Yazarlar finansman için (MCB-1.157.876) NSF teşekkür ederim. Biz de onların yorumlar için Alberto Civetta, John roote ve iki anonim hakem teşekkür ederim.

Küçük ölçekli deneyler tüm prosedürü aşina olmak için yapılmalıdır. 1. Virgin Kadın ve naif Erkekler Toplama B) Oregon-R bireyler naif referans erkek toplamak amacıyla, c a) w 1.118 kişi bakire kadın toplamak için: belirtilen deney en basit sürümü yetişkinlerin aşağıdaki kombinasyonu içeren ilk haç dört tip, oluşur ) P {sw} homozigot erkek ve bakire kadın naif deneysel erkek (Tip I) toplamak için Sdic en vahşi tip organizasyon taşıyan bir kontrol hattı ve d) P {sw} homozigot erkek ve Sdic-sw-silme -taşıyan Sdic-sw eksikliği (Tip II) taşıyan saf deneysel erkek toplamak için bakire kadın. <ol><li> 8-10 kadın, 5 erkek her içeren birden fazla şişe ayarlayın. Kadın yatıyordu izin veryumurta ve her 3-5 günde yeni şişelere yetişkin aktarın. Şişe yerine şişeleri gerekirse kullanın ve her zaman taze gıda kullanın. Gerekli şişeleri sayısı üzerinde çalışma yapılan deneysel erkek tiplerinin sayısı ve farklılıklar (Tablo 1) tespit etmek için gerekli olduğu tahmin edilen bireylerin sayısına bağlıdır. Flakon başına 10&#39;dan fazla kadın döl doğurganlık değişim neden olabilir larva büyüme sırasında aşırı kalabalık neden olabilir. 25 ° C&#39;de saklayın şişeleri sıcaklık kontrollü bir odaya C. </li><li> Ilk haçlar kurduktan sonra gün 11 inci ve 12 inci bakire kadın ve naif erkek toplamaya başlar. Bekleme süresi sıcaklığına bağlı olarak değişir; düşük sıcaklıklarda sonucu uzun gelişimsel zamanda bireylerin toplama geciktirmek. Eclosion üzere zaman etkileyen bir başka faktör orta türüdür. Bu mısır unu-maya orta 29 gibi besleyici gıda, yetişkin düzgün gelişimi sağlarçiftleşme kolaylaştırır üreme sistemi,. Unmated toplayın her 4-6 saat uçar. Toplarken, şişenin içine CO2 getirerek sinekler uyutmak, sinekler dokunun ve seks stereomikroskop altında (Şekil 2). Seks ve uygun fenotip ve etiket şişeleri tarafından farklı şişeleri içine istenen sinekler yerleştirin. </li></ol> Not 1. Koleksiyon rutin atarak önceki gece ortaya çıkan yetişkinler tarafından sabah başlar. Gün boyunca bir veya iki kez bakire kadın ve naif erkek toplayın. Tipik olarak, D. melanogaster erkek 25 ° C 30 eclosion sonra cinsel olgun 8 saat olmak. Sinekler 12:12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında kalırlarsa, eclosion iki tepe bekleniyor: ilk 1-2 saat boyunca ışık söner önce ışığı ve 2 saat boyunca açıldıktan sonra. Eclosion pupa kararır sonra 24 saat içinde ortaya çıkar. Not 2. En fazla 10 kadın should aşırı kalabalık önlemek için aynı şişenin içine koymak. Bunlardan en az biri bakire olmadığı için bu aynı zamanda atılır olması durumunda kadın kaybını sınırlar. Not 3. Kısa bir süre içinde bakire kadın ve naif erkek uygun sayıda toplamak için, aşağıdaki önlemleri kabul edilebilir. Deneysel erkeklerin iki tür (Tablo 1) ile ilgili deneyler 1118 w 15-20 şişeleri ayarlayın. Hafifçe medya yüzeyine serpin ve yumurtlama kolaylaştırmak için birkaç tane kuru aktif maya pelet ekleyin. Gün üst üste anne en az 4 kez aktarın. Anne başka bir flakon (Şekil 3) aktarılır sonra her şişe içinde pupa devresi için uygun olan yüzey artırmak için, 4. veya 5. gün boyunca çok katlanmış kağıt (7 x 5 cm) takın. Ilk haçlar ortaya yetişkin sayısına yeterli değilse, bir kaç gün daha bekleyin ve bireysel olmak toplamakflakonlarından als farklı tarihlerde kurdu. Iş yükünü dışarı bile birkaç gün üst üste üzerinde deneyler yürütmek planlıyoruz. 2. Çift çiftleşme Deneyler Şekil 4 14 yapılan çift çiftleşme deneylerinde yer alan ana adımları gösterir. <ol><li> 1. Gün sabahı, ilk çiftleşme kurmak. Oregon-R erkeklerin suç tayininde arkadaşı için ilk olarak. <ol><li> Aspiratör kullanarak, 10 4-5-günlük-eski beyaz gözlü w 1.118 bakire kadın ve 10 kırmızı gözlü Oregon-R naif erkek her içeren flakon kurmak. İki üç şişeleri 5 gün boyunca günlük olarak ayarlanır. Ayarlanması için flakon sayısı mevcut bireylerin sayısına bağlı olarak değişebilir. Sinekler 2 saat dostum izin verin. </li><li> Oregon-R erkek atın ve bir aspiratör (Şekil 5) kullanarak yeni bir şişenin içine her kadın yerleştirin. Seks kimlik birkaç görsel inceleme ile elde edilebilirmorfolojik farklılıklar (Şekil 2). Uygun her flakon Etiket ve 2 gün (bundan sonra &quot;v1&quot;) için flakon kadın bırakın. </li></ol></li><li> 3. Gün, ikinci çiftleşme kurmak. Kurmak erkek ve çapraz Seçim deneysel erkek türlerinin herhangi yönelik