Yazarlar entelektüel desteği, maddi destek ve hisse senetleri için Akira Chiba kabul etmek istiyoruz. Yorumlar için Julia Dallman teşekkürler.

1.. Çalışma Fly <ol><li> Oda sıcaklığında 10 standart mısır unu-agar-pekmez-maya ortamda sinekler koruyun. </li><li> Haçlar için, eclosion 6 saat içinde bakireler izole. Istenen genotip erkeklere geçtikten sonra, değişim her 3-4 günde yeni şişelere uçar. </li></ol> Not: Bu deneyler için, Gal4 hat A9 kanat transgenlerin anlatımını sürmek için kullanılmıştır. Fly stokları Bloomington stok merkezinden elde edilebilir. Bu deneylerde kullanılan Hisse A9-Gal4 (Bl # 8761), His2Av-GFP (Bl # 5941), SCO / cyo HsCre (Bl # 1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl # 25773), 11, lollibow içerir. 2. Seçimi ve Pupa ve montajı <ol><li> Sahne pupa ya beyaz prepupa (RES) olarak toplanması ve bunların uygun yaşa gelinceye kadar 25 ° C&#39;de tutarak veya morfolojik kriterlere 12. kullanarak. </li><li> Hücre bölünmeleri, son zamanlarda baş tersine çevrilmesi uğramıştır seçeneğini pupa gözlemlemek için.Bu zaman kadar sadece eclosion (en&gt; 96 saat) önce, pupa hareketsiz uzun time-lapse gözlem izin vardır. </li><li> Önce su fırça üzerine onları dürterek yavaşça yapışkan gevşetmek ve izin için bir dakika bekleyen, su ile nemlendirilmiş bir fırça ile onlara dokunarak flakonlarından pupa çıkarın. </li><li> Yavaşça tükürük bezi yapıştırıcı ve gıda parçacıkları uzaklaştırmak için su içinde bir boya fırçası ile dürtüyordu seçilir pupa yıkayın. </li><li> Bir lamel altındaki (sayı 1 ½ lamelleri) ile bir 25 mm Petri kabı temiz pupa aktarın. </li><li> Ilgilenilen doku lamel en yakın olan, böylece bir destek olarak modelleme kil ya da diş balmumu ya da ince şeritler kullanılarak, pupa monte edin. Not: Burada anlatılan çalışmalarda, pupa kanatlar, bacaklar, karın histoblasts veya dorsal notum gözlenmiştir. Uygulamada, pupa durumda yüzeyinin 20 mikron olan bir doku gözlemlenebilir. </li><li> Orient pupa dikkatlice böylece tissuilgi e cam lamel yüzeyine paralel. </li><li> Pupa monte edildikten sonra, pupa ve lamel arasındaki boşluğa tiodietilen glikol (TDG) ince bir tabaka aktarmak için bir fırça kullanın. </li></ol> Not: TDG, yüzeye dağılımını azaltır yağın kırılma indeksi ile eşleşir ve oksijen doku 13 nüfuz sağlar. Bu hücre davranışlar hızlı durmasına neden olan, oksijenin dokulara mahrum eğilimi gibi yağlar kullanılması tavsiye edilmez. 3. Görüntüleme Not: görüntüleme için, konfokal mikroskop confocality pupa durumda yoğun aydınlatma neden obscuring arka çoğunu çıkarır gibi önemli olması muhtemeldir. <ol><li> Pupa gelişimi ve canlılığı üzerindeki aydınlatma etkisini en aza indirmek için konfokal ayarlarını. Bunu yapmak için, uyarma yoğunluğu ve toplama duyarlılığı arasında bir denge. Görüntüleme wi için tipik bir yapılandırmaLeica SP5 rezonans tarayıcı (8,000 Hz),% 2 olarak ayarlanmış lazer gücü (% 20 güç,% 10 geçirgenlik), 120 um iğne deliği grubu, ve hat 8 için kullanılan kurulu ortalama th. Ayarlar deney koşullarına bağlı olarak değişecektir. </li></ol> Not: ince ölçek onlar odak derinliğini sınırlamak olsa da başarılı, bu yöntem kullanılmıştır 40X ve 63X Petrol daldırma lens (0,1 mm çalışma mesafesi) bulunmaktadır gidermek için. 4. Analiz Çerçeveleri analiz etmek için, z-yığınları ya da film, izleme, ölçme ve sunum 14 için dosyaları değiştirmek için etkili araçlar vardır FIJI, veri dosyalarını içe. Örneğin mitoz tamamlamak için zamanı telofaz için profazın bir hücreyi izlerken kare ilerlemek için örnekleme aralığı ve çok boyutlu görüntü tarayıcı kullanılarak ölçüldü. x-, y-ve z-boyutları ölçme aracı kullanılarak ölçülebilir. Yazılım ve kullanımı hakkında ayrıntılı talimatlar içinbkz: http://fiji.sc/Fiji.

