Name: isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue
Uploaded: 2018-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Biz teşekkür ederiz ve Dr Peter Nelson ve Sonya Anderson tüm insan beyin doku örnekleri sağlamak için UK-ADC beyin doku Bankası kabul (NIH izni numarası: P30 AG028383 yaşlanma Ulusal Enstitüsü). Matt Hazzard ve Tom Dolan, bilgi teknoloji hizmetleri, akademik teknoloji ve fakülte nişan, Kentucky Üniversitesi grafik yardım için teşekkür ederiz. Bu proje (BB için) hibe numara 1R01NS079507 sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur ve grant numara 1R01AG039621 yaşlanma Ulusal Enstitüsünden (için A.M.S.H.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur veya Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini yaşlanma temsil etmiyor. Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Aşağıdaki bilgileri geçerli güvenlik ve Kentucky Üniversitesi, Lexington, KY, ABD düzenleyici standartlara dayanmaktadır. Bir güvenlik önlemi olarak, kurumun biyolojik güvenliği programı ve en güncel yönetmelik ve öneriler için insan dokusu ile çalışmaya başlamadan önce bakın.
Dikkat: İnsan dokusu insan immün yetmezlik virüsü (HIV), Hepatit B virüsü (HBV), Hepatit C virüsü (HCV) ve diğerleri de dahil olmak üzere, kan yoluyla bulaşan patojenler bir kaynağı olabilir. İnsan dokusu ile çalışma patojenler kan yoluyla enfeksiyon riski. Bu nedenle, belirli bir düzenleyici ve güvenlik uygulaması insan dokusu ile laboratuar personeli korumaya çalışırken zorunludur. ABD insan dokusu ile çalışma bir Biyogüvenlik seviye 2 Laboratuvar yanı sıra güvenlik önlemleri ve NIH Bölüm IV-B-7, OSHA 1970 yan tümce 5(a)(1) ve kullanıcının kurumsal biyolojik güvenliği programı yasası uyarınca eğitim gerektirir. Genel olarak, kurumsal Biyogüvenlik kurulu ve/veya kurumsal İnceleme Kurulu onayı insan malzemeleri (doku, vücut sıvıları) içeren herhangi bir araştırma önce alınmalıdır. Eğitim insan malzeme ile çalışan tüm personel için gereklidir ve temel laboratuvar güvenlik eğitimi, Örneğin, kimyasal hijyen ve laboratuvar güvenliği, hem de biyolojik güvenlik, tehlikeli atık ve insan üzerinde özel eğitim içerir kan kaynaklı patojenler. İnsan malzeme ile çalışan tüm personelin hepatit B aşıları, önce insan malzeme ile çalışan almak için kesinlikle önerilir. Personel insan malzemelerle, e.gçalışırken belirli kişisel koruyucu donanımları gereklidir., kelepçeli bir önlük ve kalkan ve her zaman eldiven giymek bir yüz. İçinde bir Biyogüvenlik kabini (sınıf 2) gerçekleştirilmiş tüm işleri. İnsan malzemeler ile temas ve herhangi bir atık insan malzemelerden gelir tüm ekipman kirlenme ve/veya personel enfeksiyonu önlemek için uygun şekilde ele alınır. Tüm ekipman ve yüzeyler ile % 10 çamaşır suyu ve % 75 etanol insan malzemeler içeren her yordam aşağıdaki temizlenir. Bir sızıntı insan malzeme ile hemen temizlenmesi gerekir. Züccaciye Mağazaları her kullanımdan sonra autoclaved. Sabitlenmemiş insan dokusu, dahil olmak üzere atık, etiketli biohazard atık çantaya toplanan ve autoclaved. "Sharps" olarak biyolojik etiketli bir delik ve sızıntı geçirmez kap içinde toplanır. İnsan malzemelerden tüm atık kurumun biyolojik güvenlik yönetmeliklerine göre atıldı.
Not: Bizim laboratuvar taze frontal korteks örnekleri yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla vefat eden bireyler elde eder (IRB #B15-2602-M). Dahil ölçütlerdir: kayıt UK-ADC boyuna otopsi kohort çalışma ve bir Post-Mortem aralığı (PMI) ≤4 s64. Otopsi standart bir protokol izleyin ve tüm yordamları NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar65için uygun. Az 4 h kısa bir PMI yalıtım sonra kapiller canlılığı sağlamak için yüksek önem taşımaktadır. Dondurulmuş ve taze doku kullanılabilir. Donma gerekli ise, taze elde edilen insan beyin dokusu şok sıvı azot içinde donmuş olmalı ve-80 ° C'de depolanan Taze veya çözdürülen doku içinde yalıtım tampon (aşağıya bakınız) depolanabilir ve hızlı bir şekilde işlenebilir. Biz o 10 g taze insan dokusu verimleri yaklaşık 100 mg beyin kapiller (ıslak ağırlık) bulabilirsiniz.
1. Kurulum
<ol><li>
Arabellek hazırlık Not: Gerekli arabellek hacmi doku miktarına bağlıdır. Tüm arabellek güç aşağıdaki protokol içinde insan beyin korteksi doku 10 g üzerinde temel alır.<ol>
<li>L izolasyon arabellek: 1, 5 L Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS; 2.7 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136.9 mM NaCl, 8.1 mM Na2HPO4, 0.9 mM CaCl2, 0,49 mM MgCl2) kullanın ve ek 5 mM D-glikoz (1.35 g ) ve 1 mM sodyum pyruvate (0,165 g). Glikoz ve pyruvate ekledikten sonra sodyum hidroksit ile pH 7.4 için ayarlayın. Serin ve 4 ° C kullanmadan önce arabelleğe saklayın.</li>
		<li>Sığır Serum Albumin (BSA): yalıtım arabelleği bir son BSA konsantrasyonu % 1 1 L 10 g BSA tozu ekleyin. Bubbles kaçınmak, pH 7.4 ayarlamak ve gecede 4 ° C'de depolamak için yavaş yavaş ilave edin. Hemen kullanmadan önce hafifçe karıştırın; albümin denatürasyon önlemek için kabarcıklar oluşturan kaçının.</li>
		<li>Yoğunluk gradient Orta: bir cam şişe içine yoğunluk gradient orta 18 g tartmak ve manyetik heyecan çubuğu ekleme. Yalıtım arabellek 60 mL ekleyin ve tüm toz askıya kadar 5 dk şiddetle çalkalanır. Mağaza gecede 4 ° C'de geçiyoruz yoğunluk degrade orta izin vermek için. Kullanmadan önce 10 dakika karıştırın.</li>
		<li>4 ° C'de tüm arabellekleri depolar; Tüm araçlar ve buz arabellekleri tüm yalıtım işlem sırasında tutmak. Kullanmadan önce tüm arabellekleri karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Deneysel Kur
	<ol>
<li>Potter-Elvehjem doku değirmeni elektronik havai karıştırıcı üzerine havaneli bağlayın. Potter-Elvehjem doku değirmeni ve Dounce homogenizer başlık altında buzda havaneli ile yerleştirin. 300 µm filtre mesh (5 x 5 cm2) hazırlamak, bir koni katlayın ve eklemek ve 50 mL Falcon tüp bandı (Şekil 1A) ile ekleyin.</li>
