width:179px;">PROiSER</td>
			<td style="width:151px;">ISAS</td>
			<td>Software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fish sperm assessment using software and cooling devices

배우자 품질 평가 대 한 양식 업에 대 한 유용한 데이터를 제공할 수 있는 혁신적이 고 빠른, 양적 기술이 있다. 정자 분석을 위한 전산화 시스템 여러 매개 변수를 측정 하기 위해 개발 되었다 이며 가장 일반적으로 측정의 한 정자 운동 성.
처음, 그것은 또한 물고기 정자 분석에 사용할 수 있지만이 컴퓨터 기술 포유류 종, 위해 설계 되었습니다. 물고기는 정자 평가 짧은 운동 시간 활성화 후, 경우에 따라 낮은 온도 적응에 영향을 미칠 수 있는 특정 기능을가지고 있습니다. 따라서, 그것은 보다 효율적으로 운동 성 분석 생선 정자 분석을 위한 소프트웨어 및 하드웨어 구성 요소를 수정 하는 데 필요한입니다. 포유류 정자에 대 한 난방 격판덮개는 정 충의 최적의 온도 유지 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 일부 어 종에 대 한 그것은 유리를 사용 하 여 낮은 온도 때문에 정자 2 분 미만 대 한 활성 상태로 유지 운동의 기간을 연장. 따라서, 냉각 장치는 일정 온도에서 샘플 분석, 광학 현미경에 포함 하 여의 시간 동안 냉장 보관 하는 데 필요한. 이 프로토콜 물고기 정자 운동 성 정자 분석을 위한 소프트웨어를 사용 하 여 및 새로운 냉각 장치를 최적화 하는 결과의 분석을 설명 합니다.

정자의 운동 성에 시간 효과의 분석
유럽 장 어의 경우 정적 정 충의 비율 15에서 증가 120 s s 후 활성화 (24.4%에서 40.7%), 그리고 모바일 진보적인 정 충의 비율 감소 (36.9%에서 20.9%) (그림 1A 그리고 1B). 속도에 따라, 정 충 세포 감소 (그림 1C 및 1d) ?...

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Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

생선 정자 평가 소프트웨어를 사용 하 여 및 냉각 장치

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.7K 조회수.  PROiSER R+D S.L.. 현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

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Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals. Peromyscus species are used in a wide range of research including toxicology, epidemiology, ecology, behavioral, and genetic studies. Here they provide a useful model for demonstrations of artificial insemination. 

Methods similar to those displayed here have previously been used in several deer mouse studies, yet no detailed protocol has been published. Here we demonstrate the basic method of artificial insemination. This method entails extracting the testes from the rodent, then isolating the sperm from the epididymis and vas deferens. The mature sperm, now in a milk mixture, are placed in the female&#x2019;s reproductive tract at the time of ovulation. Fertilization is counted as day 0 for timing of embryo development. Embryos can then be retrieved at the desired time-point and manipulated.

Artificial insemination can be used in a variety of rodent species where exact embryo timing is crucial or hard to obtain. This technique is vital for species or strains (including most Peromyscus) which may not mate immediately and/or where mating is hard to assess. In addition, artificial insemination provides exact timing for embryo development either in mapping developmental progress and/or transgenic work. Reduced numbers of animals can be used since fertilization is guaranteed. This method has been vital to furthering the Peromyscus system, and will hopefully benefit others as well.

This protocol demonstrates methods for extracting sperm from the testes of males and then inseminating female mice. This procedure is useful when precise time is needed in developmental studies as well as transgenic work.

수확 정자와 마우스의 인공 수정

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

연구

생물학

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

분리 및 체외에서</em의> 활성화 Caenorhabditis 엘레간스 정자

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the number of successful mating events rather than on maximizing survival and viability 1. Sperm competition represents the competition between males after copulating with the same female 2, in which their sperm are coincidental in time and space. This phenomenon has been reported in multiple species of plants and animals 3. For example, wild-caught D. melanogaster females usually contain sperm from 2-3 males 4. The sperm are stored in specialized organs with limited storage capacity, which might lead to the direct competition of the sperm from different males 2,5.
Comparing sperm competitive ability of different males of interest (experimental male types) has been performed through controlled double-mating experiments in the laboratory 6,7. Briefly, a single female is exposed to two different males consecutively, one experimental male and one cross-mating reference male. The same mating scheme is then followed using other experimental male types thus facilitating the indirect comparison of the competitive ability of their sperm through a common reference. The fraction of individuals fathered by the experimental and reference males is identified using markers, which allows one to estimate sperm competitive ability using simple mathematical expressions 7,8. In addition, sperm competitive ability can be estimated in two different scenarios depending on whether the experimental male is second or first to mate (offense and defense assay, respectively) 9, which is assumed to be reflective of different competence attributes.
Here, we describe an approach that helps to interrogate the role of different genetic factors that putatively underlie the phenomenon of sperm competitive ability in D. melanogaster.

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Differential sperm competitive ability among Drosophila males with distinct genotypes can be ascertained through double-mating experiments. Each of these experiments involves one of the males of interest and a reference male. Readily identifiable markers in the progeny allow inference of the fraction of individuals fathered by each male.

정자 경쟁의 능력에 대한 평가의 차이<em&gt; 초파리</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

유전자를 사용 하 여 프로토콜 변환 연구에 대 한 적절 한 동물 모델을 식별 하기 위해 농축 분석 설정

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

생선 정자 평가 소프트웨어를 사용 하 여 및 냉각 장치

요약

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수확 정자와 마우스의 인공 수정

형광 현장에서 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

분리 및 체외에서 활성화 Caenorhabditis 엘레간스* 정자*

이미징 C. 엘레간스 태아

전 · Cryo 키트를 사용하여 마우스 정자 Cryopreservation 및 복구

정자 경쟁의 능력에 대한 평가의 차이

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

메추라기 오리 키메라를 사용하여 두개 안면 개발에 종 - 특정 포스트 평가

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