이 프로젝트 비용 협회 로부터 자금 받았다 (음식과 농업 비용 액션 FA1205: AQUAGAMETE, 그리고 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 마리 Sklodowska-퀴리 아래 프로젝트 감동 (GA 없음 642893). 우리는 특히 학생에 게는 알베르토 벤드 렐 베르나,이 프로젝트의 비디오 기록에 그의 적극적인 참여에 대 한 PROiSER의 과학 팀에 게 감사 하 고 싶습니다.

절차와 관련 된 동물 주제 되었습니다 승인 (2015/VSC/완두콩/00064) 농업 생산 및 가축 Universitat Politècnica de València에서의 일반적인 방향으로.
1. 포로에서 성숙한 유럽 뱀장어에서 정자 수집
참고: 사용 유럽 장 어 남성 해 수와 일정 온도 (20 ° C)에서 재순환 시스템 탱크에서 유지. (인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG), 물고기 몸 무게의 g 당 1.5 IU) 주간 복 주사를 통해 호르몬 치료. 해 수와 교체 뒤 점차 시작 3 일 민물 물고기 순응 (탱크에서 총 수의 1/3) 37.0 g/mL의 염 분을 도달할 때까지 매 2 일.
<ol><li>더 나은 품질의 정자 샘플을 얻기 위해 호르몬 주사 후 24 h 장 어를 anesthetize.<ol>
<li>사전에 마 취 준비: 70% 에탄올 100ml에 benzocaine의 300 밀리 그램을 추가. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 저장</li>
		<li>60 mg/L의 최종 농도 고 제대로 혼합 시스템 물 5 l 유연한 버킷에서 benzocaine를 희석.</li>
		<li>Benzocaine와 시스템 물 양동이에 물고기를 전송 합니다. 물고기는 진정 될 때까지 몇 분 정도 기다립니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>물으로 음부를 선택을 취소 하 고 정자 샘플 대변, 소변 또는 바닷물의 오염을 피하기 위하여 흡수 성 종이 함께 건조.</li>
	<li>복 부 지역에 부드러운 압력을 적용 하 고 15 mL 플라스틱 튜브 진공 펌프를 사용 하 여 정자 샘플을 수집. 정자 볼륨 남성에 따라 최대 6-7 mL.</li>
	<li>운동 성 분석 실시 될 때까지 적어도 1 시간에 4 ° C에서 정자 샘플을 유지.</li>
</ol>2. 냉동 및 정자 샘플을 희석
<ol><li>Diluter 솔루션을 미리 준비 합니다. 참고: 각 종족에 대 한 특정 extender 솔루션 정자 샘플을 희석 한다.<ol>
<li>장 어 정자 샘플 (P1 매체)에 대 한 비-활성 제 매체를 준비 합니다. 나트륨 중 탄산염, 염화 나트륨, 염화 마그네슘, 염화 칼륨 및 증류수 250 mL를 염화 칼슘의 0.037 g 0.56 g의 0.127 g의 1.828 g의 0.42 g을 추가 합니다. 믹스 잘 분해 하. 4 ° c.에 게</li>
	</ol>
</li>
	<li>일정 한 온도에서 샘플을 유지 하기 위해 4 ° C에서 쿨러 블록을 설정 합니다. 온도 안정화 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>사용 하 여 각 종족에 대 한 diluter 솔루션 특정 정자 샘플을 희석. 참고: 희석 비율 특정 종족 이며, 표준화 프로토콜을 정의 합니다. 첫째, 정자 농도 3, 4 단계에 설명 된 대로 소프트웨어를 사용 하 여 운동 성의 사전 분석에서 얻은 농도에 따라 예상 됩니다. 이 분석, 그것은 또한 운동 성의 비율에 따라 최고의 정자 샘플을 선택할 수입니다. 이 후, 연구원 최고의 샘플을 사용 하 여 정확한 농도와 실험에 대 한 데이터 수집을 시작할 수 있습니다.<ol>
<li>1시 50분의 비율로 P1 매체에서 장 어 정자 샘플을 희석. 500 µ L 희석 장 어 정자의 준비, 신선한 정자 샘플의 50 µ L과 p 1의 450 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 평가 정자 운동 성 매개 변수
<ol><li>
설정 소프트웨어의 운동 성 모듈
	<ol>
<li>4 ° C에서 쿨러 무대를 설정 하 고 안정 될 때까지 기다립니다.</li>
		<li>소프트웨어를 오픈 하 고 운동 성 모듈을 선택 합니다. 필요한 경우 사용자 이름 및 암호를 만듭니다.</li>