		<li>Bağlantı halkaları yerleştirin ve zorlanma filtreleri hücre (gözenek boyutu: 30 µm) 50 mL Falcon tüpler üzerinde. Biyolojik atık torbaları hazırlayın. Gerekli tüm ekipman Biyogüvenlik kabini yerleştirin (bkz. Tablo malzeme).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. beyin numune hazırlama
Not: Şekil 1A aşağıda açıklanan tüm yalıtım yordamı iş akışı grafiğini gösterir. İnsan beyin dokusu korteks herhangi bir yerinden kök olabilir ve taze veya dondurulmuş kullanılabilir. Donmuş beyin dokusu oda sıcaklığında (arabellek yok; ~ 30 dk 10 g için) çözülmüş. Benzer sonuçlar elde etmek için beyin dokusu her deneme için aynı beyin bölgesinden alınmalıdır. Bu iletişim kuralı için taze optimize edilmiştir (PMI < 4 h) değil donmuş halde insan beyin korteksi.
<ol><li>İnsan beyin dokusunun hazırlanması: beyin dokusunun ağırlık belge. Aşağıdaki iletişim kuralı tüm numaraları 10 g taze insan beyin doku için uygundur. Beyin dokusu bir 100 mm Petri kabına yerleştirin. Dikkatli bir şekilde tüm meninkslerde forseps ile çıkarın. Bir neşter beyaz madde kesmek için kullanın.</li>
	<li>İnsan beyin dokusunun kıyma: dikkatle beyin dokusu kadar kesin ve neşterle kıyma. Yaklaşık 5 dk (2-3 mm adet) kıyma. Beyin dokusu Potter-Elvehjem doku değirmeni aktarın. Yalıtım arabellek 30 mL ekleyin. Not: Kıyılmış doku parçaları lapa kıyma sürecinde beyin dokusu dönüşüyor beri görmek zordur.</li>
</ol>3. homojenizasyon
<ol><li>Potter-Elvehjem doku değirmeni (izni: 150-230 µm): her örnek, 50 rpm homogenizer hızında 100 darbeleri ile homojenize. Zaman her 25 konturlar ve 100 vuruş için gereken toplam süreyi belge. Tablo 1 için önerilen homojenizasyon Protokolü Bkz:; insan frontal korteks 10 g homojenizasyon için toplam 22 dk zamanı. Hava kabarcıkları önlemek için heyecan değil.</li>
	<li>Dounce homogenizer (izni: 80-130 µm): homogenate Dounce homogenizer buzda Transfer. 20 vuruş (~ 6 s/kontur, ~ 2 dk toplam) ile süspansiyon lunaparkçı. Bubbles kaçınmak.</li>
</ol>4. Santrifüjü
<ol><li>Beyin homogenate dört 50 mL aralıklarla tüpler ve belge homogenate hacmi eşit olarak dağıtın. Yoğunluk gradient arabelleği 50 mL aralıklarla tüpler (12,5 mL tüp başına) içine dağıtmak. Yalıtım arabellek 10 mL Havan tokmağı ve homogenizer durulama ve dört Santrifüjü tüpler (~2.5 mL tüp başına) içine dağıtmak için kullanın.</li>
	<li>Santrifüj tüpleri kapakları sıkıca kapatın. Homogenate, yoğunluk gradient orta ve arabellek şiddetle tüpler sallayarak karıştırın. Vasıl 5,800 x g 4 ° c (sabit açılı rotor); 15 dakika santrifüj kapasitesi Tüp bağlı Pelet tutmak için bir orta yavaşlama hızı seçin. Süpernatant atın ve her Pelet 2 mL % 1 BSA resuspend.</li>
</ol>5. filtrasyon
Not: kırmızı kan hücreleri ve diğer hücre artıkları kılcal ayırt etmek birkaç filtrasyon adımlar gereklidir.
<ol><li>300 µm kafes: Pelet yeniden askıya sonra süspansiyon 300 µm kafes aracılığıyla filtre. Daha büyük gemiler ve daha büyük beyin enkaz mesh kalır, ancak kılcal ağ, filtre uygulanır. Dikkatle mesh ilâ 50 mL % 1 BSA ile yıkayın. Mesh atmak. Not: Bu filtrasyon adım kapiller süspansiyon herhangi bir büyük damarları ya da beyin enkaz parçalarını temizler.</li>
	<li>
30 µM hücre zorlanma filtre Not: Bu filtrasyon adım kılcal kırmızı kan hücreleri ve diğer beyin enkaz ayırır.<ol>
<li>Adım 6.1 beş 30 µm hücre zorlanma süzgeçleri (kapiller filtrate hücre zorlanma filtre başına yaklaşık 10 mL) üzerindeki kapiller filtrate dağıtın. Oysa kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreleri ve küçük beyin enkaz filtreden geçmek ve filtrate içinde toplanan kılcal geri Bu filtre tarafından tutulur.</li>
		<li>Her filtre 25 mL % 1 BSA ile yıkayın. Daha sonra tüm filtrates verimi artırmak için altıncı filtre dökün. Her filtre 50 mL % 1 BSA ile yıkayın; zorlanma filtreleri ile kılcal içeren hücreyi tutmak ve filtrate atın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. kılcal koleksiyonu
<ol><li>Filtreler ters çevirin ve 50 mL tüpler içine kılcal 50 mL her filtre için % 1 BSA ile yıkayın. Yavaşça pipettor 5 mL damlalıklı ucu ile basınç uygulayın ve beyin kılcal yıkamak için filtre arasında taşıyın.</li>
	<li>Özellikle filtre RIM tüm beyin kılcal kapalı yıkayın emin olun. Kabarcıklar kaçının beri bu filtrasyon işlemi daha zor hale getirir ve kapiller kaybı olasılığı artar.</li>
</ol>7. çamaşır
<ol><li>Kılcal topladıktan sonra 1.500 x g (kova rotor sallanan) 4 ° C'de 3 min için tüm örnekler santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak ve Pelet yalıtım arabellek yaklaşık 3 mL yeniden askıya alma. 15 mL konik tüp içinde bir örnek tüm resuspended çökeltilerini birleştirmek ve yalıtım arabellek ile doldurun. Yine 1500 x g 4 ° C'de 3 dk de santrifüj kapasitesi ve iki kez daha yıkayın.</li>
	<li>Kapiller saflık ile mikroskop (100 X büyütme) ve fotoğraf makinesi (Şekil 1B) belge. Not: Beyin kapiller insan beyin dokusunun 10 g den genellikle yaklaşık 100 mg verimidir. İzole beyin kılcal şimdi işlenen deneyler için kullanılabilir (Örn., lysate, membran izolasyon), veya flash donmuş ve-80 ° c en az 6-12 ay (birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek) için cryotubes içinde saklı.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mevcut protokolünü sağlam ve kalıcı insan beyin kapiller taze dokusundan yalıtım açıklar. Bu bölümde, biz aşağıda ayrıntılı olarak ele: 1) değişiklikleri protokolü, 2) yaygın hataları giderme, 3) Teknik sınırlamaları, 4) modeli ile ilgili mevcut ve alternatif kan - beyin bariyerini modelleri, önemi ve 5). izole insan beyin kılcal damarlar için potansiyel uygulamalar.
Burada açıklanan protokol 10 g taze insan frontal korteks doku için optimize edilmiştir. Ancak, ...

