Bu çalışma Diş Ulusal Enstitüsü ve Kranyofasyal Research (NIDCR) F32 hibe (DE021929) JLF ve RAS bir NIDCR R01 hibe DE016402 tarafından finanse edildi

1.. Tungsten iğneler hazırlayın <ol><li> Çubuk viraj değil ki tel kesiciler kullanarak yarısında bir tungsten çubuk kesti. </li><li> 5 borosilikat cam 3/4 Pasteur pipet konik ucundan çubuk geçirin. </li><li> Camdan dışarı çubuk yapışma yaklaşık 3/4 bırakarak, bir tutkal tabancası için kullanılan tutkal sopa &quot;sıcak eriyik yapışkan&quot; (HMA), küçük bir boncuk ile pipet için çubuk uygun. HMA hızlı bir şekilde tutkal yakmak ve siyah duman üretmek için özen gösterilerek, bir alkol alev eridi olmalıdır. </li><li> Forseps bir çift kullanarak, 45 ° &#39;lik açı ulaşana kadar (yaklaşık 1/4 üst ucundan olarak) tungsten çubuğunun uç viraj. </li><li> Pasteur pipeti tutarak, bir propan meşalesi alev içine tungsten çubuğun ucunun yaklaşık 1/8 yerleştirin. Ucu sabit ve aleve tam dik tutun. </li><li> Alevin dışarı iğne çekin an Tungs küçücük bir turuncu lekeiğne kapalı on sinekler. </li></ol> 2.. Spemann Pipetler hazırlayın <ol><li> Kısa konik ötesinde cam erimeye başlayana kadar bir Bunsen beki kullanarak, bir Pasteur pipet dar ucuna ısı. Alev çıkarın ve pipet mühürlü olana kadar ucu çekin. Yaklaşık 0.7-1.0 mm OD sahip şevli kısmının bir kısmı kalır emin olun. Konik yaklaşık 4 cm kapalı mühürlü ucunu kırın. </li><li> Pipet geniş (açık) ucuna lastik tüp yaklaşık 2 ft (60 cm) takın. Hava Pasteur pipet şevli kısmı ile geçiş sağlamak için kauçuk hortumun diğer ucunda darbe. </li><li> Bağlı bir kalem ile bir alev meşale propan yakıt silindir kullanarak, sadece konik başından altında pipet bir tarafında bir oval alan ısı. Basınç cüzi bir miktarı (lette başlangıcını söylemek için gerekli basınç yaklaşık miktarı ile kauçuk borular yoluyla, çok yavaşça ve sürekli üfleyinkonuşma düzeyinde r &quot;P&quot;). Cam bir tarafta yumuşak olur ve dışa toka başladığında, hızla alevden pipet kaldırmak ve lastik borular yoluyla sabit ve istikrarlı darbe. Bu ısıtılmış cam parçası ince olduğu, pop sosis şeklinde bir kabarcık oluşmasına neden olur. Kabarcık çok küçük ise, erime ve tekrar cam üfleme deneyin. Camda son açık pencere geniş uzun (12.7 mm) &#39;in 0,5 (6,35 mm), 0.25 civarında olmalıdır. </li><li> Sivri ucunu işaret yukarıya, yavaşça pipet girmesini cam parçaları önlemek için tüp yoluyla üflerken cam atık kabı içine balonu kazıyın. </li><li> Propan alev kullanarak, kabarcık ve yangın lehçe açık pencerenin kenarları arasında kalan kenarlarını yakmak. Pipet şaftı eritmek için özen gösterin. </li><li> Bir elmas nokta kalem kullanarak, penceresinden (30 mm) yaklaşık 1.25 pipet sivri ucunu puan ve ucu koparakforseps ile pipet açılış temiz (kırık veya düzensiz ipuçları ile ıskarta pipet) kesilir böylece. </li><li> Forseps kullanılarak ve bükük kısmı dikey bir düzlemde olacak şekilde, bir alkol, bir brülör ile alev kenar, yaklaşık 60 ° &#39;lik bir açı için ucundan (9.5 mm)&#39; de pipet 0.375 dar kısmını viraj