		<li>속성 을 선택 하 고 정자 분석을 시작 하기 전에 원하는 매개 변수를 선택 합니다.<ol>
<li>종 클릭 | 물고기.</li>
			<li>각 종족에 대 한 최고의 기술 조건에 따라 초당 프레임 및 이미지 번호를선택 합니다. 초당 120 이미지에서 두 옵션을 설정 합니다.</li>
			<li>네거티브 대비를 선택 합니다. 그것은 정 충 궤도16의 정확한 개조에 대 한 필수입니다.</li>
			<li>해당 계산 챔버 와 비디오 카메라의 규모 를 선택 합니다. 실험에 사용 된 확대 렌즈에 대 한 비디오 카메라를 보정. 세 실으로 SpermTrack10 및 10 X 규모를 설정 합니다. 참고: 일반적으로, 세 실에서 10 µ m의 깊이 10 X의 확대 렌즈는 권장된 조건 때문에 그들은 모든 정 충의 더 나은 초점을 제공 하 고 세포의 가장 높은 번호를 캡처. 그러나, 각 종족의 운동 성 분석에 대 한 최적의 조건의 이전 연구를 확인 하는 것이 좋습니다.</li>
			<li>각 종족에 대 한 입자 영역 및 연결 을 조정 합니다. 2 µ m2 와 7 µ m에서 연결 최소 입자 영역을 설정 합니다. 참고: 물고기, 2-5 µ m, 연결 사이 입자 영역 범위의 최소 값에 따라 다릅니다 정 충 속도 및 프레임 속도.</li>
			<li>설정을 저장 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>캡처를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
소프트웨어와 함께 유럽 장 어 정자를 분석
	<ol>
<li>25 ml 증류수 2 %BSA 상업 소금 0.946 g를 추가 하 여 활성 솔루션 (인공 해 수)를 준비 합니다.</li>
		<li>활성 솔루션 (인공 해 수)의 500 mL 고 쿨러 블록에. 참고: 일반적으로, 생선 정자 활성화 됩니다 삼투성 충격 이벤트, 일부 수 종에 대 한 이온 농도 또한 중요할 수 있지만. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다.</li>
		<li>냉각 단계 아래 세 챔버를 넣고 온도 4 ° c.에 안정화 될 때까지 기다립니다</li>
		<li>활성 제와 희석된 정자 정 충을 활성화 하 고 운동 성 비디오 활성화 후 5-10 s 사이 녹화 시작을 섞는다.<ol>
<li>세 실에서 활성 솔루션 및 장소 4 µ L를 가져가 라.</li>
			<li>부드럽게 정 충 세포에 손상을 방지 하는 microcentrifuge 3 번 흔들어 희석된 정자 균질.</li>
			<li>희석의 0.5 µ L를가지고, 활성기를 함께 혼합 하 고 신속 하 게 계산 챔버에 커버를 넣어. 참고:이 단계 5 개 이상 걸리지 않을 겁니다 최대한 빨리 분석을 시작 하는 s.</li>
			<li>정 충 세포에 집중 하 고 최고의 시각적 영역, 정 충 (150 ~ 200 셀)을 피하기 위해 셀 (보충 그림 1A) 사이의 차단의 낮은 수에 의해 정의 됩니다. 속도 따라 구분 되는 정 충 트랙을 캡처 비디오 를 선택 합니다.</li>
			<li>결과에서 낮은 변화 하기 전에 진행 하는 최적의 간격을 3 ~ 7 필드를 캡처 를 선택 합니다. 세 실의 표지에 응축을 피하기 위하여 120 s 후 정품 인증까지 기록 영화.</li>
			<li>출구 는 모든 분야의 일반적인 보기를 선택 합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 운동 데이터를 얻기
<ol><li>필드를 선택 | 부분 | 저장 파일 이름을 선택 하 고. 저장을 클릭 합니다. 참고: 스프레드시트 부분 데이터, 차트 및 정 충 트랙의 이미지의 평균값을 제공합니다.</li>
	<li>일반 데이터 선택 | 파일 이름 | 저장. 참고: 데이터를 개별 정 충의 모든 필드에 대 한 운동 값을 제공합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 사용 하는 정자 분석 소프트웨어 사용 되었습니다 연구자에 의해 전세계 물고기를 포함 하 여 다른 종족에 대 한. 그러나, 생선 몇 가지 특정 기능을 정자 평가 영향을 미칠 수 있다. 물고기 정 충 신속 하 게 거부 하 고 활성화 후 운동 성의 짧은 시간에 지도 활성화의 순간에 높은 속도 보여주었다. 게다가, 재생산의 온도 종 종속적 이며, 어떤 경우에 약 4 ° C2<sup...