Kan - beyin bariyerini kan ve ne gider ve beyin dışarı geliyor belirler beyin arasındaki sıkı şekilde denetlenen bir arabirimdir. Anatomik olarak, endotel hücreleri kan - beyin bariyerini oluşturmak ve karmaşık, sürekli kılcal ağ oluşturur. Fizyolojik açıdan, bu kılcal ağ aynı anda karbon dioksit ve metabolik atık ürünlerin atılması sırasında beyin oksijen ve besin sağlar. Önemlisi, kanıt bariyer değişikliklere Alzheimer hastalığı, epilepsi ve kontur1,2,3,4,5 de dahil olmak üzere çok sayıda patolojiler için katkıda destekler , 6 , 7. endotel hücreleri de hizmet tedavi için bir engel olarak beyne, Örneğinilaç alımı bloke ederek beyin., kemoterapi glioblastoma multiforme Tümör rezeksiyonu8,9, takip 10. Bu bağlamda, izole insan beyin kılcal damarlar çok bariyer fonksiyonu ve sağlıkta disfonksiyon eğitim veren bariyer özellikleri içinde vivo benzeyen bir benzersiz ex vivo kan - beyin bariyerini modeli temsil ve hastalık. Bu makalede, biz--dan sürekli yüksek kapiller kalitede insan beyin beyin kılcal yalıtmak ve kan - beyin bariyerini çalışmaya verim için bir protokol sağlar.
1969 yılında, Siakotos ve ark. 11 ilk beyin kapiller yoğunluk gradient Santrifüjü ve cam boncuk sütun ayrımı yöntemi kullanılarak sığır ve insan beyin dokusundan yalıtım rapor edildi. Daha sonra Goldstein vd. 12 bu yöntem doku sıçanlarından emir, glikoz taşıma metabolik aktivite koruyarak izole beyin kılcal çalışma için gerekli azaltmak için birden fazla filtrasyon adımları ekleyerek geliştirilmiş. O zamandan beri araştırmacılar çok kez, yöntemi ve beyin kapiller modeli her yineleme13,14,15ile iyileştirilmesi kapiller yalıtım yordamı optimize edilmiştir. Örneğin, Pardridge ve ark. 16 sığır kılcal mekanik homojenizasyon yerine enzimatik sindirim kullanarak izole ve sonra daha sonra 210 µm gözenekli filtre ve cam boncuk sütun kılcal bir süspansiyon geçti. Bu değişiklikler trypan mavi dışlama leke izole beyin kapiller geliştirilmiş ve böylece, endotel hücre canlılığı arttı. 1990'ların başında Dallaire ve ark. 17 nöronal kirlenme açıktı ve γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) ve alkalen fosfataz metabolik aktivite yapılmaktadır sığır ve sıçan kılcal izole. 2000'de, Miller ve ark. 18, izole sıçan ve domuz beyin kılcal confocal mikroskobu ile birlikte taşıma yüzeylerde birikimi kılcal lümen içine göstermek için kullanılır. Daha sonra bizim laboratuvar beyin kapiller yalıtım yordamı optimize etmek devam etmiştir ve P-glikoprotein (P-gp)19,20,21, meme kanseri belirlemek için taşıma deneyleri kurduk direnç protein (BCRP)22,23ve çoklu ilaç direnci protein 2 (Mrp2)24 taşıma etkinlik. 2004 yılında, biz nereye biz izole sıçan beyin kılcal çeşitli sinyal yolları araştırmak için kullanılan iki raporlar yayınlandı. Hartz ve ark. 21, peptid endotelin-1 P-gp taşıma işlevinde beyin kılcal (PKC) endotelin reseptör B (ETB) reseptör, nitrik oksit sentaz (NOS) ve protein kinaz C üzerinden hareket ederek hızla ve geri dönülebilir olarak azaltılmış bulduk. Bauer vd. 19, nükleer reseptör pregnane X reseptör (PXR) ifade ve P-gp ifade ve taşıma fonksiyonunu kullanabilirsiniz beyin kılcal gösterdi PXR modülasyon gösterdi. Deneylerde transgenik insanlaşmış PXR fareler ile bu satırı araştırma, genişletilmiş ve in vivo etkinleşmiş P-gp ile hPXR harekete geçirmek25tarafından bariyer sıkma gösterdi. 2010 yılında, Hartz ve ark. P-gp protein ifade geri yüklemek ve etkinlik mutlu overexpress transgenik insan amiloid precursor protein (mutlu) farelerde taşımak için bu yaklaşım 26 ' yı kullandık. Ayrıca, P-gp mutlu içinde geri fareler amiloid beta (Aβ)40ve Aβ42beyin düzeyleri azaltılacağını.
Sinyal yolları eğitim ek olarak, izole beyin kılcal biz kapiler kaçak başvuran kapiller permeabilite değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir. Özellikle, Texas kırmızı sızıntı tahlil zaman ve bu veriler üzerinde kılcal lümen Texas kırmızıdan sonra kaçak oranları analiz etmek için kullanılan floresan boya kaçağı değerlendirmek için kullanılır. Bu denetim kılcal kıyasla artmış kapiller sızıntı kan - beyin bariyerini2fiziksel bütünlüğünü değişimler gösterir. Çok sayıda hastalık durumlarında bariyer bozulma, e.gile ilişkili olduğundan bu değerlidir., epilepsi, multipl skleroz, Alzheimer hastalığı ve travmatik beyin hasarı27,28,29, 30. Diğer grupları da protein ifade ve proteinler31,32,33,34taşıma faaliyetleri düzenleyen sinyal yolları ayırt etmek izole kılcal kullanılmıştır, 35,36,37. Son olarak, bu yöntem insan beyin kapiller yalıtım için optimize etmek devam etmiştir ve son zamanlarda, biz artan P-gp ifade insan kan - beyin bariyerini hastalarda, epilepsi nöbet ücretsiz kontrol bireylere38 karşılaştırıldığında ile gösterdi . Birlikte ele alındığında, bu gelişmeler izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu eğitim için çok yönlü bir model olarak hizmet verebilir göstermektedir.
Çeşitli içinde vivo, ex vivove in vitro kan - beyin bariyerini modelleri temel araştırma ve endüstriyel uyuşturucu tarama, esas olarak ilaç dağıtım beyin39,40,41 test amacı ile kullanılmıştır ,42,43,44. İzole ex vivo beyin kılcal yanı sıra, geçerli kan - beyin bariyerini modelleri dahil silico modelleri, vitro hücre kültürü izole beyin kapiller endotel hücreleri veya çeşitli ölümsüzleştirdi hücre satırlarından türler, vitro kültür insan pluripotent kök beyin kapiller endotel hücreleri ve mikrosıvısal modelleri bir yonga üzerinde içine hücre (hPSC).
Silico modelleri tahmin edilen emme, dağıtım, metabolizması ve atılımı (ADME) özellikleri dayalı ilaç adaylarının seçmek için ilaç geliştirme içinde en yaygın olarak kullanılır. Niceliksel yapısı-özelliği ilişki (QSPR) modelleri ve niceliksel yapısı-etkinlik ilişkisi (QSAR) modelleri gibi yöntemleri kütüphanelerin yüksek üretilen iş tarama beyin penetrasyon ilaç adaylarının tahmin etmek için kullanılan popüler yöntem vardır 45 , 46. bu modeller ekran moleküllere bariyer penetrasyonu özellikleri için yararlıdır.