herhangi bir potansiyel sapma en aza indirmek amacıyla rastgele yapılmalıdır. <ol><li> Işığı söner iki saat önce, bir aspiratör ile yeni bir şişenin içine tekrar kadın aktarın. Uygun yeni şişe etiket (bundan sonra &quot;v2&quot;). </li><li> V2 içine aynı genotip üç 5-6-günlük eski deneysel erkek tanıtmak. </li><li> Her kadın için 2.2.1 ve 2.2.2 tekrarlayın. </li><li> 4. Gün, sağ ışık iki saat önce aspiratör kullanarak (yani 2.2.1 sonra en fazla 12 saat), atın erkek açıktır. </li></ol></li><li> Gün 6, yeni bir şişenin içine tekrar her kadın aktarın. Uygun (bundan sonra &quot;v3&quot;) yeni şişeleri etiketleyin. </li><li> Gün 10, w 1.118 atmak </&gt; kadın destek. </li><li> V2 ve v3 yavrularıyla inceleyin. Kadın v2 kadın ilk başlatan ovipositing sonra Günü 17 örneğin v2 (veya v3), içine sonra ilk inceleme 13-15 gün sonra yapılır. Ikinci muayene 17 gün sonra tam olarak gerçekleştirilir. Bu süre aynı flakon ikinci bir nesil garanti güvenli bir üst temporal sınır teşkil etmektedir. Döl sayma sağlaması ve iki denetimler aşırı kalabalık önlemek. <ol><li> Gün 17, v1 incelemek ve mevcut kırmızı gözlü döl olmadığından emin olmak, buna göre şişe işareti değilse. Hiçbir döl referans ya da deneysel erkek görülmedi ile bu çiftleşme gösterir iken beyaz gözlü döl varlığı kadın ilk çiftleşme sırasında bakire olmadığını gösterir. </li><li> Gün 17, v2 ilk muayene gerçekleştirin. Anestezisi CO 2 ile v2 döl ortaya çıkan ve göz rengi ve cinsiyete göre sıralayabilirsiniz. Ilk ve sn babası Kayıt döl numaralarıond erkek. Şekil 6, her bir birleşme düzeninin döl beklenen fenotipleri gösterir. Bu özel deneyde 14, sadece kadın döl açıkça referans ya da deneysel erkek tarafından çocuğu ve bu nedenle sadece kızları gelen bilgiler P 2 hesaplamak için kullanılabilir olarak atanabilir. Diğer işaretleri ile erkek yavru babalık açıkça atanabilir ise, her iki cinsten döl sayıları aşağı hesaplamalarda kullanılabilir. Döl atın ama ikinci muayene için v2 tutun. </li><li> Gün 20, v2 yeni ortaya çıkan döl ile 2.5.2 olarak devam ve sonra şişe atın. </li><li> Gün 20, ilk kez v3 ortaya döl kontrol ve adım 2.5.2 izleyin. </li><li> Gün 23, v3 yeni ortaya çıkan döl ile 2.5.3 olarak devam edin. </li></ol></li></ol> Not 1: Birden fazla çiftleşme olabileceğini P puanları üzerindeki potansiyel şişirme etkisi (2.2.2 ve 2.2.3) nedeniyle, çiftleşme, belirli bir zaman çerçevesi ile sınırlı olabilir. Zaman çerçevesi kadın kullanılan erkek genotipi ile ilişkili remating frekansına bağlıdır. Birden fazla çiftleşme olasılığı özel gece 11 sırasında azalır. Not 2: Bu ergin sinek sayısı düşüktür maya potansiyel büyümesi ile sorunlara neden olabilir, çünkü canlı maya pelet eklemeyin. 3. Veri Analizi <ol><li> Kaydedilen döl sayıları uygun bir istatistik paket (SAS Institute örneğin, JMP) veya ücretsiz web tabanlı araçlar (örneğin kolay görsel denetim ve verimli analizi için uygun düzenlenmelidir <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li> Sperm rekabet yeteneği. V2 ve v3 gelen sayıları ekleyin. Hiç ya da çok sınırlı döl (örneğin &lt;10) yol açmıştır erkek sineklerin, işlem sırasında ölen ya da sadece başarılı insemina vardıiki erkek biri tarafından ted olmayan bilgilendirici olarak kabul edilir ve herhangi bir alt istatistiksel analiz (2.5.1 ve Tablo 2) dışındadır. Her bilgilendirici kadın için P 2 puan hesaplayın. </li><li> Karşılaştırıldığında deneysel erkekler arasında P 2 değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı fark olup olmadığını test edin. Bu parametrik (örneğin Tukey HSD) veya P 2 değerleri dağılımının çarpıklık ve varyans ve ortalama arasındaki bağımlılık gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak non-parametrik (örneğin Çelik-Dwass) testleri kullanılarak yapılabilir. Açısal dönüşüm genellikle parametrik testi 31 kullanım öncesinde örneğin P 2 oranlarda uygulanır. </li><li> Çiftleşme kur farkları (isteğe bağlı). Her deneysel erkek tipi için, iki kat evlendirilen kadın ve sadece ilk erkek (suçun tayininde referans erkek ve d deneysel erkek ile evlendirilen olanların sayısını hesaplamakefense tahlili). Bir iki kuyruklu Fisher testi (mevcut kullanarak <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ), deneysel erkeklerin iki tür arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek. </li><li> Cinsiyet oranı (isteğe bağlı). Her deneysel erkek için, beklenen 1:1 oranında her kadın sapma gelen döl olsun cinsiyet oranı belirlemek için ki-kare testi kullanın. </li></ol>