생식의 효능 두 gametes (계란과 정자)1,2의 품질에 따라 달라 집니다. 이 성공적인 수정, 허용 가능한 자손3,4의 개발에 기여 하는 주요 요소입니다. 배우자 품질의 편리한 평가 표본의 불 임 가능성을 정의 하기 위한 최고의 도구입니다.
여러 남성에서 정자를 혼합 많은 수생 상업 종4의 생산에 있는 관행 이다. 그러나, 남성 사이 정자 가변성 정자 경쟁으로 이어질 수 있습니다 그리고, 따라서, 모든 남성 동등에 기여 하는 유전자5. 이런이 의미에서 개별 정액/정 충 등의 기능 운동, 올바른 평가 잠재적인 개별 남성 불 임에 대 한 차별적인 정보를 얻기 위해 기본적 이다. 정자의 운동 성의 직접 관찰 시간과 경험, 일관성의 부족, 결과6,7의 호환성 요구 하는 때 부정확 하 고 주관적인 데이터를 생성할 수 있습니다. 그러나, 믿을 수 있는 정자 품질 분석2,4를 제공할 수 있는 많은 혁신적이 고 신속한 양적 기술이 있다.
컴퓨터 기반 정자 분석 정자 품질8에 대 한 정확한 데이터를 제공 하기 위해 개발 되었다. 이 기술은 위상 대비 현미경 정자 운동 성 평가 수와 관련 된 소프트웨어의 개발을 포함 합니다. 그러나, 운동 성 매개 변수의 제한 요소 비디오 카메라의 프레임 속도입니다. 개별 정 충 정 충을 기반으로하는 궤도 머리 중심 위치 연속 프레임에서 비디오 녹화의 flagellar 운동 패턴3,,910, 와 상관 11. 주요 운동 매개 변수 측정은 직선 속도 (VSL), 곡선 속도 (VCL)와 평균 경로 속도 (VAP). VSL 시작과 끝점 시간으로 나눈 정 충에 의해 촬영 사이의 거리입니다. 소스는 정 충에 의해 정확한 궤적을 따라 실제 속도입니다. VAP 궤적의 파생된 매끄러운된 경로 따라 속도입니다. 이러한 매개 변수는 선형성 (린), 직진도 (STR), 동요 (WOB) 및 측면 머리 운동 (ALH)와 비트 크로스 주파수 (BCF)4,10의 진폭 같은 박동 측정을 포함 한 추가 운동 정보를 수 있습니다.
정자 분석 시스템은 원래 포유류 종, 사용 되 고 시스템에 대 한 요구 사항 중 하나는 기증자 (약 37 ° C)의 온도에서 동작 하는 것입니다. 물고기 종;이 소프트웨어를 사용하실 수 있습니다. 비록, 그것은 정자 분석 결과의 오류를 줄이기 위해 몇 가지 적응을 만들 필요가 있다. Salmonids 등 장 어8,12, 일부 어 종에 수정 낮은 온도 (약 4 ° C)2,4에 발생합니다. 따라서, 냉각 장치 불편 한 작업 조건을 피하기 위해 개발 되어야 한다. 또한, 물고기 정 충은 정액에서 운동 하 고는 삼투성 충격 운동 성 활성화에 필요한. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다. 그러나, 일부 종 salmonids로 이온 농도 또한 수 있습니다 중요 한3,,49. 활성화 후 생선 정자 운동 성 (2 분 미만)13,14 및 신뢰할 수 있는 데이터15를 최적의 프레임 속도 결정 하는 중요 한 되 고 높은 속도의 급속 한 감소에 의해 특징입니다.
이 연구의 목표는 디자인 생선 정자 샘플에 대 한 냉각 시스템을 적용 하는. 또한,이 프로토콜에는 종에 따라 표준 프로토콜의 설립에 대 한 최적의 프레임 속도 확인 하는 방법을 정의 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 모델로 유럽 장 어를 사용 하 여 물고기 정액 평가의 맥락에서 새로운 문을 엽니다.