Betz vd. 47 monolayers kültürlü beyin kapiller endotel hücrelerinin bir vitro kan - beyin bariyerini modeli kurulmuş. Vitro hücre kültür modelleri taze doku veya ölümsüzleştirdi endotel hücre hatları gibi insan beyin microvessel endotel hücreleri (hCMECs) kullanarak beyin penetrasyon veya mekanik çalışmaları için başka bir yüksek üretilen iş tarama aracı olabilir. Ancak, beyin kapiller endotel hücre kültür modelleri fizyolojik kesme stres kan akımı kapiller lümen içinde eksikliği, genel olarak biyolojik karmaşıklığı sınırlıdır ve değişiklikleri ifade ve yerelleştirme önemli bariyer bileşenlerinin meydana sıkı kavşak proteinler gibi yüzey reseptörlerinin, ışınlayıcılar, enzimler ve iyon kanalları48,49,50. Diğer taraftan, endotel monolayers hPSCs türetilmiş, hCMEC/D3 kültürlere göre düşük sükroz geçirgenliği var ve bazı kan - beyin bariyerini taşıyıcılar, adezyon molekülleri ve sıkı kavşak51, polarize ifade içeren 52. ancak, bu hücreler aynı zamanda kültür özellikleri değiştirme tabi, ve sistem içinde vivo bariyer özellikleri52onun tekrarlama için doğrulanması gerekir.
Kan - beyin bariyerini araştırma daha yeni eğilimler mikrosıvısal cihazlar üretmek için organ-on-chip teknolojisini kullanarak veya içi boş fiber teknolojisi53, kullanan yapay kılcal damarlar, oluşturmak için 3D doku kültürü sistemleri kullanan dahil 54 , 55. yapay kılcal damarlar, ancak, önemli ölçüde daha büyük çaplarda (100 – 200 µm) beyin kılcal damarlar (3-7 µm) daha vardır. Bu nedenle, kesme kuvvetleri vitro değil tamamen benzer vivo içinde durum. Bu "blood-brain-barrier-on-a-chip" mikrosıvısal cihazlar, Yapay membran formu "kan" ve "beyin" bölmeleri ve sıvıları mikrosıvısal kesme kuvvetleri bu cihazlar aracılığıyla nerede pompalanır ele olduğunu. Benzer şekilde, astrocytes ile çeşitli kombinasyonlarda endotel hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri ortak kültürleri de hollow fiber teknolojisi ile rheological parametreleri vivo içinde koşullar56 altında mevcut yeniden oluşturmak için kullanılmıştır , 57 , 58. ancak, ne kadar iyi bu modeli kan - beyin bariyerini taşıma, metabolizma, sinyal ve diğerleri gibi diğer özelliklerini yansıtır belli değildir. Bu yapay kılcal ve chip modelleri ilaçların yüksek üretilen iş tarama için uygundur, ancak bu modeller oluşturmak için kullanılan hücrelere de kültür sırasında değiştirilebilir.
Dondurulmuş ve sabit beyin dilimler veya birincil beyin kapiller endotel hücre kültürlerindeinsan microvasculature çalışma5,59,60,61için kullanılabilecek ek modellerdir. Örneğin, immünhistokimya sabit beyin dokusunun protein yerelleştirme belirlemek için kullanılır ve sağlıklı ifadede hastalıklı dokusu ile karşılaştırıldığında.
Dokusu dilimlerin ve vitro modelleri yanı sıra yukarıda açıklanan, taze izole beyin kılcal kan - beyin bariyerini işlev eğitim için yararlı olabilir. Bu izole kapiller modelin sınırlamaları içerir taze insan beyin dokusu, elde etmek için zorluk olmaması astrocytes ve nöronlar ve nispeten zaman alan ayırma işlemi. Bir avantajdır izole beyin kapiller modeli bu modeli çok benzeyen vivo içinde durum ve bu nedenle, bariyer fonksiyonu ve fonksiyon bozukluğu karakterize etmek için kullanılabilir. Önemlisi, bu da sinyal mekanizmalarını deneyleri ve moleküler teknikleri3,19,62,63çok sayıda kullanma ayırt için kullanılabilir.
Bizim Laboratuvar her iki taze ve donmuş insan beyin dokusu yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla erişebilir (IRB #B15-2602-M)64. Bu bağlamda, standart bir protokol otopsi izle, beyin içinde elde edilen < 4 h ve tüm yordamları uygun NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar65için. Bu benzersiz erişim insan beyin dokusu ile göz önüne alındığında, biz kurulan ve beyin kılcal sağlam, uygun insan beyin kılcal yüksek bir verim içinde sonuçları insan beyin dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş. Protein ifade ve etkinliğini belirlemek için iki ortak bitiş noktası ilgi vardır. Bu bağlamda, biz ve diğerleri ile izole beyin kapiller protein ifade ve aktivite düzeyleri kullanılabilir çeşitli deneyleri kurduk. Bu deneyleri Western blot, basit Western tahlil, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), zymography, taşıma faaliyet deneyleri, içerir ve Kapiler kaçak deneyleri. Bu deneyleri araştırmacılar bariyer fonksiyonu insan patolojik koşullarında değişimler çalışma, protein ifade ve etkinlik düzenleyen yolları belirlemek ve kan - beyin bariyerini ilişkili tedavisi için farmakolojik hedefleri belirlemek izin hastalıklar.
Alınan birlikte, taze izole beyin kılcal kan - beyin bariyerini sağlam ve tekrarlanabilir model olarak hizmet verebilir. Özellikle, bu model bir yelpazeye bariyer fonksiyonu çalışma için bitiş noktaları belirlemek için birçok farklı deneyleri ile kombine edilebilir.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Personal Protective Equipment (PPE)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>32916-636</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Disposable Protective Labcoats</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>470146-214</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended</td></tr><tr><td>Face Shield, disposable</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>19460102</td><td>PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended</td></tr><tr><td>Safety Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8 x 12</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>01-815-6</td><td></td></tr><tr><td>Versi Dry Bench Paper 18&quot; x 20&quot;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>14-206-32</td><td>to cover working areas</td></tr><tr><td>VWR Sharps Container Systems</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75800-272</td><td>for used scalpels</td></tr><tr><td>Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz.</td><td>UK Supply Center, Lexington, KY, USA</td><td>323775</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &amp;deg;C Refrigerator</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>13-986-148</td><td></td></tr><tr><td>Accume BASIC AB15 pH Meter</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>AB15</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph RZR 2102 Control</td><td>Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA</td><td>501-21024-01-3</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall LEGEND XTR Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>Leica L2 Dissecting Microscope</td><td>Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA</td><td></td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>POLYTRON PT2500 Homogenizer</td><td>Kinematica AG, Luzern, Switzerland</td><td>9158168</td><td></td></tr><tr><td>Scale P-403</td><td>Denver Instrument, Bohemia, NY, USA</td><td>0191392</td><td></td></tr><tr><td>Standard mini Stir</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>1151050</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar</td><td>Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA</td><td>11-670-4C</td><td>used to freeze the tissue?</td></tr><tr><td>Voyager Pro Analytical Balance</td><td>OHAUS, Parsippany, NJ, USA</td><td>VP214CN</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axiovert Microcope</td><td>Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA</td><td></td><td>used to check isolated capillaries</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools and Glassware&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 1-5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377823T1</td><td>wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>Finnpipette II Pipette 100-1,000 &amp;micro;L</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21377821T1</td><td>resuspend pellet in BSA</td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra, Hudson, NH, USA</td><td>739658</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes 25/rack - 500/cs</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>EISCO Scalpel Blades</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>S95938C</td><td>to mince brain tissue</td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>52858-000</td><td>to cover beaker and volumetric flask</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>21-377-304</td><td>to wash capillaries off filter</td></tr><tr><td>60 mL syringe with Luer-Lok</td><td>Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>BD309653</td><td>used with connector ring to filter capillaries</td></tr><tr><td>Scalpel Handle #4</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>10060-13</td><td>used for mincing</td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, USA</td><td>11251-10</td><td>used to remove meninges</td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem Tissue Grinder</td><td>Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA</td><td>3431E25</td><td>50 mL volume, clearance: 150-230 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Dounce Homogenizer</td><td>VWR, Radnor PA USA</td><td>62400-642</td><td>15 mL volume, clearance: 80-130 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>Spectra/Mesh Woven Filters (300 &amp;micro;m)</td><td>Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA</td><td>146424</td><td>Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left</td></tr><tr><td>pluriStrainers (pore size: 30 &amp;micro;m)</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>Connector Ring</td><td>pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany</td><td>41-50000-03</td><td>reuse multiple time</td></tr><tr><td>1 L Volumetric Flask</td><td></td><td></td><td>for preparation of Isolation Buffer</td></tr><tr><td>1 L Beaker</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA</td></tr><tr><td>Stir Bar</td><td></td><td></td><td>for preparation of 1% BSA and Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Schott Bottle (60 mL)</td><td></td><td></td><td>for preparation of Ficoll&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td>to keep everything cold</td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td></td><td></td><td>for mincing of brain tissue</td></tr><tr><td>Tissue Culture Cell Scraper</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>89260-222</td><td>to remove supernatant after centrifugation</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA Fraction V, A-9647</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>A9647-500g</td><td>prepare in DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.</td></tr><tr><td>DPBS with Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;amp; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Hyclone</td><td>SH30264.FS</td><td>DPBS - part of the Isolation Buffer</td></tr><tr><td>Ficoll PM400</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>F4375</td><td>Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.</td></tr><tr><td>Glucose (D-(+) Dextrose)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>G7528</td><td>Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Standard Solution</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>71474</td><td>to adjust pH of the DPBS</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>P2256</td><td>Concentration: 1 mM</td></tr></tbody></table>