<ol>
	<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The descent of man and selection in relation to sex. , (1871).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).</li><li>Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , (1998).</li><li>Jones, B., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+sperm+competition+estimates.">Bayesian sperm competition estimates.</a> Genetics. 163, 1193-1199 (2003).</li><li>Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+and+sperm+displacement+in+natural+populations+of+Drosophila+melanogaster.">Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster.</a> Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).</li><li>Jonsson, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transfer,+storage,+displacement,+and+utilization+in+Drosophila+melanogaster.">Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 47, 1719-1736 (1962).</li><li>Boorman, E., Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+(ejaculate)+competition+in+Drosophila+melanogaster,+and+the+reproductive+value+of+females+to+males+in+relation+to+female+age+and+mating+status.">Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status.</a> Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).</li><li>Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. , 372-427 (1984).</li><li>Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+sperm+displacement+and+its+association+with+accessory+gland+protein+loci+in+Drosophila+melanogaster.">Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 139, 189-201 (1995).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+x+male+interactions+in+Drosophila+sperm+competition.">Female x male interactions in Drosophila sperm competition.</a> Science. 283, 217-220 (1999).</li><li>Civetta, A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+effects+on+male+and+female+components+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila.</a> Genet. Res. 75, 143-151 (2000).</li><li>Greenspan, L., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+variation+in+X+chromosome+male+reproductive+genes+and+sperm+competitive+ability+in+Drosophila+melanogaster.">Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster.</a> Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).</li><li>Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+male+accessory+gland+protein+Acp36DE+in+sperm+competition+in+Drosophila+melanogaster.">The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).</li><li>Yeh, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evidence+that+a+recently+evolved+Drosophila+sperm-specific+gene+boosts+sperm+competition.">Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).</li><li>Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+multiple+kinds+of+female+sperm-storage+organs+in+Drosophila.">Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila.</a> Evolution. 53, 1804-1822 (1999).</li><li>Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ejaculate-female+coevolution+in+Drosophila+mojavensis.">Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis.</a> Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).</li><li>Nonidez, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+phenomenon+of+reproduction+in+Drosophila.">The internal phenomenon of reproduction in Drosophila.</a> Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).</li><li>Miller, G. T., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-female+coevolution+in+Drosophila.">Sperm-female coevolution in Drosophila.</a> Science. 298, 1230-1233 (2002).</li><li>Manier, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+mechanisms+of+competitive+fertilization+success+in+Drosophila+melanogaster.">Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster.</a> Science. 328, 354-357 (2010).</li><li>Simmons, L., Siva-Jothy, M., Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , 826 (1998).</li><li>Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+remating,+sperm+competition+and+sexual+selection+in+Drosophila.">Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila.</a> Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).</li><li>Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+investigation+of+the+mating+system+of+Drosophila+hydei.">A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei.</a> Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).</li><li>Barbadilla, A., Quezada-D&#237;az, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+history+of+Drosophila+buzzatii.+XVII.+Double+mating+and+sperm+predominance.">The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance.</a> Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).</li><li>Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+sperm+competition+and+sperm+storage+in+Drosophila.">Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila.</a> Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).</li><li>Turner, M. E., Anderson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+predominance+among+Drosophila+pseudoobscura+karyotypes.">Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes.</a> Evolution. 38, 983-995 (1984).</li><li>Harshman, L. G., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inference+of+sperm+competition+from+broods+of+field-caught+Drosophila.">Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila.</a> Evolution. , 1334-1341 (1998).</li><li>Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+in+wild+Drosophila+melanogaster+revisited+by+microsatellite+analysis.">Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis.</a> Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).</li><li>Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+between+Drosophila+males+involves+both+displacement+and+incapacitation.">Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation.</a> Nature. 400, 449-452 (1999).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly+Pushing:+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics.">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics.</a> , (1997).</li><li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , (1994).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+genotypes+affect+sperm+displacement+in+Drosophila.">Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila.</a> Genetics. 149, 1487-1493 (1998).</li><li>Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontransitivity+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila.</a> Evolution. 54, 1030-1035 (2000).</li><li>Wigby, S., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition.">Sperm competition.</a> Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).</li><li>Pizzari, T., Parker, G. A., Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm biology: an evolutionary perspective. , 674 (2008).</li><li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminar+influences:+Drosophila+Acps+and+the+molecular+interplay+between+males+and+females+during+reproduction.">Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction.</a> Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).</li><li>Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sperm+competition+and+sperm+competition+avoidance+in+Drosophila+melanogaster.">Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz genetik olarak farklı göreli katkısı farklılıkları değerlendirmek için deneysel tasarım nitelendirdiler D. kontrollü çift çiftleşme deneyler 7,8 olarak döl için melanogaster erkek. Bu sperm rekabet yeteneği etkilemek için ve benzer bir prosedür savunma testi (Şekil 1) için de geçerlidir rağmen suçun testi içinde gösterildiği olmuştur hipotezi bir genetik faktör bağlamında yapılmıştır. Bu deneysel tasarım gibi kadın genotip 32&#39...