<table><tbody><tr><td>Human Chorionic Gonadotropin</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>hCG</td><td>Hormone</td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Merck</td><td>E1501 Sigma</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>sodium bicarbonate</td><td>Merck</td><td>S5761 Sigma&amp;nbsp;</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Merck</td><td>1.06406 EMD Millipore</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>magnesium chloride</td><td>Merck</td><td>1374248 USP</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>potassium chloride</td><td>Merck</td><td>P3911-500G</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>calcium chloride</td><td>Merck</td><td>C7902-500G</td><td>P1 medium</td></tr><tr><td>commercial salt</td><td>Aqua Medic&amp;nbsp;</td><td>Meersalz</td><td>Activator solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>05470 Sigma</td><td>Activator solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 ml</td><td>Merck</td><td>T1943-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes support</td><td>Merck</td><td>R5651-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfs</td><td>Merck</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 20 &amp;micro;l</td><td>Gilson</td><td>PIPETMAN&amp;reg; Classic</td><td></td></tr><tr><td>Micropipet 10 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z683787-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tips for micropipets 20 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z740030-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Tips for micropipets 10 &amp;micro;l</td><td>Merck</td><td>Z740028-2000EA</td><td></td></tr><tr><td>Spermtrack</td><td>PROiSER</td><td>Counting chamber</td><td></td></tr><tr><td>TruMorph</td><td>PROiSER</td><td>TruMorph</td><td></td></tr><tr><td>Microscope UB 200i Serie</td><td>PROiSER</td><td>Microscope</td><td></td></tr><tr><td>Cooler plate</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototype</td></tr><tr><td>Cooler block</td><td>PROiSER</td><td></td><td>Prototype</td></tr><tr><td>ISAS v1</td><td>PROiSER</td><td>ISAS</td><td>Software</td></tr></tbody></table>

fish sperm assessment using software and cooling devices

배우자 품질 평가 대 한 양식 업에 대 한 유용한 데이터를 제공할 수 있는 혁신적이 고 빠른, 양적 기술이 있다. 정자 분석을 위한 전산화 시스템 여러 매개 변수를 측정 하기 위해 개발 되었다 이며 가장 일반적으로 측정의 한 정자 운동 성.
처음, 그것은 또한 물고기 정자 분석에 사용할 수 있지만이 컴퓨터 기술 포유류 종, 위해 설계 되었습니다. 물고기는 정자 평가 짧은 운동 시간 활성화 후, 경우에 따라 낮은 온도 적응에 영향을 미칠 수 있는 특정 기능을가지고 있습니다. 따라서, 그것은 보다 효율적으로 운동 성 분석 생선 정자 분석을 위한 소프트웨어 및 하드웨어 구성 요소를 수정 하는 데 필요한입니다. 포유류 정자에 대 한 난방 격판덮개는 정 충의 최적의 온도 유지 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 일부 어 종에 대 한 그것은 유리를 사용 하 여 낮은 온도 때문에 정자 2 분 미만 대 한 활성 상태로 유지 운동의 기간을 연장. 따라서, 냉각 장치는 일정 온도에서 샘플 분석, 광학 현미경에 포함 하 여의 시간 동안 냉장 보관 하는 데 필요한. 이 프로토콜 물고기 정자 운동 성 정자 분석을 위한 소프트웨어를 사용 하 여 및 새로운 냉각 장치를 최적화 하는 결과의 분석을 설명 합니다.

정자의 운동 성에 시간 효과의 분석
유럽 장 어의 경우 정적 정 충의 비율 15에서 증가 120 s s 후 활성화 (24.4%에서 40.7%), 그리고 모바일 진보적인 정 충의 비율 감소 (36.9%에서 20.9%) (그림 1A 그리고 1B). 속도에 따라, 정 충 세포 감소 (그림 1C 및 1d) ?...

