Bu protokol, fare hepatositlerinin 3Boyutlu kollajen sandviç ortamında izolasyonunu ve tekrarlanabilir uzun vadeli kültürünü kolaylaştırarak kanonik yapı oluşumunu ve tedaviye in vitro yanıtını inceler. Teknik ustalaştıktan sonra, in vitro çalışmalar için son derece uygun ve saf fare hepatosit popülasyonu büyük hacimlerde elde etmek için hızlı bir yöntemdir. Prosedürü gösteren Lenka Sarnova, laboratuvarımızdan bir teknisyen.
Birincil hepatosit izolasyonundan bir gün önce, 10X DMEM 100 mikrolitre, distile su 485 mikrolitre ve sıçan-kuyruk kollajen birine 500 mikrolitre de bir azılı sodyum hidroksit in 15 mikrolitre ekleyin. Nötralize kollajen pH kontrol edin. 7.5 gibi olmalı.
Önceden soğutulmuş 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak, nötralize kollajen çözeltisinin 100 mikrolitresini plastik 3,5 santimetre çapındaki kültür yemeklerinin her birine buzun üzerine yayın ve yemekleri bir gecede standart kültür koşullarına yerleştirin. Ertesi sabah, 37 santigrat derece en az üç saat boyunca çanak başına 37 derece Santigrat pBS bir mililitre ile kollajen katmanları rehydrate. Karaciğeri izole etmek için, parmak sıkışmasına yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, anestezili fareyi supine pozisyonunda bir diseksiyon minksiyonuna yerleştirin ve alt ve üst ekstremiteleri paspasa bantlayın.
% 70 etanol ile karın bezi ve her forelimb kasık bölgesinden V şeklinde bir kesi yapmak. Karın boşluğu ortaya çıkarmak ve bir diseksiyon mikroskop altında mat yerleştirmek için göğüs üzerinde cilt katlayın. IVC maruz kaudal yönde ince bağırsak ve kolon hareket ettirin ve 37 derece santigrat çözeltisi 2.5 mililitre ile iki mililitreşşöyör yük C.Cannula şırınga bağlayın ve diyafram kadar karaciğer basın pBS ıslatılmış pamuk lu bez kullanın.
IVC'nin etrafına karaciğerin hemen altına ıslatılmış bir dikiş yerleştirin. Daha sonra 45 derecelik bir açıya bükülmüş 30 gauge iğne ile donatılmış bir insülin şırınga kullanarak, portal ven içine heparin mililitre başına 5, 000 birim 10 mikrolitre enjekte. Karaciğer kanüle, doğrudan karaciğer yanında IVC küçük bir kesi yapmak ve kesi içine kanül eklemek için mikrocerrahi makas kullanın.
Dikişler ve iki cerrahi düğüm ile yerinde kanül güvenli ve perfüzyon tamponlar karaciğer dışına akmasına izin vermek için portal damar kesti. Sonra yavaş yavaş yaklaşık 15 saniyelik bir süre içinde çözeltinin iki mililitre ile karaciğer perfüzyon şırınga piston bastırmak. Tüm çözelti teslim edildiğinde, peristaltik bir pompayı taze 37 derece santigrat çözeltiSi C ile önceden doldurun ve sistemde hava kabarcığı olmadığından emin olmak için perfüzyon cihazını kontrol edin.
Kanülleri şırıngadan dikkatlice çıkarın ve hızlı bir şekilde ama çalışan peristaltik pompanın borularını kanüle dikkatlice bağlayın. Perfüzyonu dakikada 2,5 mililitre akış hızında hemen başlatın. İki dakika sonra D çözeltisine geçin ve perfüzyona 10 dakika daha devam edin.
Perfüzyon sonunda, dikkatle 37 derece santigrat çözeltisi 20 mililitre içeren 50 mililitre konik tüp içine karaciğer hasat E.To birincil hepatosit izole, kanül tarafından karaciğer tutarak, tampon içine hepatositvurmak için tüp duvar etrafında doku ovmak. Tüm doku püresi olduğunda, yeni bir 50 mililitrelik tüp içine izole hücreleri filtrelemek için 70 mikrometre gözenek naylon süzgeç içine doku bulamaç aktarın. DMEM'de %40 Percoll'un 20 mililitresinde karaciğer hücrelerini santrifüj le çökünve peleti yeniden askıya alın.
Canlı ve ölü hücreleri santrifüj le ayırın ve peleti 20 mililitre lik çözeltide yeniden askıya alın E.Hücreleri tekrar santrifüj ettikten sonra, 10 mililitre taze çözelti E'de peleti yeniden sayarak yeniden askıya alın. Sayma sonra, 3,75 kez 10 için hepatosit kültür ortamının mililitre başına beş canlı hücrelere birincil hepatosit sayısını ayarlayın. Kültür 3D kollajen sandviç izole birincil hepatositler için, eşit her kollajen kaplı 3,5 santimetre çapında çanak üzerine hücrelerin iki mililitre dağıtmak için bir mililitre pipet kullanın.
Hücreleri üç saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Kuluçka sırasında, gösterildiği gibi çanak başına nötralize sıçan-kuyruk kollajen bir çözelti 100 mikrolitre hazırlamak. Kuluçka sonunda, dikkatle çanak başına nötralize kollajen 100 mikrolitre ile orta ve bekar hücreleri değiştirin ve bir saat boyunca hücre kültürü kuluçka için plakaları iade.
Kollajen katılaşmış zaman, dikkatle her çanak taze hepatosit kültür orta iki mililitre ekleyin ve üç ila sekiz gün boyunca kuvöz kültürleri mikroskop altında günlük kontrol kültürleri dönmek. 3D kollajen sandviçler içinde birincil hepatosit immünetiketleme için, 37 derece Santigrat PBS ile dikkatle her sandviç yıkayın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çanak başına PBS% 4 paraformaldehit bir mililitre ile kültürleri düzeltmek. Fiksasyon sonunda, yıkama başına% 0.1 Tween 20 ile takviye PBS iki mililitre 10 dakika boyunca bulaşıkları üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS'de bir mililitre 0.1 molar glisin ve %0.2 Triton X-100 ile hücreleri permeabilize edin ve pbs artı Tween 20'de üç yıkama nın yanı sıra sadece gösterildiği gibi. Daha sonra, kollajenüst tabakasını hafifçe rahatsız etmek ve PBS Tween'de %5 büyükbaş serum albuminin bir mililitresi ile spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için bir vakuma bağlı 10 mikrolitrelik yük ucu kullanın. Kuluçka sonunda, her çanağa blokaj çözeltisi seyreltilmiş ilgi birincil antikorları ekleyin ve 37 santigrat derece gecede kuluçka.
Ertesi sabah, PBS Tween üç 15 dakikalık yıkar ile bulaşıkları yıkayın ve beş saat boyunca 37 santigrat derece uygun ikincil antikorlar ile etiketleme izledi. Kuluçka sonunda, kültürleri pbs tween ile iki kez ve bir kez demlenmiş su ile yıkayın. 3D kollajen sandviçtohumlama bir gün içinde, fare birincil hepatositkümeler oluşan ve safra canaliculi yaklaşık düzenli bir ağ da kendini organize.
Üç ila altı gün içinde, beş ila 10 hücrekümeleri genellikle bir kanaliküler ağ oluşturan tam polarize hepatositler ile gözlenir. Toksin veya sitoiskelet değiştiren ilaçlarla tedavi, hepatosit sitoiskeleti ve safra kanaliculi genişliği, şekli ve sayısında değişikliklere yol açabilmiştir. Etanol tedavisi keratin 8 organizasyonu üzerinde sadece hafif bir etki sergilemelerine rağmen, safra kanaliküler genişliklerinin tortuosity ve dağılımını artırır.
Etanol ile tedavi edilen safra kanaliculi'nde, etanol tedavisinden sonra tip kavşakların kaybedilmesine işaret eden tedavi edilmemiş kontrollere göre ZO-1 boyamanın sinyal yoğunluğu azalmıştır. Blebbistatin ile actomiyozin kontraktiliteinin inhibisyonu düzensiz şekilli, kalın, yuvarlak safra canaliculi oluşumunu neden olur. Ayrıca, okadaik asit ile tedavi güçlü keratinlerin fiziksel özelliklerini etkileyen ve önemli ölçüde tedavi edilmemiş kontrollere göre daraltılmış safra kanaliculi sonuçlanan fosfatazlar inhibe.
Ayrıca, etanol tedavisi önemli ölçüde blebbistatin tedavisi transaminaz düzeylerinde herhangi bir dikkate değişikliklere yol açmaz ve okadaic asit tedavisi alanin aminotransferaz hafif biyokimyasal değişiklikleri tetikler ama aspartat aminotransferaz ekspresyonunda hiçbir değişiklik şiddetli hepatosellüler yaralanma düşündüren hem alanin hem de aspartat amino transferaz düzeylerini yükseltir. Kanülasyon sırasında ve perfüzyonun başlangıcında nispeten hızlı bir şekilde çalışmaya devam etmek ve perfüzyon sistemine giren kabarcıkları önlemek önemlidir. Hücre lisatları, protein ekspresyonu ve/veya aktivasyon aşamalarında değişikliklerin tedavi sırasında meydana gelip gelmediğini belirlemek için ilgi çeken proteinler için yinelenen kuyularda toplanabilir.