Geoff Parker böcekler ve evrimsel etkileri 2 sperm rekabet yaygınlığı kaydetti yana, Drosophila ve diğer türlerde çalışmalar büyük bir artış çok farklı düzeylerde bu olay biraz ışık tutmak için çalıştık. Ilgi alanları bazı örnekler doğal nüfus 9,10, genetik mimarisi ve genetik faktörler 11-14 altta yatan önemi ve cinsiyetler 15,16 arasında birlikte evrim sürüş rolünü kendi varyasyon ve diğer detaylar olmuştur. D. melanogaster kadın, özel sperm depolama organların sınırlı kapasitesi, sperm kesesi ve seminal priz 6,17 bir çift, farklı erkeklerden sperm rekabete katkıda bulunmaktadır. Yaklaşık 1.500 sperm söz konusu organların 18,19 konaklayabilir kadın ama sadece ~ 500 için çiftleşme sırasında aktarılır. Laboratuar, kontrollü çift çiftleşme deneysel olarakBir referans erkek ve ilgilenilen bir veya daha fazla erkek içeren ments yaygın sperm rekabet yeteneği 7,8 değerlendirmek için kullanılmıştır. Sperm rekabet yeteneği toplam soyu üzerinde çift çiftleşme deneylerde deneysel erkek tarafından çocuğu döl oranı olarak tahmin, yani bu deneysel ve referans erkeklerde hem de. Edilir Sperm rekabet yeteneği, iki bileşen ayrı bir deneyde değerlendirilen her biri oluşur. Hücum deneyde, birinci erkek gelen sperm yerinden için deneysel erkek sperm yeteneği, referans erkek yani değerlendirilir. Tersine, savunma deneyde, Deney erkek sperm yeteneği yerinden karşı veya referans erkek sperm dölleme oranı azaltmak için değerlendirilir. Tahlil, savunma ya da suç türüne bağlı olarak, sperm rekabet yeteneği puanları P 1 ve P 2, sırasıyla ile tahmin edilmektedir. P1 ve P 2 0 ile 1 arasında değerler sadece alabilir. Ara değerler genellikle doğrudan sperm rekabet içeren fizyolojik bir senaryo göstermektedir sperm karıştırma, dolaylı kanıt olarak yorumlanır. Aynı mantığı ardından, uç değerler güçlü diferansiyel sperm rekabet yeteneği delil olarak yorumlanabilir. İlk çalışmalar göstermiştir ki D P 2 melanogaster 7 uzatır iki çiftleşme arasında geçen süre olarak artan 0.8 bitti. Bu aynı deney tasarımı diğer Drosophila türlerinde kullanılmıştır, P 2 sperm rekabet yeteneği 20 değerlendirmek için çalışmalarda yaygın olarak kullanılan istatistik olmaktan. Çoğu tür için, test edilen suşların p 2 değerleri 0.6 21 daha yüksektir. Bununla birlikte, farklı erkeklerin sperm arasındaki doğrudan rekabet ilgisiz birçok mekanizma aynı puanları (Tartışma) verebilir. Dbirinci ya da ikinci erkek tarafından çocuğu istinguishing soyu kolayca tanımlanabilir markerlerin kullanımı ile mümkündür. Erken çalışmalarda, erkeklerin birinin öldürücü dozlarda ışınlanmış edildi, örneğin, X-ışınları gibi ışınlanmış sperm tarafından döllenmiş hemen hemen tüm ova 7 yumurtadan için başarısız olduğunu. Daha sonra, göz pigmentasyon veya kanat şeklini değiştiren mutasyonlar en yaygın olarak kullanılan belirteçler olmuştur. Eski örnekleri mutasyonlar BW (kahverengi) 9, CN (zencefil) 22 ve W (beyaz) 23 fenotipleri ikinci tip mutasyon Cy (Kıvrımlı) 24 tekabül ederken, bu mutasyonların bazıları birleştirilmiştir Aynı kişi, örneğin cn bw. Daha az ölçüde, allozimler 25 ve bilinen kalıtım desenleri ile Mikrosatellitlerin 26,27 da kullanılmıştır. Farklılıkları test etmek için deney tasarımıSperm rekabet yeteneği, Clark ve ark, esasen burada aşağıda açıklandığı. 9. Bu deneylerden elde edilen sonuçlar sadece inceleme altında deneysel erkek tiplerinin ayırıcı babalık hakkında bilgi vermek. Ayrıca spor 14,28 ve sperm görselleştirme teknikleri 24 sonrası döllenme farklılıkları hesaba katmak Tahliller P 1 farklılıklar (veya P 2) puanları sperm yeterlilik farklılıklar olarak yorumlanabilir sağlar. Şekil 1 suç ve savunma deneyleri hem de mantığı özetliyor. Sürecin lojistik göstermek için, bir suç deney D. gerçekleştirilen melanogaster 14 ayrıntılı olarak açıklanacaktır. Bu özel suç test sperm rekabet yeteneği multigen aile Sperm özel dynein ara zinciri (Sdic) ölçülebilir bir etkisi test etmek için kullanılmıştır. Tüm üyeBu multigen ailenin s X kromozomu üzerinde tandem bulunur. Nakavt erkek Sdic küme silerek oluşturulmuştur. Silinen bölümü de temel gen kısa kanat (sw) dahil ve çalışmanın amacı Sdic bir alaka değerlendirmek olduğu için, Sdic-sw silme taşıyan erkek (P {sw} olarak sembolize sw bir transgenik kopyasını tarafından kurtarıldı , ayrıca kromozom 2 bir mini-beyaz muhabiri gen) yapılan hangi. Göz rengi babalık tanımlanması için görünür bir marker olarak kullanılmıştır. Tüm referans sinekler erkek olarak kullanılmıştır suşu Oregon-R, o dışında beyaz bir mutant arka edildi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