<ol>
	<li>Raff, J. W., Jeffers, K., Huang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+Fzy/Cdc20+and+Fzr/Cdh1+in+regulating+the+destruction+of+cyclin+B+in+space+and+time.">The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time.</a> J. Cell Biol. 157, 1139-1149 (2002).</li><li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J. Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Clark, I. B., Jarman, A. P., Finnegan, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+gonad+formation+reveals+roles+for+Six4+in+regulating+germline+and+somatic+cell+migration.">Live imaging of Drosophila gonad formation reveals roles for Six4 in regulating germline and somatic cell migration.</a> BMC Dev. Biol. 7, 52 (2007).</li><li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses.">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat. Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 5127-5140 (2005).</li><li>Roy, S., Hsiung, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+Drosophila+cytonemes+for+distinct+signaling+pathways.">Specificity of Drosophila cytonemes for distinct signaling pathways.</a> Science. 332, 354-358 (2011).</li><li>Gho, M., Bellaiche, Y., Schweisguth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+the+Drosophila+microchaete+lineage:+a+novel+intrinsically+asymmetric+cell+division+generates+a+glial+cell.">Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell.</a> Development. 126, 3573-3584 (1999).</li><li>Ninov, N., Martin-Blanco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+epidermal+morphogenesis+during+the+development+of+the+adult+abdominal+epidermis+of+Drosophila.">Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila.</a> Nat. Protoc. 2, 3074-3080 (2007).</li><li>Edgar, B. A., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+control+of+cell+cycle+regulators:+a+fly's+perspective.">Developmental control of cell cycle regulators: a fly's perspective.</a> Science. 274, 1646-1652 (1996).</li><li>Wirtz, R. A., Semey, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+kitchen:+equipment,+media+preparation,+and+supplies.">The Drosophila kitchen: equipment, media preparation, and supplies.</a> Drosophila Information Service. 58, 176-180 (1982).</li><li>Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+multicolor-labeled+cells+in+Drosophila.">Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila.</a> Development. 140, 1605-1613 (2013).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li><li>Staudt, T., Lang, M. C., Medda, R., Engelhardt, J., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,2'-thiodiethanol:+a+new+water+soluble+mounting+medium+for+high+resolution+optical+microscopy.">2,2'-thiodiethanol: a new water soluble mounting medium for high resolution optical microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 70, 1-9 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).</li><li>Meyer, E. J., Ikmi, A., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+is+a+broadly+conserved+feature+of+cell+division+in+pseudostratified+epithelia.">Interkinetic nuclear migration is a broadly conserved feature of cell division in pseudostratified epithelia.</a> Curr. Biol. 21, 485-491 (2011).</li><li>Sauer, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J. Comp. Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bölünen hücrelerin özellikleri, His2AvGFP ifade eden hücrelerin konfokal analizi ile Drosophila canlı pupa kanadında mitoz gözlemlemek için basit bir hazırlama gerekli geliştirme, görselleştirmek ölçmek ve ölçmek için. Bu yöntem, pupa kanadında hücre döngüsü onlar mitoz girmek epitelin apikal yüzeyine o çekirdekler hareket yalancı epiteliada döngüleri hücre güçlü benzerlikler taşıdığını belgelemek için kullanılmıştır. Telofaz ardından, çekirdekler geri epitel tabaka...