sırasında pencere açma solak kullanım için sağ-elli kullanım ve 11:00 için 01:00 pozisyondadır. Bu adım en bir taslak serbest muhafaza yapılır. </li><li> Yangın lehçe bir mikroskop altında alkol alev kullanarak ucu. Ucunu kapatmak değil yuvarlak açılış tutmak ve herhangi bir daralma olmadan düzeltmek için değil emin olun. </li><li> , Kauçuk borudan yapılmış bir 1 (25 mm) parça kesin% 70 etanol ile boru parça sprey ve pencere açıklığı tamamen kapalı kadar pipet milin üzerine boru kaydırın. Bu Spemann pipet &quot;diyafram&quot; olarak çalışır. </li><li> Bir lateks kauçuk 2 ml ampul yerleştirinpipet açık alt bitti. Ampul Spemann pipet negatif basıncı korur. </li><li> , Spemann bir pipet kullanarak uygulama, bir mikroskop altında bir başka belirgin bir noktaya bir Petri kabındaki belirgin bir nokta çapı, yaklaşık 100-200 um&#39;lik kromatografisi boncuk aktarın. </li><li> Spemann pipet temizlemek için, alt pamuk veya gazlı bez ile kaplı ve distile su ve cam deterjan ile dolu uzun bir beher içinde, aşağı ucu, kauçuk ampulü ve yer pipet kaldırmak. </li></ol> 3.. Yumurta Sterilize ve inkübe <ol><li> % 70 etanol ile yumurta silin ve plastik yumurta tepsiler üzerinde yumurta yerleştirin. </li><li> 37.5 ° C ve 85-87% ısıtılmış bir inkübatör yumurta ayarlayın. </li><li> Onlar HH9.5, bıldırcın ve ördek için 48 saat boyunca yaklaşık 26 saat ulaşana kadar kuluçkaya. </li></ol> 4. Pencere Yumurta <ol><li> Iç kabuk m ponksiyon için özen, forseps ile yumurtanın üst dış kabuk küçük bir parça kaldırmazarı böylesine. </li><li> 1 inç iğne ile bir 18 G ile bir şırınga kullanarak, yumurta en dar ucunda bir delik açmak ve albümin yaklaşık 1-2 ml geri. </li><li> Kabuğunda delik ve delinme işareti üzerinde şeffaf bant yerleştirin. </li><li> Kavisli makas kullanılarak (saydam bant üzerinden) yumurtanın üst yüzeyi boyunca bir &quot;pencere&quot; kes. </li></ol> 5.. Embriyolar canlandırın ve Cerrahi hazırlanın <ol><li> Bir cam çubuk kullanılarak, yavaşça embriyo üzerinde Nötr Kırmızı küçük bir miktar (Hank BSS içerisinde 0.02 g / ml) fırça. </li><li> Vitellin membran kesin ve bir alev bilenmiş tungsten iğne kullanılarak embriyo üzerinden çekin. </li><li> Pencere üzerinde saydam bant koyarak yumurtayı yeniden mühürlemek. </li></ol> 6.. Donör Embriyo gelen Donör Doku ayırın <ol><li> Donör embriyo yumurtanın üzerinde penceresinden bandı çıkarın. </li><li> Donör embriyo komşu ektodermden sinir kat kesmek için, sid hem yarıklar yapmak(yukarıda tarif edildiği gibi imal edilmiştir) bir alev keskinleştirilmiş tungsten iğne kullanılarak nöral tüp es. </li><li> Daha sonra, greft istenilen ön ve arka seviyede nöral tüpü boyunca kesilmiş ve nöral tüpün geri kalanından ayrı greft. </li><li> Bir Spemann pipet veya mikropipet diğer türlerinden birini kullanarak donör embriyo sinir kat çıkarın. </li><li> Sonra, ev sahibi yumurta üzerine penceresinden bandı çıkarın ve nakli alacak nöral tüp bölgeye bitişik ev sahibi embriyo yanında donör sinir kat yerleştirmek için Spemann pipet