Ova Gübreleme conspecific erkekler arasında rekabet cinsel seleksiyon mekanizmalarıyla biri değil, en üst düzeye hayatta kalma ve canlılığı 1 daha başarılı çiftleşme olay sayısı maksimize çalışan yani seçimidir. Sperm rekabeti kendi sperm zaman ve mekan içinde tesadüfi olduğu aynı kadın 2, çiftleşme sonrası erkek arasındaki rekabet temsil eder. Bu olgu, bitki ve hayvan 3 birden fazla tür bildirilmiştir. Örneğin, vahşi yakalanmış D. melanogaster kadın genellikle 2-3 erkek 4 sperm içerir. Sperm farklı erkek 2,5 gelen sperm doğrudan rekabet unsuru doğurabilecek sınırlı depolama kapasitesi ile özel organlarda depolanır. Farklı ilgi erkek (deneysel erkek türleri) sperm rekabet yeteneği karşılaştıran kontrollü çift çiftleşme deneysel ile yapılmıştırlaboratuvar 6,7 olarak ts. Kısaca, tek bir kadın arka arkaya iki farklı erkek, bir deneysel erkek ve bir çapraz çiftleşme referans erkek maruz kalmaktadır. Aynı çiftleşme düzeni daha sonra bu nedenle ortak bir referans yoluyla sperm rekabet yeteneği dolaylı karşılaştırma kolaylaştıran diğer deneysel erkek türleri ile takip edilmektedir. Deney ve referans erkekler tarafından babası bireylerin kısmını basit bir matematiksel ifadeler 7,8 kullanarak sperm rekabet yeteneği tahmin sağlar işaretleri kullanılarak tanımlanır. Buna ek olarak, sperm rekabet yeteneği deneysel erkek farklı yeterlilik özelliklerini yansıtıcı olduğu varsayılır arkadaşı (sırasıyla suç ve savunma testi,) 9, ikinci ya da ilk olmasına bağlı olarak iki farklı senaryolarda tahmin edilebilir. Burada, kabul görmüş t altında yatan farklı genetik faktörlerin rolü sorgulamak için yardımcı olan bir yaklaşım tarifD. sperm rekabet yeteneği o fenomen melanogaster.