isolation of cerebral capillaries from fresh human brain tissue

Anlayış kan - beyin bariyerini işlevi fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında beyin ilaç dağıtım geliştirmek için beyin korumasını geliştirmek ve beyin tedavi sözü tutun yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemlidir bozuklukları. Ancak, insan kan - beyin bariyerini işlev eğitim meydan okuyor. Böylece, uygun modelleri için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu bağlamda, beyin kılcal insan beyin dokusundan izole bariyer fonksiyonu olarak insan vivo içinde durum mümkün olduğunca yakın çalışma için eşsiz bir araç temsil eder. Burada, kılcal bir yüksek verimli ve tutarlı kalite ve saflık insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolü açıklar. Kılcal mekanik homojenizasyon, yoğunluğu-gradient Santrifüjü ve filtrasyon kullanma taze insan beyin dokusundan izole edilmiştir. Yalıtım sonra insan beyin kapiller protein ifade ve işlev, enzim aktivitesi veya hücre içi sinyal çalışmaya sızıntı deneyleri, canlı hücre görüntüleme ve bağışıklık tabanlı deneyleri gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. İzole insan beyin kılcal insan kan - beyin bariyerini işlevi Yönetmeliği aydınlatmak için benzersiz bir model vardır. Bu model CNS hastalıkları tedavisi için tedavi edici stratejiler geliştirilmesine yardımcı olacak merkezi sinir sistemi (MSS) patogenezinde kazandırabileceğini.