<html> Sirke sineği, Drosophila melanogaster. Drosophila araştırma anlatım, demonte ve mutasyonunu içeren gen manipülasyonu sofistike formları sağlar genetik deney zengin bir geçmişe sahiptir biyoloji birçok yönleriyle inceleyerek için iyi kurulmuş bir modeldir. Floresan proteini etiket gelişiyle, bu repertuar yaşayan hayvanlar hücre ve proteinlerin çalışmaları kapsayacak şekilde genişletti. Sinek embriyo in vivo 1-3 derin, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan küçük ve optik net gibi çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Sinek gelişme diğer aşamaları anestezi 4, diseksiyon ve kısa vadeli kültürünü 5,6 veya 7,8 görüntüleme için manikür pencerelerin oluşturulmasına gerektiren, daha az uysal olduğu kanıtlanmıştır. Bu manipülasyonlar, genellikle uzun vadede hayvan gelişimi uzlaşma ya da kısa süreler için görüntüleme sınırı şekillerde hayvan etkiler. En embriyonik hücre siklusu kesiliyor yana hücre siklus düzenleyicileri benzer genlerinde mutasyon roman incelemek için ent &quot;&gt; bu. hücre döngüsünün zamanlaması ve sadakat incelemek için uygun bir hazırlık bulmak için gerekli olan (SM veya S-G2-M) ve çalışma kapsamında mutantlar ileriki evrelere kadar, bu pupa aşaması dokularda hücre döngüsünü gözlemlemek için önemli kusurları görünmüyor. pupa epitel hücreleri daha tipik bir G1-S-G2-M hücre döngüsü ve bu aşamada pupa olan var kas hareketleri 9 yeteneğine sahip değildir. manipülasyonlar için başlangıç ​​noktası pupa davanın belirgin donukluk rağmen Histone2AV-GFP ifade bozulmamış bütün pupa. dahil, bu bozulmamış hazırlık vivo görüntüleme uzun vadede mükemmel olduğunu kanıtladı. Bu teknik basittir lisans araştırmacılar rutin Drosophila hücre ve gelişim biyolojisi yönlerini incelemek için kullanabilirsiniz ve henüz çözünürlük mikrometre ölçekli özellikleri ayrımcılığı sağlayacak kadar gayet yeterli. Bu yöntemle, saat, dakika veya saniye içinde olayların gözlemleri sadece zaman serisi parametrelerini ayarlayarak mümkündür. Mavi, yeşil, sarı, turuncu ve kırmızı floresan proteinleri, veya bunların kombinasyonları kullanılarak Videolar yapılmıştır. Önemli olarak, eğer bakım hatta uzun süreli görüntüleme hayvanların geliştirme veya canlılığı üzerinde bir etkisi yoktur, lazer yoğunluğu en aza indirmek için alınır.

<table><tbody><tr><td>Fly stuff fly pad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td>for fly anesthetization</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas</td><td>Airgas South</td><td>CD50</td><td>For fly anesthetization</td></tr><tr><td>Regulator</td><td>Airgas South</td><td></td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; regulator</td></tr><tr><td>Fly vials</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-113RLBF</td><td>Fly culture</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; lines:A9-Gal4 (Bl#8761), His2Av-GFP (Bl#5941), Sco/CyO HsCre (Bl#1092), UAS-ChRFP-Tub (Bl#25773)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes #1 1/2</td><td>WillCo Wells BV</td><td></td><td>For microscopy</td></tr><tr><td>Thiodiethylene Glycol</td><td>Fluka</td><td>88559</td><td>mountant</td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>art supply store</td><td></td><td>Support to position pupae against</td></tr><tr><td>Paintbrushes</td><td>art supply store</td><td></td><td>To manipulate flies</td></tr><tr><td>Fine Forceps, Inox #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>computer</td><td>any</td><td></td><td>8 Gb RAM for image/movie analysis</td></tr><tr><td>Fiji software</td><td></td><td>Free ware http://fiji.sc/Fiji</td><td>Image analysis software</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td></td><td></td><td>Any fast scanning confocal should be sufficient</td></tr><tr><td>20X dry, and 40X or 63X oil immersion lenses</td><td>any</td><td></td><td>For imaging tissue, cellular, and subcellular features</td></tr><tr><td>Immersion oil (nonfluorescent)</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>any</td><td></td><td>For fly manipulation</td></tr></tbody></table>