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Fish Sperm Assessment Using Software and Cooling Devices

현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

생선 정자 평가 소프트웨어를 사용 하 여 및 냉각 장치

For gamete quality evaluation, there are innovative, rapid, and quantitative techniques that can provide useful data for aquaculture. Computerized systems ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.7K 조회수.  PROiSER R+D S.L.. 현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

연구

유전학

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, specifically the generation of homozygous gynogenetic diploids is useful in genetic analysis because it allows the direct production of homozygotes from a single heterozygous mother. This article describes a modified protocol for ploidy duplication based on a heat pulse during the first cell cycle, Heat Shock 2 (HS2). Through inhibition of centriole duplication, this method results in a precise cell division stall during the second cell cycle. The precise one-cycle division stall, coupled to unaffected DNA duplication, results in whole genome duplication. Protocols associated with this method include egg and sperm collection, UV treatment of sperm, in vitro fertilization and heat pulse to cause a one-cell cycle division delay and ploidy duplication. A modified version of this protocol could be applied to induce ploidy changes in other animal species.

A modified protocol for ploidy manipulation uses a heat shock to induce a one-cycle stall in cytokinesis in the early embryo. This protocol is demonstrated in the zebrafish but may be applicable to other species.

열 충격이 치료와 제브라 피쉬 배아의 배수성 조작

Manipulation of ploidy allows for useful transformations, such as diploids to tetraploids, or haploids to diploids. In the zebrafish Danio rerio, ...

발생학

Handling and Treatment of Male European Eels (Anguilla anguilla) for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and maturation. As of yet, weekly injections of human chorionic gonadotropin (hCG) have proved to maturate males after just 5-6 weeks of treatment, producing high volumes of high-quality sperm during several weeks. In addition, sperm cryopreservation protocols using different extenders, cryoprotectants and cooling and thawing times have been previously described for European eel. Here, we show that Tanaka&#180;s extender solution can be directly used for fertilization or for cryopreservation, making unnecessary the usage of different types of solutions and dilutions. Furthermore, the use of methanol as a cryoprotectant makes this protocol easy to use as methanol has low toxicity and does not activate the sperm. The sperm does not need to be cryopreserved immediately after the addition of the cryoprotectant, and it can be used long after being thawed. Moreover, sperm motility is still high after thawing although it is lower than that of fresh sperm. The aim of this work is to show the best available protocol for European eel handling, maturation, and sperm cryopreservation.

Handling and Treatment of Male European Eels Anguilla anguilla for Hormonal Maturation and Sperm Cryopreservation

Protocols for European eel maturation and sperm cryopreservation have been improved over the last years. This article describes the best protocol available using human chorionic gonadotropin (hCG) for inducing maturation and methanol as cryoprotectant.

처리와 치료의 남성 유럽 뱀장어 (앵귈라 앵귈라) 호르몬 성숙 및 정자 Cryopreservation

During the last years, several research groups have been working on the development and improvement of new protocols for the European eel handling and ...

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

높은 처리량 Zebrafish의 정자 Cryopreservation에 대한 방법과 체외에서 수정

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

생물학

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

형광 현장에서</em인간의 정자에서> 하이브리드화 (물고기) 프로토콜

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Fluorimetric Techniques for the Assessment of Sperm Membranes

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, motility and progressive motility, and sperm morphology and viability. However, none of these assessments is good enough to predict the semen quality. Given that maintenance of sperm viability and fertilization potential depends on membrane integrity and intracellular functionality, evaluation of these parameters might enable a better prediction of sperm fertilization competence. Here, we describe three feasible methods to evaluate sperm quality using specific fluorescent probes combined with fluorescence microscopy or flow cytometry analyses. Analyses assessed plasma membrane integrity using 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and propidium iodide (PI), acrosomal membrane integrity using fluorescein isothiocyanate-conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and mitochondrial membrane integrity using 5,5&#39;,6,6&#39;-tetra-chloro-1,1&#39;,3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolyl carbocyanine iodide (JC-1). Combinations of these methods are also presented. For instance, use of annexin V combined with PI fluorochromes enables assessing apoptosis and calculating the proportion of apoptotic sperm (apoptotic index). We believe that these methodologies, which are based on examining spermatozoon membranes, are very useful for the evaluation of sperm quality.