kullanın. </li></ol> 7. Ana Doku ayırın ve Donör doku nakli <ol><li> Donör ile yapıldığı gibi, ev sahibi embriyo nöral tüp sinir kat ayırın. Donör doku olarak eşit büyüklükte bir greft çıkarmak için özen. </li><li> Yavaşça uzak embriyo bu konak doku itin. </li><li> Daha sonra, kör bir iğne veya bir tungsten mi yuvarlatılmış ucu ilecropipette, yavaşça uygun ön-arka ve ön-ventral yönelimleri bakımı, donör sinir konak nöral tüp içine kat taşıyın. Greft kenarlarında sıkışmış olduğundan emin olun, ancak karıştırmak veya alttaki dokulara zarar değil emin olun. Orijinal yönü notun Nötr Kırmızı gelen donör doku veya diferansiyel boyama herhangi bir asimetri izlemenize yardımcı olmak için. Biz de fotoğraf-belge eşlik kesilmiş doku yanı sıra kimerasıyla donör embriyo hemen ameliyatı takiben. </li><li> Ev sahibi embriyo kuruma belirtileri gösteriyorsa, steril tuzlu yumurta ilave edilmelidir. </li><li> Şimdi, dikkatle yeniden mühür ve yumurta etiket ve yavaşça kimerik embriyo analizi için istenilen aşamaya gelişebilir bir yüksek nem inkübatör (% 70-80) iade. </li></ol> Kimeralar 8. Koleksiyonu <ol><li> Taze yapılmış soğuk Serra&#39;nın sabitleştirici kimerik embriyolar toplamak ve hemen bir ro üzerine koyun emin olunBir O / N tespit boyunca 4 ° C&#39;de cker. Bu, anti-bıldırcın antikoru ile bıldırcın hücrelerin daha hassas bir şekilde tespit sağlayacaktır. </li><li> Gen ifadesi RT-QPCR ile analiz için, önceden RNA ekstre sıvı azot içinde doğrudan embriyolar dondurma. </li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Nöral krest embriyo boyunca yoğun göç ve kraniofasiyal iskeletine katkıda kondrosit ve osteoblast dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri, içine ayırır geçici embriyonik hücre popülasyonu. Bıldırcın-ördek kimerik sisteminde nöral kret nakli kraniofasiyal iskelet gelişimini düzenleyen doku etkileşimleri ve sinyal yollarının anlayışımıza büyük katkıda bulunmuştur. Ancak, düz kas hücreleri, adipositleri, melanosit, Schwann hücreleri ve nöronlar oluşturmak için nöral büyük potansiyeli göz önüne alındığında, bıldırcın-ördek kimera sistem özellikle kök hücre biyolojisi hızlı ilerlemesi ile birlikte gelecek uygulamaları için muazzam bir potansiyele sahiptir ve rejeneratif tıp. Bıldırcın ve ördek hem ticari yetiştirilen türler olduğu için, nispeten ucuz döllenmiş yumurta hazır bir tedarik Çiftliklerin çeşitli edinilebilir. Böylece, bu teknik araştır erişilebilir olmalıdıronun bütçeleri ve tesis alanı geniş bir aralıkta faaliyet göstermektedir. Bu teknik çok güçlü olmasına rağmen, bazı sınırlamalar da kalır. Diğer cerrahi teknikleri gibi, bıldırcın-ördek kimeralarının kalitesi ve canlılığı araştırmacı cerrahi beceri güveniyor, ve bu nedenle, bu tür olanlar kullanan fare gibi diğer modellere kıyasla gibi deneyler arasında daha arası ve içi bireysel farklılıklar olacaktır genetik. Ayrıca, yeniden üretilebilirlik ve her nakli başarısına katkıda gelişimi ve bireysel embriyolar aşamalarının oranlarında varyasyon da vardır. Avian embriyoları, aynı zamanda su kaybı çok duyarlıdır ve ameliyat sırasında bu nedenle önemli bir adım minimuma mikroskop altında, düşük zaman ışık seviyelerini tutmak arasında, mümkün olduğu kadar çok yumurta bantla kapatılır, ve ameliyat sonrası inkübatör içinde yüksek nem kurumayı önlemek. Kimeralar canlılığı, u açısındanbu oranlar eski toplama aşamasını azaltabilirsiniz rağmen sually arasında% 50-75, hayatta. Cerrahi tipik 4-6 saat oturumda, deneyimli bir cerrah 10-15 kuruntulardan üretebilir. Nakli başarısı da araçların kalitesine büyük ölçüde bağlıdır. İyi araçları daha tutarlı, tekrarlanabilir sonuçlara yol. Tungsten iğne yapmak için bir propan meşale kullanarak son derece keskin iğneler yapılmasını sağlar. Bu alevin boyutunu denetler, çünkü kullanılan meşale türü büyük bir fark yaratıyor. Elektrolitik bileme da kullanılabilir, ancak bu yaklaşım bile keskin iğneler üreten yakın gelmiyor. Iğneler düz yapılabilir böylece yerine biriktirilen tel tungsten çubuklar kullanın. Spemann mikropipet, zaman alıcı ve yapmak zor, doku transferi için ideal bir araç iken. Pipet, farklı büyüklükte açıklıkları ile özelleştirilebilir, ve tekrar tekrar kullanılabilir. Istimal için kritik bir faktörga Spemann mikropipet embriyo yüzeyine ucu dokunmadan önce pipet bazı sıvı sahip olmaktır. Iletişim embriyo üzerinde menisküs ile yapıldığında sıvı bir kısmı her zaman dışarı akar. Biraz diyafram kadar izin yavaşça pipet içine donör greft dokusu berbat ise diyafram basılması, sıvı ve greft dokusu çok hassas dışarı sağlar. Diyafram pozitif basınç biraz bakımı aktarımı sırasında pipet ucu da verici aşı doku tutar ve diyafram küçük bir ek basınç verici doku grefti kasıtlı olarak konakta yerleştirilmesini sağlar. Depolama ve sterilizasyon sırasında Spemann pipet korunması için, geniş ucundan ampulü çıkarın ve dikkatli ampul içine konik ucu takın. Alüminyum folyo ile üst kapak ve ameliyat öncesi, otoklav, bir cam test tüpünde Spemann pipet yerleştirin. Birden pipetler yeniden olduktan sonraAmeliyat için yeniden sterilize edilecek Ady, pipetler ters damıtılmış su ve cam deterjan aynı çözelti içinde kaynamaya yaklaşık onları ısı ve daha sonra damıtılmış su ile tekrar tekrar yıkanır. Bireysel tüplerin Otoklav pipetler. Bunlar karanlık ve sert olunca diyafram ve kauçuk ampulü oluşturan kauçuk boru birkaç sterilizasyonlarda sonra değiştirilmesi veya gerekir. Bu protokolün bileşenleri çok tehlikeli ekipmanları içerir. Örneğin, Spemann Mikropipet yapmak için Prosedür üç alev tipleri hem de ısıtma, üfleme çekme, bükme, kesme, parlatma ve cam içerir. Bu nedenle, uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyen gözlük gibi güvenliği artırır ve bir laboratuvar önlüğü kritik olduğunu. Ayrıca, birçok kişi muzdarip, ya, yumurta alerji gelişebilir yumurta tutarken her zaman eldiven kullanmak için potansiyel var çünkü. Akılda bu önlemler, bıldırcın-ördek kimerik sistemi ile iBirçok gelecek uygulamalar vardır sa, güvenli, verimli, ve nispeten ulaşılabilir bir yöntemdir.