Tablo 2 iki suç deney bazı belirgin özellikleri (Tahliller 1 ve 2) özetlemektedir hangi D. ve (sırasıyla, Tip I ve II) bir fonksiyonel Sdic yığılım melanogaster deneysel erkeklerde 14 karşılaştırılmıştır. Dikkate bazı çoğaltır karşılaşılan farklı olaylar aldıktan sonra, kadınların 58-83% bilgilendirici ve bu nedenle döl babalık sayıları P 2 hesaplamak için kullanılabilir olduğu tespit edildi. Parametrik olmayan test so...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila at JoVE.com

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Arasında Diferansiyel sperm rekabet yeteneği<em&gt; Drosophila</emFarklı genotipleri ile&gt; erkek çift çiftleşme deneyler ile tespit edilebilir. Bu deneylerin her biri ilgi ve bir referans erkek erkek biri içerir. Döl içinde kolaylıkla tespit işaretleri her erkek tarafından babası bireylerin fraksiyonu çıkarım sağlar.

Sperm Rekabet Yeteneği in değerlendirilmesi farklılıklar<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.5K Görüntüleme.  University of California, Irvine. Arasında Diferansiyel sperm rekabet yeteneği Drosophila erkek çift çiftleşme deneyler ile tespit edilebilir. Bu deneylerin her biri ilgi ve bir referans erkek erkek biri içerir. Döl içinde kolaylıkla tespit işaretleri her erkek tarafından babası bireylerin fraksiyonu çıkarım sağlar.

Video: Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Biyoloji

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

İzolasyon ve In vitro Etkinleştirme Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Living Görüntüleme Hücre Şekli Değiştir Drosophila Embriyolar

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Drosophila Pupal Notum'un Diseksiyonu, Sabitlenmesi ve Görselleştirilmesi

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...