Here, we present methodologies to evaluate spermatozoan membrane integrity, a cellular feature associated with sperm fertilization competence. We describe three techniques for the fluorimetric assessment of sperm membranes: simultaneous staining with specific fluorescent probes, fluorescence microscopy, and advanced sperm-dedicated flow cytometry. Examples of combining the methodologies are also presented.

정자 세포 막의 평가 대 한 Fluorimetric 기법

Standard spermiograms describing sperm quality are mostly based on the physiological and visual parameters, such as ejaculate volume and concentration, ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

Zebrafish Spermatogonia 전체 Testes 바늘의 cryopreservation 몰입 울트라-빠른 냉각

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology research. Medaka is also used extensively to investigate vertebrate reproduction, which is an essential biological function as it allows a species to perpetuate. Sperm quality is an important indicator of male fertility and, thus, reproduction success. Techniques for extracting sperm and sperm analysis are well documented for many species, including teleost fish. Collecting sperm is relatively simple in larger fish but can be more complicated in small model fish as they produce less sperm and are more delicate. This article, therefore, describes two methods of sperm collection in the small model fish, Japanese medaka: testes dissection and abdominal massage. This paper demonstrates that both approaches are feasible for medaka and shows that abdominal massage can be performed a repeated number of times as the fish quickly recover from the procedure. This article also describes a protocol for computer-assisted sperm analysis in medaka to objectively assess several important indicators of medaka sperm quality (motility, progressivity, duration of motility, relative concentration). These procedures, specified for this useful small teleost model, will greatly enhance understanding of the environmental, physiological, and genetic factors influencing fertility in vertebrate males.

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

This article describes two quick and efficient methods for collecting sperm from the small model fish medaka (Oryzias latipes), as well as a protocol for reliably assessing sperm quality using computer-assisted sperm analysis (CASA).

Teleost 모델의 정자 수집 및 컴퓨터 보조 정자 분석 일본 메다 카 (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

U-Shaped Horizontal Swimming Technique for Preparing High-Quality Sperm with Low DNA Fragmentation Index

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and viscous seminal plasma. High-quality sperm refers to progressively motile spermatozoa with normal morphology, which often exhibit a lower DNA fragmentation index (DFI) and higher fertilization potential. Preparing high-quality sperm is a critical step in human-assisted reproductive technology. The traditional sperm preparation method, discontinuous density gradient centrifugation (DGC), is time-consuming and labor-intensive. Repeated centrifugation can damage sperm DNA, thereby affecting subsequent fertilization and embryo development. This study introduces a U-shaped horizontal swimming (UHS) method for preparing intracytoplasmic sperm injection (ICSI) sperm, which significantly eliminates the detrimental effects of&#160;centrifugation on sperm DNA.&#160;The UHS method involves creating a UHS lane using a fertilization medium within an ICSI operating dish. A 10 &#181;L fertilization medium microdroplet is placed at the starting point on the left side of the UHS lane to hold the semen. Two additional 10 &#181;L fertilization medium buffer droplets are positioned at intervals along the left middle section of the lane, with all droplets connected by fertilization medium. The dish is then covered with culture oil and incubated overnight at 37 &#176;C with 6% CO2 to equilibrate. Subsequently, 3 &#181;L of semen is added to the microdroplet at the starting point. High-quality spermatozoa swim to the right side of the UHS lane, facilitating their suction into the ICSI injection needle. Dead sperm, cell debris, and other viscous impurities largely remain at the initial point or in the buffer droplets. We simultaneously processed 21 semen samples using both UHS and DGC techniques and compared their DFI. The results demonstrated that the DFI in the DGC group was 5.5% &#177; 3.2%, whereas the DFI in the UHS group was 1.7% &#177; 1.1%. The difference between the two groups was statistically significant (P &#60; 0.05).

This protocol describes a method for screening high-quality sperm with a low DNA fragmentation index by utilizing sperm motility characteristics and thigmotaxis. The method employs a U-shaped horizontal swimming lane, enabling high-quality sperm to reach the opposite side through buffer droplets, while dead sperm, cell debris, and impurities are excluded.

낮은 DNA 단편화 지수로 고품질 정자를 준비하기 위한 U자형 수평 수영 기술

Human semen is a complex mixture comprising progressively motile spermatozoa, non-progressively motile spermatozoa, immotile spermatozoa, cell debris, and ...

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