Yüz iskelet ektodermal ve Endodermal epitel katmanları 1-11 çevrili nöral ve mezodermal mezenşimden oluşan birden fazla yüz süreçlerin büyüme ve füzyon gelişir. Her süreçte morfojenetik olaylar mezenşimin ve çevresindeki epitelya 12-16 arasında belirgin sinyal etkileşimler tarafından yönetilir. Bu sinyal etkileşimleri ve / veya onların aşağı efektörlere değişiklikler hastalık fenotipleri katkıda bulunmak ve aynı zamanda kraniofasiyal iskelet 17, 18 evrimi ile ilgili olabilir. Bu nedenle, doku etkileşiminin zamanlamasını ve niteliğini durulaştırmada yüz iskeletinin gelişimsel ve evrimsel biyoloji anlayışımızı arttırmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Doku etkileşimleri araştırmak için kimerik embriyoların kullanılması gelişimsel biyoloji içinde uzun bir geçmişi vardır. Bu yaklaşım Hans Spemann ve onun laboratuar tarafından öncülük edilmiştirFarklı amfibi türlerin embriyolarının arasındaki dokuların nakli ile embriyonik &quot;organizatörleri&quot; keşfetti. Spemann el becerileri özel araçlar, özellikle Spemann pipet yaptığı kalkınma tarafından tamamlanmaktadır mikro-cerrahi teknikleri bir usta oldu. Viktor Hamburger Spemann Nobel ödülünü neden orijinal nakli deneyler yapıldı, hangi zaman, 1920&#39;lerde Freiburg Hans Spemann laboratuvarında bir yüksek lisans öğrencisi oldu. Hamburger 1935 yılında St Louis Washington Üniversitesi taşındı, o Deneysel Embriyoloji 19 onun Kılavuzunda bir Spemann mikropipet yapma sürecini ayrıntılı. Drew Noden Massachusetts, Amherst Üniversitesi ve daha sonra Cornell Üniversitesi taşındıktan sonra, Noden imalatı ve bıldırcın-civciv kuruntulardan ilgili yaptığı cerrahi nakli için Spemann mikropipetler kullanmaya devam etti. 1972&#39;ye kadar Washington Üniversitesi&#39;nde Hamburger laboratuvarında bir yüksek lisans öğrencisi oldu. &amp;# 160;. Bir yüksek lisans öğrencisi, 1995-1998 Cornell Drew Nodén eğitimli yazarlar (Rich Schneider) biri Spemann mikropipet yapmak için aşağıdaki protokol Hamburger ve Nodén tarafından yazılı açıklamalara göre, ve sonradan yaptığınız değişiklikleri içerir iken Schneider tarafından. Kraniofasiyal geliştirme çalışmaları için ve özellikle nöral krest hücrelerinin katkılarını anlamak için bıldırcın-civciv kimeralarının kullanımı Le Douarin ark 20 yorumlanan 1970&#39;lerin başında Nodén tarafından ve Le DOUARIN tarafından öncülük edilmiştir. Bu yaklaşım genel olarak birçok çalışma ve çok sayıda diğer araştırmacılar 1, 4, 5, 21-38 tarafından kabul edilmiştir. Büyüme ve bıldırcın ve civciv morfolojisi eşdeğer oranları hücre kaderinin ve soy izleme çalışması için içlerinde nakli idealdir. Ancak, bıldırcın ve civciv arasındaki benzerlikler, morfolojik değişimler inddonor hücreler tarafından uced deşifre etmek zordur. Buna karşılık, diğer kuş kimerik sistemleri 39-50 embriyolar anatomik olarak farklı yapmak mekanizmaları incelemek için bir yol olarak yerli ördek dahil ettik. Daha spesifik olarak, bıldırcın-ördek kimerik sistemi ev sahibi, ve tersi üzerinde donörün etkilerini sezmek için birden çok yarar sağlar. İlk olarak, bıldırcın ve ördek embriyolar gen ekspresyonu (Şekil 1 A ve B) &#39;nin diferansiyel etki için tahlil ile oluşum arasında verici veya konak-spesifik mekanizmaları keşfetmek için doğrudan bir yol sağlar vücut boyutu ve şekli, içinde farklıdır. İkincisi, bıldırcın ve ördek embriyo bıldırcın 17 günde çıkım ve ördek 28 gün içinde kuluçka ile, olgunlaşma oldukça farklı fiyatlar var. Nakledilen sinir ucu ana ortam içindeki iç olgunlaşma oranını muhafaza eder ve bu nedenle, geçici gen ekspresyonunda değişiklikler, doku etkileşimlerinin, histogenez ve morfojenezinin tanımlanması mümkündür51-57. Son olarak, anti-bıldırcın nükleer antikor (PN ¢ Q) verici ve ev sahibi hücresel katılım her yerde bulunan bir bıldırcın hücrelerinde ifade ancak ördek hücrelerinde bulunmaz bir proteini tanıma ile birbirinden ayırt kalıcı olmasını sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

Kimerik embriyoların nesil cep kaderlerini, doku etkileşimleri ve histolojik ve omurgalı embriyolarının morfolojik gelişimine türe özgü katkılarını araştırmak için yaygın ve güçlü bir yaklaşımdır. Özellikle, kimerik embriyo kullanımı kraniofasiyal kompleksinin türe spesifik bir morfolojiye yönlendirilmesinde nöral önemini oluşturmuştur. Burada tarif edilen yöntem, oldukça farklı kraniofasiyal morfolojiye sahip, iki kuş türleri, ördek, bıldırcın ve kullanır. Bu yöntem büyük ölçüde kraniofasiyal kompleksi türe özgü desen moleküler ve hücresel düzenleme soruşturma kolaylaştırır. Bıldırcın ve ördek kimerik embriyolar deneyler zaten nöral krest aracılı doku etkileşimleri ve kraniofasiyal iskelet, kas, ve kabuklarıyla türe özgü desen düzenleyen hücre özerk davranışlar ortaya koymuştur. Nöral krest türevlerinin büyük çeşitlilik önemli bir potansiyele işaretomurgalı geliştirme, hastalık ve evrimini anlamak için bıldırcın-ördek kimerik sisteminin gelecekteki uygulamalar için.

Önce, daha fazla analiz için, transplantın etkinliği test edilmesi gerekmektedir. Histolojik için, morfolojik, veya gen ekspresyon doku örneklerinin analizleri, bıldırcın hücreleri 36 anlatıldığı gibi Q ¢ PN antikoru kullanılarak immunohistokimyasal tarafından tespit edilmelidir. RNA analizleri için, ilgi konusu dokulara türe özgü katkılar, PCR tabanlı bir strateji 58 kullanılarak hesaplanabilir. Nakli etkinliği doğrulandıktan sonra, bundan başka morfolojik veya moleküler parametreler kimeralar olarak değerlendirilebilir. Donör nöral krest hücreleri ve uygun histogenezi ve kraniofasiyal kompleksinin morfogenetiğine altında yatan çevreleyen konak-kaynaklı dokular arasındaki etkileşim, önceden yoğun çalışmalar yapılmıştır. Özellikle, nöral tepe mezenşimin yüzün türe özel bir morfoloji 7, 13, 51, 59, tüy model 52, kas model 56 yönlendirir </s<html> kadar&gt; ve kıkırdak 53, konak gen ifadesinin düzenlenmesi yoluyla 57. Örneğin, nöral krest mesenkimi zamansal BMP4 ifadeyi 55 düzenleyerek mandibulada zaman kemik formları belirler. Son zamanlarda, araştırmalar çok erken kraniofasiyal gelişiminde meydana gelen doku etkileşimleri üzerinde yoğunlaşmış. Bu bağlamda, bıldırcın-ördek kimeralar kullanan deneyler, ev sahibi embriyolar morfolojik sınırları saptanmasıyla sinir ucu değiştirmeye etki göstermiştir. Bu kimerik quck embriyolarda, donör bıldırcın nöral krest hücrelerinin bir ördek gibi kalıp (Şekil 1D) olarak konak ördek çene kavisi içine göç vardır. Nöral krest nüfusun büyüklüğüne bu konak katkısına rağmen, donör nöral krest bıldırcın gibi boyut ve şekil (Şekil 1E) olan bir alt çene iskeleti üretmeye devam etmektedir. e 1 &quot;fo: İçerik-width =&quot; &quot;fo: src =&quot; 6in / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1. Bıldırcın-Duck Chimeric Sistemi. Oluşturmak için (A) ve Quail (B) ördek kafatası boyutu ve şekli önemli ölçüde farklılıklar gösterebilir ve bu şekilde, en iyisi (Tokia et al. 56 değiştirilerek) kraniofasiyal gelişimini incelemek için bir kimerik sistemi kullanmak için uygundur. (C) Deney tasarımı evre-uyumlu HH9.5 bıldırcın ve ördek embriyolar tek taraflı kimerik quck embriyolar. Nöral kat bıldırcın embriyo bir taraftan uzaklaştırılır ve ördek embriyolara nakledilen sinir kıvrımın eşdeğer bir parça sonra kaldırıldı. (D) Quail verici hücreler (yeşil), bir anti-bıldırcın antikoru (Q kimeralar ile takip edilebilir HH12 kimerik embriyo ventral görünümünde gösterildiği gibi) PN ¢. (F) HH38 de quck çeneleriyle olarak, bıldırcın Meckel verici türetilmiş7, s kıkırdak daha büyük ve eğri olan karşı taraftaki ördek ev sahibi türevli Meckel kıkırdak için gözlenenden daha kısa ve daha düz olduğunu. Yayımlanmaktadır Tokita et al., Dev. Bio. 306, 377 (2007) Elsevier izni ile.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras at JoVE.com

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Bu makalede, kraniofasiyal gelişimine nöral ve / veya diğer dokuların türe özgü katkılar test etmek için tasarlanmıştır kimerik embriyolar oluşturmak için bir yöntemi tarif etmektedir.

Bıldırcın-ördek Chimeras kullanma Kraniyofasiyal Kalkınma için Türlere özgü Katılımlar değerlendirilmesi

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Görüntüleme.  University of California at San Francisco.  Bu makalede, kraniofasiyal gelişimine nöral ve / veya diğer dokuların türe özgü katkılar test etmek için tasarlanmıştır kimerik embriyolar oluşturmak için bir yöntemi tarif etmektedir. 

Video: Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

Mikroakiskan kullanarak Yeni Tedavi Uygulamaları Geliştirme

Biyoloji

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Doku Hedeflenen Embriyonik Chimeras: Zebra balığı Gastrula Hücre Nakli

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Kraniofasial mezenşimin, Elektroporasyon

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

Buruşuk Koloni Gelişimi kullanarak Biyofilm Oluşumu değerlendirin Bir Yarı-kantitatif Yaklaşım

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Bir Multiplex Antikor Tarama Yöntemi kullanılarak bir Luminex xMAP Tahlil için bir Capture ELISA Dönüşüm

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak Murine Direnç Arter Fonksiyon değerlendirilmesi

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Sox10 içinde Kraniyofasiyal Kalkınma Görselleştirme: kaede Transgenik Zebra balığı Hattı Time-lapse konfokal mikroskopi kullanılarak

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...