İnsan beyin dokusundan izolasyonların insan beyin kılcal (Şekil 1B) zenginleştirilmiş bir süspansiyon daha büyük gemiler, kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreleri ve bazı hücre artıkları küçük miktarlarda verim. Bazı kılcal dallı ve bazı, kırmızı kan hücreleri kılcal lümen entrapped. Tipik kılcal bir 3-7 µm çapı ve yaklaşık 100-200 µm uzun ile açık lümen; çoğu kapiller biter daraltılır. Confocal mikroskobu kulla...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue at JoVE.com

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

isolation-of-cerebral-capillaries-from-fresh-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Görüntüleme.  University of Kentucky. İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Purification of Mouse Brain Vessels

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and immune cells between the brain and the blood. Moreover, the huge neuronal metabolic demand requires a moment-to-moment regulation of blood flow. Notably, abnormalities of these regulations are etiological hallmarks of most brain pathologies; including glioblastoma, stroke, edema, epilepsy, degenerative diseases (ex: Parkinson&#8217;s disease, Alzheimer&#8217;s disease), brain tumors, as well as inflammatory conditions such as multiple sclerosis, meningitis and sepsis-induced brain dysfunctions. Thus, understanding the signaling events modulating the cerebrovascular physiology is a major challenge. Much insight into the cellular and molecular properties of the various cell types that compose the cerebrovascular system can be gained from primary culture or cell sorting from freshly dissociated brain tissue. However, properties such as cell polarity, morphology and intercellular relationships are not maintained in such preparations. The protocol that we describe here is designed to purify brain vessel fragments, whilst maintaining structural integrity. We show that isolated vessels consist of endothelial cells sealed by tight junctions that are surrounded by a continuous basal lamina. Pericytes, smooth muscle cells as well as the perivascular astrocyte endfeet membranes remain attached to the endothelial layer. Finally, we describe how to perform immunostaining experiments on purified brain vessels.

We describe a protocol allowing the purification of the mouse brain's vascular compartment. Isolated brain vessels include endothelial cells linked by tight junctions and surrounded by a continuous basal lamina, pericytes, vascular smooth muscle cells, as well as perivascular astroglial membranes.

Fare Beyin Gemiler saflaştırılması

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Nörobilim

Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance blood vessels branching out from pial arteries and arterioles and diving into the brain parenchyma. Individual PA perfuse a discrete cylindrical territory of the parenchyma and the neurons contained within. These arterioles are a central player in the regulation of cerebral blood flow both globally (cerebrovascular autoregulation) and locally (functional hyperemia). PAs are part of the neurovascular unit, a structure that matches regional blood flow to metabolic activity within the brain and also includes neurons, interneurons, and astrocytes. Perfusion through PAs is directly linked to the activity of neurons in that particular territory and increases in neuronal metabolism lead to an augmentation in local perfusion caused by dilation of the feed PA. Regulation of PAs differs from that of better-characterized pial arteries. Pressure-induced vasoconstriction is greater in PAs and vasodilatory mechanisms vary. In addition, PAs do not receive extrinsic innervation from perivascular nerves &#8212; innervation is intrinsic and indirect in nature through contact with astrocytic endfeet. Thus, data regarding contractile regulation accumulated by studies using pial arteries does not directly translate to understanding PA function. Further, it remains undetermined how pathological states, such as hypertension and diabetes, affect PA structure and reactivity. This knowledge gap is in part a consequence of the technical difficulties pertaining to PA isolation and cannulation. In this manuscript we present a protocol for isolation and cannulation of rodent PAs. Further, we show examples of experiments that can be performed with these arterioles, including agonist-induced constriction and myogenic reactivity. Although the focus of this manuscript is on PA cannulation and pressure myography, isolated PAs can also be used for biochemical, biophysical, molecular, and imaging studies.

This manuscript describes a simple and reproducible protocol for isolation of intracerebral arterioles (a group of blood vessels encompassing parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles) from mice, to be used in pressure myography, immunofluorescence, biochemistry, and molecular studies.

İzolasyon ve Serebral Parankimal arteriollerin kanülasyonu

Intracerebral parenchymal arterioles (PAs), which include parenchymal arterioles, penetrating arterioles and pre-capillary arterioles, are high resistance ...

Reliable Isolation of Central Nervous System Microvessels Across Five Vertebrate Groups

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often rodents. This approach limits the interrogation of blood-brain barrier (BBB) properties to the cortex and does not allow for individual comparison. This project focuses on the development of an isolation method that allows for the comparison of the neurovascular unit (NVU) from multiple CNS regions: cortex, cerebellum, optic lobe, hypothalamus, pituitary, brainstem, and spinal cord. Moreover, this protocol, originally developed for murine samples, was successfully adapted for use on CNS tissues from small and large vertebrate species from which we are also able to isolate microvessels from brain hemisphere white matter. This method, when paired with immunolabeling, allows for quantitation of protein expression and statistical comparison between individuals, tissue type, or treatment. We proved this applicability by evaluating changes in protein expression during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a murine model of a neuroinflammatory disease, multiple sclerosis. Additionally, microvessels isolated by this method could be used for downstream applications like qPCR, RNA-seq, and Western blot, among others. Even though this is not the first attempt to isolate CNS microvessels without the use of ultracentrifugation or enzymatic dissociation, it is unique in its adeptness for the comparison of single individuals and multiple CNS regions. Therefore, it allows for investigation of a range of differences that may otherwise remain obscure: CNS portions (cortex, cerebellum, optic lobe, brainstem, hypothalamus, pituitary, and spinal cord), CNS tissue type (gray or white matter), individuals, experimental treatment groups, and species.

The goal of this protocol is to isolate microvessels from multiple regions of the central nervous system of lissencephalic and gyrencephalic vertebrates.

Beş Omurgalı Grubu Arasında Merkezi Sinir Sistemi Mikrodamarlarının Güvenilir İzolasyon

Isolation of microvessels from the central nervous system (CNS) is commonly performed by combining cortical tissue from multiple animals, most often ...

Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte function is not fully known. Pericytes have been suggested to be involved in capillary development, regulation of endothelial barrier tightness and trancytosis activity, regulation of capillary tone and to play crucial roles in certain brain pathologies.
Pericytes are challenging to investigate in the intact brain due to the difficulties in visualizing processes in the brain parenchyma, as well as the close proximity to the other cells of the NVU. The present protocol describes a method for isolation and culture of primary bovine brain capillary pericytes and their following usage in calcium imaging studies, where effects of agonists involved in brain signaling and pathologies can be investigated. Cortical capillary fragments are allowed to attach to the bottom of culture flasks and, after 6 days, endothelial cells and pericytes have grown out from the capillary fragments. The endothelial cells are removed by gentle trypsinization and pericytes are cultured for 5 additional days before passaging.
Isolated pericytes are seeded in 96-well culture plates and loaded with the calcium indicator dye (Fura-2 acetoxymethyl (AM)) to allow for measurements of intracellular calcium levels in a plate reader setup. Alternatively, pericytes are seeded on coverslips and mounted in cell chambers. Following loading with the calcium indicator (Cal-520 AM), calcium live-imaging can be performed using confocal microscopy at an excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 510-520 nm.
The method described here has been used to obtain the first intracellular calcium measurements from primary brain capillary pericytes, demonstrating that pericytes are stimulated via ATP and are able to contract in vitro.

Brain capillary pericytes are essential players in the regulation of blood-brain barrier properties and blood flow. This protocol describes how brain capillary pericytes can be isolated, cultured, characterized with respect to cell type and applied for investigations of intracellular calcium signaling with fluorescent probes.

Sitosolik Kalsiyum Ölçümleri ve Kalsiyum Görüntüleme Çalışmaları için Beyin Kılcal Perisit Kültürü

Pericytes are associated with endothelial cells and astrocytic endfeet in a structure known as the neurovascular unit (NVU). Brain capillary pericyte ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...

Biyoloji

A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood brain barrier formation and physiology is now demonstrated but its molecular basis remains largely unknown. As the pathophysiological role of cerebral pericytes in neurological disorders is intriguing and of great importance, the in vitro models are not only sufficiently appropriate but also able to incorporate different techniques for these studies. Several methods have been proposed as in vitro models for the extraction of cerebral pericytes, although an antibiotic-free protocol with high output is desirable. Most importantly, a method that has increased output per extraction reduces the usage of more animals.
Here, we propose a simple and efficient method for extracting cerebral pericytes with sufficiently high output. The mouse brain tissue homogenate is mixed with a BSA-dextran solution for the separation of the tissue debris and microvascular pellet. We propose a three-step separation followed by filtration to obtain a microvessel rich filtrate. With this method, the quantity of microvascular fragments obtained from 10 mice is sufficient to seed 9 wells (9.6 cm2 each) of a 6-well plate. Most interestingly with this protocol, the user can obtain 27 pericyte rich wells (9.6 cm2 each) in passage 2. The purity of the pericyte cultures are confirmed with the expression of classical pericyte markers: NG2, PDGFR-&#946; and CD146. This method demonstrates an efficient and feasible in vitro tool for physiological and pathophysiological studies on pericytes.

We present a protocol for the extraction of murine cerebral pericytes. Based on an antibiotic-free enrichment oriented pericyte extraction, this protocol is a valuable tool for in vitro studies providing high purity and high yield, thus decreasing the number of experimental animals used.

Serebral Perisitleri Fareden Ayırmak Için Yüksek Çıkış Yöntemi

In recent years, cerebral pericytes have become the focus of extensive research in vascular biology and pathology. The importance of pericytes in blood ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Human Brain: An Optimized Method to Extract Cerebral Capillaries from Human Brain Tissue

Source: Hartz, A. M. S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/57346" target="_blank">Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of cerebral capillaries from a fresh human brain tissue. The isolated capillaries can then be used to generate an ex vivo blood brain barrier model.

Serebral Kılcal Damarların İnsan Beyninden İzolasyonu: İnsan Beyin Dokusundan Serebral Kılcal Damarları Çıkarmak İçin Optimize Edilmiş Bir Yöntem

Source: Hartz, A. M. S. et al. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (2018)
This video presents the isolation of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

Sinir Sistemi Kanserleri

Ex vivo çalışmalar

Isolation and Culture of Primary Brain Pericytes: A Procedure to Isolate and Culture Pericytes from Bovine Brain Capillaries Without Endothelial Cell Contamination

Source: H&#248;rlyck, S. et al. <a href="https://www.jove.com/video/61253" target="_blank">Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2020)
In this video, we demonstrate the procedure to isolate and culture pericytes from bovine brain capillaries without endothelial cell contamination.

Primer Beyin Perisitlerinin İzolasyonu ve Kültürü: Endotel Hücre Kontaminasyonu Olmadan Sığır Beyin Kılcal Damarlarından Perisitleri İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Source: H&#248;rlyck, S. et al. Culture of Brain Capillary Pericytes for Cytosolic Calcium Measurements and Calcium Imaging Studies.&#160;J. Vis. Exp. ...

İn vitro çalışmalar

Purifying Capillaries From a Porcine Brain

Source: Nielsen, S. S. E., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56277">Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the isolation of capillaries from fresh porcine brains. The process involves removing the meninges, isolating the grey matter from the brain tissue, homogenizing and filtering the grey matter to isolate the capillaries, and finally using enzymatic digestion to purify the capillaries further.

Domuz beyninden kılcal damarların temizlenmesi

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Purification of Porcine Brain ...

Nöronal Kültür Teknikleri

Gelişmiş Nöron Modelleri

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

Sıçan Beyninden Nörovasküler Ünitelerin İzolasyonuna Yönelik Bir Yöntem

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...