imaging through the pupal case of drosophila melanogaster

Hücre ve gelişim biyolojisi için bir model olarak Drosophila uzun süredir devam eden kullanım araçları bir dizi vermiştir. Birlikte, bu teknikler metodolojik açılardan çeşitli hücre ve gelişim biyolojisi analizini sağlamıştır. Canlı görüntüleme, hücre bölünmesi ya da hücre hareketi gibi dinamik hücre süreçlerini, gözlem için gelişmekte olan bir yöntemdir. Canlı görüntüleme kullanarak yerinde mitoz gözlemlemek için gerekli oldu uncharacterized farazi hücre döngüsü proteinleri mutasyonlar izole olması. Drosophila en canlı görüntüleme çalışmaları nedeniyle küçük boyutu ve optik netlik manipülasyon ve gözlem için erişilebilir embriyonik aşamalarında odaklanmıştır. Bu boşluk fazlarının biri ya da her ikisi yoksun olmasıyla Ancak, bu aşamada, hücre döngüsü sıra dışıdır. Buna karşılık, Drosophila pupa kanadının hücreleri, tipik bir hücre döngüsü ve pupa gelişme, yaklaşık 20 saat süren hızlı bir mitoz bir süre geçer. Bu i kolaydentify ve yerinde mitoz yakalamak için uygun sahnenin pupa izole. Montaj sağlam pupa deneyleri, hücre ve hayvan canlılığı üzerinde minimum etki ile birkaç saat çalışmasına izin veren, görüntüleme sırasında tractability ve dayanıklılık en iyi kombinasyonu sağladı. Yöntem olarak küçük, ya da daha küçük, kromozom sinek gibi özellikleri gözlem sağlar. Mikroskop ayarları ve montaj detayları ayarlanması, preparasyonun dahili zar komşu hücrelerin dinamiklerini ve bu tübülin gibi flüoresan etiketli proteinlerin görselleştirmek bırakıldı. Bu yöntem test edilen tüm floresan proteinleri için çalışıyor ve zaman ölçekleri çeşitli üzerinden Mikronaltı ölçek özelliklerini yakalayabilir. Geleneksel bir konfokal mikroskop ile pupa dış 20 um ile sınırlı olsa da, in vivo pupa dokularda protein ve dinamikleri hücresel gözlem için bu yaklaşım, bu hücre ve dokularda gelişimsel biyoloji çalışmaya genel olarak yararlı olabilir.

Gibi gelişmekte olan Drosophila göz, omurgalı ya da gelişmekte olan merkezi sinir sistemi içinde, ventriküler tabaka olarak yalancı epitel hücreler, nükleer hareketleri geçmesi, hücre döngüsü ile zaman içinde, interkinetic nükleer göç adlandırılır. Çekirdekler bazal yüzeyinde veya yakınında ve çekirdekler apikal yüzeye 15,16 ulaştığınızda hücrelerin mitoz girdiğinde DNA replikasyonu oluşur. Pupa kanat hücreler kafa eversiyonu sonra ilk birkaç saat boyunca bir hız...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster at JoVE.com

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The longstanding use of Drosophila as a model for cell and developmental biology has yielded an array of tools. Together, these techniques have enabled ...

imaging-through-the-pupal-case-of-drosophila-melanogaster

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

13.3K Görüntüleme.  University of Miami.  Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar. 

Video: Imaging Through the Pupal Case of Drosophila melanogaster

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Canlı-görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Gelişim Biyolojisi

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Nörobilim

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Biyoloji

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Canlı Beyin Eksplantlarının Görüntülenmesi

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Canlı-görüntüleme

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila

Pupal Evrelerinde Gelişen Drosophila Epitelinde Doku Oryantasyonu ve Büyüme Dinamiğinin Görüntülenmesi ve Analizi

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi